超高壓提取鐵皮石斛多糖工藝優(yōu)化及其抗氧化活性分析

孟繼坤 張 楠 吳 浩 張秀清

(中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京 100083)

鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)又稱黑節(jié)草，是一種喜陰喜濕的多年生草本植物，屬于蘭科石斛屬，2021年被列為中國藥食同源食品之一，含有多糖、多酚、氨基酸、生物堿、維生素等多種活性成分，其中，多糖是鐵皮石斛的主要生理活性成分[1]，具有抗氧化[2]、免疫調節(jié)[3-4]、抗腫瘤[5]、降血脂和降血糖[6-7]等多種生理活性。

最傳統且適用范圍最廣的多糖提取方法為熱水浸提法[8]。目前，為提高鐵皮石斛多糖得率及其生物活性，可采用酶[9]、堿液[10]、低共熔溶劑[11]等化學生物方法輔助提取，也可采用超高壓[12]、超聲波[13]、微波[14]等物理方法，在不引入新物質的前提下促進石斛細胞內多糖溶出。其中，超高壓提取法是指常溫下將100～1 000 MPa的流體靜壓力作用于反應體系，使植物細胞內外產生較大的壓差，從而促進植物多糖轉移至提取溶劑中的方法，具有提取時間短、提取效率高、對有效成分結構破壞小等優(yōu)點[15-17]。

研究擬以多糖得率為基礎評價指標，通過正交試驗優(yōu)化超高壓提取鐵皮石斛多糖工藝條件，比較傳統熱水浸提法及超高壓提取法對鐵皮石斛多糖相對分子量及單糖組成的影響，并分析其體外抗氧化活性，以期為鐵皮石斛多糖的產品開發(fā)提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

鐵皮石斛：附樹方式生長，采自貴州省興義；

總抗氧化能力試劑盒：南京建成生物工程研究所；

無水乙醇、濃鹽酸、濃硫酸、磷酸、苯酚、葡萄糖、硫酸亞鐵：化學純，北京興津化工廠；

水楊酸：分析純，西隴化工股份有限公司；

氯化亞鐵、Ferrozine溶液、EDTA：分析純，上海源葉生物科技有限公司；

甘露糖、鼠李糖、核糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、阿拉伯糖、巖藻糖標準品：純度≥99%，美國Sigma公司；

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)：分析純，美國Sigma公司。

1.1.2 主要儀器設備

真空包裝機：JF-1616型，寧波歐邇有限公司；

超高壓系統：FB-110G5型，上海勵途超高壓設備有限公司；

高效液相色譜儀：Agilent1200型，配有示差檢測器和B.03.01色譜工作站，安捷倫科技有限公司；

液相色譜儀：島津LC-20AD型，日本Shimadzu有限公司；

冷凍干燥機：FD-2A型，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；

紫外分光光度計：TU-1810PU型，北京普析通用儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 鐵皮石斛原料預處理 參照《中華人民共和國藥典：2020年版》并略有改動[18]。將鐵皮石斛于60 ℃烘至恒重，粉碎，過60目篩，備用。

1.2.2 超高壓法提取鐵皮石斛多糖 準確稱取10 g粉末，加入去離子水，抽真空封口，混勻，一定操作壓力下進行超高壓處理，抽濾，收集提取液。取5 mL提取液用于多糖得率測定，其余溶液旋轉蒸發(fā)，加入4倍體積無水乙醇，4 ℃過夜醇沉，6 000 r/min離心10 min，收集沉淀烘干，得超高壓提取法鐵皮石斛粗多糖DOP-p。

1.2.3 熱水浸提法提取鐵皮石斛多糖 準確稱取鐵皮石斛粉末0.500 g，加入5 mL去離子水及20 mL無水乙醇。于150 W下超聲提取30 min，6 000 r/min離心10 min，收集沉淀。用10 mL 80%乙醇洗滌離心至上清無色，用水將沉淀轉移至圓底燒瓶，加入50 mL去離子水，沸水提取120 min。趁熱抽濾，旋轉蒸發(fā)，加入4倍體積無水乙醇過夜醇沉，離心，收集沉淀，烘干，得熱水浸提法鐵皮石斛粗多糖DOP-w。

