積雪草苷促進(jìn)ROCK/JNK通路介導(dǎo)的自噬減輕小鼠壓力負(fù)荷性心肌肥厚

王 偉，李 煒，韓 楊，張艷濤，張 杰，張曉東，劉治國(guó)(西安國(guó)際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院心血管內(nèi)科，西安 710100；通訊作者，E-mail:1446315412@qq.com)

病理性心肌肥厚是常見的心血管病理生理表現(xiàn)，存在于多種心血管疾病，具體機(jī)制尚不明確，緩解心肌細(xì)胞肥大、改善心肌肥厚可能成為肥厚型心肌病等多種心血管疾病治療的有效靶點(diǎn)[1-4]。研究表明，Rho/ROCK/JNK途徑調(diào)節(jié)多種關(guān)鍵細(xì)胞功能，可以介導(dǎo)細(xì)胞凋亡、增殖、分化等[5，6]。目前心肌肥厚的治療尚缺乏有效治療策略，積雪草苷(asiaticoside，ASI)具有較強(qiáng)的抗氧化應(yīng)激、抗炎作用的中藥提取物，可通過不同機(jī)制修復(fù)組織損傷[7-9]。本研究采用小鼠主動(dòng)脈縮窄(transverse aortic constriction，TAC)模型，探討ASI對(duì)心肌肥厚的改善作用以及對(duì)ROCK/JNK信號(hào)的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇6周齡健康雄性C57/BL小鼠100只，體質(zhì)量(20.5±1.1)g，購自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SYXK(陜)2019-001。自噬相關(guān)蛋白5(Atg5)、肌球蛋白樣Bcl-2結(jié)合蛋白(Beclin-1)、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3 Ⅱ/Ⅰ)、絲氨酸/蘇氨酸激酶(ROCK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體、積雪草苷(ASI)購于美國(guó)Sigma公司，ROCK抑制劑Y-33075購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide，ANP)試劑盒、腦鈉尿肽(brain natriuretic peptide，BNP)試劑盒、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor， CTGF)試劑盒購于美國(guó)R&D Systems公司。FV2000激光共聚焦顯微鏡購于日本奧林巴斯公司，小動(dòng)物超聲儀購于美國(guó)VisualSonics公司。

1.2 分組及TAC模型建立

所有100只C57/BL小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分4組：假手術(shù)組(sham組)、TAC組、ASI+TAC組、ASI+Y-33075(ROCK抑制劑)+TAC組，每組25只。各組以普通飼料喂養(yǎng)，TAC組、ASI+TAC組、ASI+Y-33075+TAC組以結(jié)扎小鼠主動(dòng)脈弓方式建立TAC模型。用2%異氟烷將小鼠麻醉好后，仰臥位將四肢固定在恒溫板上。在第二肋間縱向剪開皮膚，并逐層分離肌肉，暴露橫主動(dòng)脈弓，在無名動(dòng)脈和左頸動(dòng)脈之間預(yù)先穿一根7-0號(hào)絲線，用絲線將一根27號(hào)的針頭和血管結(jié)扎固定，然后將針頭取出并逐層縫合肌肉和皮膚。sham組小鼠暴露橫主動(dòng)脈弓并穿線但不結(jié)扎，其他操作和手術(shù)組相同。ASI給藥劑量為10 mg/(kg·d)，溶于0.9%氯化鈉溶液中。ASI+TAC組腹腔注射ASI[10 mg/(kg·d)]，ASI+Y-33075+TAC組同時(shí)給予腹腔注射ASI[10 mg/(kg·d)]以及Y-33075[10 mg/(kg·d)]，ASI+TAC組與ASI+Y-33075+TAC組自TAC模型建立第1天開始進(jìn)行ASI與Y-33075給藥，連續(xù)給藥30 d。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)小鼠血清ANP、BNP、CTGF水平

各組小鼠經(jīng)2%異氟烷麻醉后，固定小鼠，剪開并剝離小鼠頸部皮膚、皮下組織，暴露小鼠頸動(dòng)脈，以組織剪剪開快速取血2 ml至EP管中，3 000 r/min離心15 min，取上層清亮血清。按照ANP、BNP、CTGF檢測(cè)試劑盒說明書檢測(cè)。