1.2.4 多糖得率測定 采用苯酚—硫酸法[19]。以去離子水作空白對照，繪制葡萄糖標準曲線方程為y=8.256 4x-0.007 4，R2=0.999 6。

1.2.5 蛋白質含量測定 采用考馬斯亮藍法[20]。繪制蛋白質標準曲線為y=0.005x+0.009 3，R2=0.999 1。

1.2.6 酶法—化學法聯用脫蛋白 參照文獻[21]。

1.2.7 多糖相對分子量測定 采用GPC法[22]。繪制標準葡聚糖曲線方程為lgMw=-1.098 4t+13.66。

1.2.8 單糖組成分析 采用高效液相法[23]。

1.2.9 DPPH自由基清除能力測定 取500 μL質量濃度依次為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mg/mL的DOP-w和DOP-p多糖提取液，加入500 μL DPPH無水乙醇溶液(0.1 mg/mL)，振蕩混勻，黑暗中放置30 min。以蒸餾水為空白溶液，測定517 nm處吸光度，用維生素C溶液為對照，其質量濃度依次為0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mg/mL。并按式(1)計算DPPH自由基清除率。

(1)

式中：

CDPPH——DPPH自由基清除率，%；

A1——樣品測定吸光度值；

A2——樣品溶液本底的吸光度值；

A0——空白對照溶液的吸光度值。

1.2.10 Fe3+還原能力測定 取200 μL質量濃度依次為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mg/mL的DOP-w和DOP-p多糖提取液，加入500 μL磷酸鹽緩沖溶液(0.2 mol/L，pH 6.6)，加入500 μL 0.01 g/mL的鐵氰化鉀溶液，混勻，50 ℃水浴20 min，加入500 μL 0.1 g/mL三氯乙酸離心10 min，取上清液500 μL，依次加入500 μL去離子水和100 μL 0.001 g/mL三氯化鐵溶液，混勻，靜置10 min，測定700 nm處吸光度值。以去離子水代替三氯化鐵作為空白，用維生素C代替樣品溶液作對照。并按式(2)計算Fe3+還原力。

CFe3+=A1-A2，

(2)

式中：

CFe3+——Fe3+還原力；

A1——樣品吸光度值；

A2——空白對照溶液的吸光度值。

1.2.11 羥自由基清除能力測定 取500 μL不同質量濃度的多糖提取液，依次加入150 μL 2 mg/mL的硫酸亞鐵水溶液、500 μL 1%過氧化氫溶液及500 μL 1.5 mg/mL的水楊酸乙醇溶液后，振蕩混勻，37 ℃水浴1 h，測定526 nm 處吸光度值；以無水乙醇代替水楊酸乙醇溶液，測定樣品溶液本底的吸光度值；以去離子水代替樣品溶液，測定空白對照溶液的吸光度值，用維生素C代替樣品溶液作對照。并按式(3)計算羥自由基清除率。

(3)

式中：

COH——羥自由基清除率，%；

A1——樣品吸光度值；

A2——樣品溶液本底的吸光度值；

A0——空白對照溶液的吸光度值。

1.2.12 Fe2+螯合能力測定 取1 mL不同質量濃度的多糖提取液，加入3.7 mL去離子水，0.1 mL 2 mmol/L氯化亞鐵溶液，混勻，加入0.2 mL 5 mmol/L的Ferrozine溶液，室溫靜置10 min，測定562 nm處吸光值。以去離子水代替樣品溶液為空白對照，以去離子水代替氯化亞鐵溶液為校準管。用EDTA代替樣品溶液作對照，其質量濃度依次為0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mg/mL。并按式(4)計算Fe2+螯合能力。

(4)