1.4 心臟超聲檢測(cè)各組小鼠心功能

各組小鼠經(jīng)2%異氟烷麻醉后四肢固定于超聲儀電極，探頭在乳頭肌水平位置用M型取樣線檢測(cè)，測(cè)量并計(jì)算得出左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction， LVEF)，左心室短軸縮短率(left ventricular fraction shortening， LVFS)、左心室舒張期前壁厚度(left ventricular diastolic anterior wall dia-meter，LVAWd)左心室舒張末期容積(left ventricular end diastolic volume，LVEDV)等指標(biāo)。

1.5 HE、天狼星紅和Masson染色檢測(cè)各組小鼠心肌肥厚及纖維化程度

至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)，各小鼠經(jīng)2%異氟烷麻醉后迅速剪下心臟，冷PBS緩沖液沖洗3遍，洗凈殘余血細(xì)胞后，以多聚甲醛(40 g/L)固定72 h，石蠟包埋、切片，行HE、天狼星紅和Masson染色，其中HE染色主要觀察心肌組織結(jié)構(gòu)變化，天狼星紅和Masson染色主要觀察心肌組織纖維化，在光學(xué)顯微鏡下拍攝染色后的HE、天狼星紅、Masson圖像并保存，利用Image J軟件計(jì)算各組膠原纖維表達(dá)并分析各組心肌組織膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction， CVF)，CVF=膠原面積/總面積。染色后剩余蠟塊標(biāo)本永久保存，心臟及血液取材后其余組織收集后送實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心行無害化處理。

1.6 qPCR檢測(cè)各組小鼠心肌組織BNP、β-MHC、CTGF、Atg5的mRNA相對(duì)表達(dá)量

測(cè)定BNP、β-MHC、CTGF、Atg5的表達(dá)評(píng)估心肌組織肥厚、纖維化及自噬水平。用TRIzol試劑從組織中分離總RNA，逆轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)生成cDNA，用BIO-RAD分光光度法測(cè)定RNA和cDNA的濃度和純度，Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)引物并合成(上海吉?jiǎng)P基因有限公司)。在iQTM5 RT-PCR系統(tǒng)中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將上下游引物各稀釋成25 μmol/L，取等量混合備用。目的基因cDNA 6 μl，上下游引物混合液2 μl，ddH2O 2 μl，2×Buffer 10 μl。GAPDH: cDNA 3 μl，上下游引物混合液2 μl，ddH2O 5 μl，2×Buffer 10 μl。反應(yīng)條件均為:95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法對(duì)靶基因表達(dá)量進(jìn)行相對(duì)定量。各檢測(cè)基因引物序列由美國(guó)復(fù)能基因公司提供。

1.7 Western blot檢測(cè)心肌組織自噬相關(guān)蛋白Atg5、LC3 Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1的變化

各組小鼠心肌組織取相同質(zhì)量放入離心管中，加入預(yù)冷PBS，剪碎心肌組織，4 ℃ 3 000 r/min離心10 min，棄上清，沉淀中加入含蛋白酶抑制劑的RIPA強(qiáng)裂解液，冰上充分研磨并裂解30 min，4 ℃ 12 000g離心30 min，取上清；BCA法蛋白定量；電泳并用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，裁剪目的條帶，放入對(duì)應(yīng)ROCK(1 ∶1 000)、JNK(1 ∶1 000)、Atg5(1 ∶1 000)、LC3 Ⅱ/Ⅰ(1 ∶1 000)、Beclin 1(1 ∶1 000)和GAPDH抗體(1 ∶5 000)中，4 ℃搖床孵育過夜；TBST洗脫3次，5 min/次，將目的條帶放入山羊抗兔或抗鼠二抗(1 ∶5 000)中室溫?fù)u床孵育2 h，TBST洗脫3次，5 min/次，ECL化學(xué)發(fā)光液避光檢測(cè)，Image Lab統(tǒng)計(jì)灰度值。

1.8 免疫熒光染色檢測(cè)心肌組織自噬相關(guān)蛋白LC3 Ⅱ/Ⅰ水平

取小鼠左室前壁組織，石蠟包埋、切片、脫蠟、復(fù)水，用PBS緩沖溶液洗5次，每次3 min，Triton-X100(2 g/L)處理15 min，PBS液沖洗3次，每次3 min，山羊血清室溫封閉1.5 h，PBS液洗3次，每次3 min，每個(gè)切片加LC3 Ⅱ/Ⅰ抗體(1 ∶100)50 μl，4 ℃孵育15 h，PBS液洗5次，每次3 min，暗室內(nèi)每張切片加熒光二抗(1 ∶500)50 μl，PBS液洗5次(3 min/次)，避光條件下每張切片加DAPI溶液50 μl，PBS液洗5次，每次3 min，用熒光防淬滅液封片，采集圖像。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Y-33075能夠阻斷ASI對(duì)于TAC所致心臟功能障礙及心肌損傷的改善作用

與sham組比較，TAC組心臟功能明顯降低，LVEF、FS、LVEDV顯著減小，LVAWd明顯增加(均P<0.05)；與TAC組比較，ASI+TAC組心臟功能得到明顯改善，LVAWd明顯減少，LVEF、FS、LVEDV明顯增加(均P<0.05)；與ASI+TAC組相比，ASI+Y-33075+TAC組LVEF、FS、LVEDV明顯降低(P<0.05，見表1)。超聲結(jié)果表明，ASI可以改善TAC誘發(fā)的心臟功能障礙，Y-33075可阻斷ASI的心肌保護(hù)作用。

表1 各組小鼠超聲測(cè)量結(jié)果 (n=10)Table 1 Ultrasonic measurement results of mice in each group (n=10)

與sham組，TAC組血清中ANP、BNP、CTGF水平明顯增加(P<0.05，見表2)，心肌組織BNP、β-MHC、CTGF的mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.05)，Atg5的mRNA表達(dá)降低(P<0.05，見表3)；相對(duì)于TAC組相比，ASI+TAC組血清ANP、BNP、CTGF水平明顯降低(P<0.05)，心肌組織BNP、β-MHC、CTGF的mRNA表達(dá)減少(P<0.05)，Atg5的mRNA表達(dá)增加(P<0.05)；與ASI+TAC組比較，ASI+Y-33075+TAC組血清中ANP、BNP、CTGF水平顯著增加(P<0.05，見表2)，心肌組織BNP、β-MHC、CTGF的mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.05)，Atg5的mRNA表達(dá)降低(P<0.05，見表3)。

表2 各組小鼠血清ANP、BNP、CTGF水平比較 (n=10)Table 2 Comparison of serum ANP， BNP and CTGF levels of mice between groups (n=10)

表3 各組小鼠心肌組織BNP、MYH7、CTGF、Atg5的mRNA相對(duì)表達(dá)量 (n=8)Table 3 Relative mRNA expression of BNP， MYH7， CTGF and ATG5 in myocardial tissue of mice in each group (n=8)

2.2 Y-33075可阻斷ASI改善TAC小鼠心肌結(jié)構(gòu)改變

心肌組織HE、天狼星紅、Masson染色檢測(cè)各組小鼠心肌組織結(jié)構(gòu)、膠原含量及纖維化水平。sham組小鼠心肌組織纖維排列整齊，無纖維化，膠原含量低；TAC組可見細(xì)胞核多逸出，心肌結(jié)構(gòu)排列紊亂，肌纖維斷裂明顯，膠原含量高；與TAC組相比，ASI+TAC組肌纖維排列整齊，纖維化程度改善，膠原含量降低；與ASI+TAC組相比，ASI+Y-33075+TAC組心肌肥厚程度明顯增加，排列紊亂，膠原含量增高(見圖1)。

圖1 HE、天狼星紅、Masson染色檢測(cè)各組心肌肥厚及纖維化程度 (×400，n=5)Figure 1 Degree of myocardial hypertrophy and fibrosis in each group by HE， Sirius red and Masson staining (×400，n=5)

2.3 Y-33075可阻斷ASI促進(jìn)TAC小鼠心肌細(xì)胞自噬的作用

Western blot結(jié)果提示，與sham組比較，TAC組心肌組織中自噬相關(guān)蛋白R(shí)OCK、JNK、Atg5、Beclin 1、LC3 Ⅱ/Ⅰ表達(dá)水平降低(P<0.05)；與TAC組比較，ASI+TAC組心肌組織ROCK、JNK、Atg5、Beclin 1、LC3 Ⅱ/Ⅰ表達(dá)水平增高(P<0.05)；而與ASI+TAC組比較，ASI+Y-33075+TAC組心肌組織ROCK、JNK、Atg5、Beclin 1、LC3 Ⅱ/Ⅰ表達(dá)水平降低(P<0.05，見圖2)，提示ASI可以改善TAC所致心肌細(xì)胞自噬水平的降低，而Y-33075阻斷ASI的這一作用。

與sham組比較，*P<0.05；與TAC組比較，△P<0.05；與ASI+TAC組比較，#P<0.05圖2 Y-33075可阻斷ASI促進(jìn)TAC小鼠心肌細(xì)胞自噬的作用 (n=5)Figure 2 Y-33075 blockes the improving effect of ASI on cardiac autophagy of TAC mice (n=5)

2.4 Y-33075可阻斷ASI促進(jìn)TAC所致心肌細(xì)胞LC3 Ⅱ/Ⅰ的表達(dá)

心肌LC3-Ⅰ/Ⅱ免疫熒光染色結(jié)果顯示，與sham組相比，TAC組LC3 Ⅱ/Ⅰ蛋白免疫熒光染色數(shù)量明顯減少(P<0.05)；與TAC組相比，ASI+TAC組LC3 Ⅱ/Ⅰ蛋白染色的數(shù)量顯著增加(P<0.05)；與ASI+TAC組相比，ASI+Y-33075+TAC組LC3 Ⅱ/Ⅰ蛋白免疫熒光染色數(shù)量明顯減少(P<0.05，見圖3)，結(jié)果也提示ASI可以改善由TAC誘發(fā)的心肌自噬功能障礙，而Y-33075阻斷了ASI的這一作用。

圖3 Y-33075阻斷ASI促進(jìn)TAC所致心肌細(xì)胞LC3 Ⅱ/Ⅰ的表達(dá) (×400，n=5)Figure 3 Y-33075 blockes the improving effect of ASI on the expression of LC3 Ⅱ/Ⅰ (×400，n=5)

3 討論

病理性心肌肥厚是多種慢性心血管疾病進(jìn)展中的重要病理過程，由多種因素引起，可導(dǎo)致膠原纖維過度沉積，膠原濃度和體積分?jǐn)?shù)顯著增強(qiáng)，心肌膠原類型和結(jié)構(gòu)排列紊亂[10-13]。長(zhǎng)期的體液和機(jī)械刺激導(dǎo)致心臟首先發(fā)生代償性的心肌細(xì)胞肥大以維持正常泵血功能，然而持續(xù)性的心臟負(fù)荷最終脅迫心肌細(xì)胞肥大從代償性轉(zhuǎn)為失代償性，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞橫截面積增加和心室壁增厚，心室腔變小，心臟射血分?jǐn)?shù)下降，最終發(fā)展為心力衰竭。心肌細(xì)胞肥大的具體機(jī)制尚不清楚。因此，深入研究心肌細(xì)胞肥大的分子機(jī)制、以期為臨床心肌肥厚診治開發(fā)新靶點(diǎn)及策略是攻克這一臨床難題的重要研究方向。

以往研究表明，多種重要機(jī)制參與了病理性心肌肥厚的發(fā)展過程，其中包括炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、纖維化、細(xì)胞死亡等。近年來發(fā)現(xiàn)，自噬和泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是維持細(xì)胞中蛋白穩(wěn)態(tài)的重要途徑，隨著研究的不斷增多與深入，越來越多的研究表明自噬在心肌肥厚過程中起著重要作用[14-16]。自噬過程受損，影響內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物清除障礙，進(jìn)而引起細(xì)胞體積增加，可能是病理性心肌肥厚的發(fā)生機(jī)制之一。然而，自噬與心肌肥厚的相互作用機(jī)制尚不十分清楚，自噬的調(diào)節(jié)可能成為治療心肌肥厚的潛在策略。

Rho蛋白激酶(Rho protein kinase，ROCK)是絲氨酸蛋白激酶家族成員，RhoA是屬于Rho-GTPase家族的一種小GTPase蛋白。Rho相關(guān)螺旋蛋白激酶(Rho associated helical protein kinase，ROCK)是Rho A的下游效應(yīng)分子。Rho/ROCK途徑調(diào)節(jié)多種關(guān)鍵細(xì)胞功能，如基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞-細(xì)胞黏附、細(xì)胞周期、細(xì)胞死亡[5，6]，許多研究人員一直在探索該途徑作為治療靶點(diǎn)的潛力[17，18]。Rho/ROCK信號(hào)通路可以激活C-Jun氨基酸末端激酶(C-Jun amino acid terminal kinase，JNK)的信號(hào)通路，調(diào)節(jié)C-Jun的表達(dá)而調(diào)控細(xì)胞自噬。細(xì)胞自噬水平在心肌肥厚中起著關(guān)鍵作用。ROCK/.JNK已被證明具有自噬調(diào)控作用[19]。ROCK直接靶向JNK，ASI可能通過激活JNK在TAC模型中發(fā)揮保護(hù)作用。ASI的心臟保護(hù)作用部分是通過激活細(xì)胞自噬介導(dǎo)的。ASI本身具有抗氧化、抗炎等作用，然而，ASI對(duì)TAC所致心肌細(xì)胞自噬的調(diào)控作用有待進(jìn)一步研究。ROCK和JNK已被證明能促進(jìn)細(xì)胞存活通過多種途徑激活細(xì)胞自噬[19]。ASI可能通過激活ROCK/JNK信號(hào)通路TAC模型中發(fā)揮心肌保護(hù)作用。既往研究表明，ASI發(fā)揮保護(hù)作用可以通過調(diào)控自噬介導(dǎo)[20，21]。

本研究通過在體實(shí)驗(yàn)探討自噬與TAC所致小鼠心肌肥厚的關(guān)系，并闡明了ASI對(duì)TAC導(dǎo)致TAC心肌細(xì)胞自噬的保護(hù)機(jī)制，根據(jù)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)TAC與ROCK/JNK介導(dǎo)的自噬有關(guān)，同時(shí)，ASI可激活ROCK/JNK通路抑制細(xì)胞自噬。結(jié)果從一定從程度上闡明了TAC的作用機(jī)制并探索了ASI的保護(hù)作用，與以往研究結(jié)果一致[22]。

在TAC模型中，ROCK和JNK表達(dá)均下調(diào)，而ASI組ROCK和JNK表達(dá)恢復(fù)。Y-33075是ROCK的抑制劑，Y-33075處理后可通過阻斷ROCK減弱ASI對(duì)TAC的改善作用。因此，通過抑制ROCK/JNK通路，部分消除ASI對(duì)TAC所致TAC的心肌保護(hù)作用。Y-33075還可以部分消除ASI通過ROCK/JNK通路對(duì)細(xì)胞自噬的影響。綜上，本研究的結(jié)果表明ASI通過激活ROCK/JNK通路發(fā)揮保護(hù)作用。

有很多證據(jù)表明自噬在疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。然而，自噬在TAC或不同疾病的特定階段具體作用機(jī)制不明，自噬、TAC以及兩者之間的關(guān)系需要深入研究與進(jìn)一步探索。本研究闡明了ASI對(duì)TAC所致心肌細(xì)胞自噬的保護(hù)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)TAC與ROCK/JNK通路介導(dǎo)的自噬有關(guān)，同時(shí)ASI激活ROCK/JNK通路上調(diào)細(xì)胞自噬。這些結(jié)果佐證了TAC的機(jī)制，但仍需要細(xì)胞實(shí)驗(yàn)等更多證據(jù)進(jìn)一步證實(shí)。