式中：

CFe2+——Fe2+螯合能力，%；

A1——樣品吸光度值；

A2——空白對照溶液的吸光度值；

A0——校準管的吸光度值。

1.2.13 總抗氧化能力(T-AOC)測定 根據試劑盒說明書進行，并按式(5)計算總抗氧化能力。

(5)

式中：

U——總抗氧化能力，U/mL；

A1——樣品吸光度值；

A0——空白對照溶液的吸光度值。

1.3 數據處理

采用GraphPad Prism 8.0.2軟件進行數據統計分析及繪圖，結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 鐵皮石斛多糖的超高壓提取工藝優(yōu)化

考察超高壓壓力、保壓時間、料液比3個因素對鐵皮石斛多糖得率的影響。正交試驗因素水平見表1，正交試驗設計及結果見表2。

表1 超高壓正交試驗因素與水平表

由表2可知，各因素對DOP-p得率的影響依次為超高壓壓力>料液比>保壓時間，說明超高壓壓力的影響最大，保壓時間的影響最小，各因素在考察范圍內均影響顯著(P<0.05)。最優(yōu)方案為A1B2C3，即最佳提取條件為料液比1∶25(g/mL)，超高壓壓力200 MPa，保壓時間5 min。

表2 超高壓提取鐵皮石斛多糖正交試驗結果

2.2 兩種鐵皮石斛多糖基本性質比較

2.2.1 正交試驗驗證及基本性質比較 由表3可知，最佳提取條件下DOP-p得率為33.3%，殘渣復提得率為6.5%，綜合計算得經超高壓提取石斛粉總得率為39.8%，遠高于中國藥典所要求的25%。優(yōu)化后的超高壓提取方法在得率上相較于傳統熱水浸提法提高了128%，且提取時間更短，提取溫度更低。因此，超高壓提取可以有效提高鐵皮石斛多糖得率。此外，DOP-w的蛋白含量為4.6%，DOP-p的蛋白含量為3.5%，超高壓提取法相對傳統熱水浸提方法降低了鐵皮石斛多糖蛋白含量，可能是因為超高壓處理的溫度更低，處理條件相對更溫和，進入糖液中的蛋白質含量相對較低。

表3 兩種鐵皮石斛多糖工藝參數及得率對比

2.2.2 相對分子量比較 由圖1可知，熱水提取的多糖DOP-w和超高壓提取的多糖DOP-p均有3個峰，DOP-w的3個峰所對應的相對分子量分別為5.4×107，1.9×105，588.9 Da。DOP-p的3個峰所對應的相對分子量分別為3.2×105，1.5×104，527.9 Da，不同提取方式下鐵皮石斛多糖的相對分子量存在差異，DOP-p的相對分子量小于DOP-w。林平舟[24]發(fā)現，超高壓提取的荔枝多糖重均分子量顯著小于熱水提取法提取的，由3.20×105下降至1.9×105，可能是由于超高壓中強烈的機械剪切作用打斷了多糖的糖鏈[25]。

圖1 兩種鐵皮石斛多糖的相對分子量比較

2.2.3 單糖組成比較 由表4可知，鐵皮石斛多糖DOP-w和DOP-p為雜多糖，均含有甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和巖藻糖，DOP-w還含有一定量的N-乙酰-氨基葡萄糖。其中，鐵皮石斛多糖最主要的成分是甘露糖和葡萄糖，DOP-w的甘露糖和葡萄糖比例為1.06∶1，DOP-p的甘露糖和葡萄糖比例為1.71∶1，高于DOP-w。而甘露糖含量及其與葡萄糖的比例是石斛多糖生理活性的重要因素，國標[18]規(guī)定藥用石斛多糖甘露糖含量不得少于13%。超高壓提取的鐵皮石斛多糖含有更高的甘露糖可能是其具有更高抗氧化能力的因素之一。

表4 DOP-w和DOP-p的單糖組成

2.3 抗氧化能力

2.3.1 對DPPH自由基的清除能力 研究[26-28]表明，鐵皮石斛多糖在體內和體外均具有良好的抗氧化活性，但超高壓提取對其活性的影響尚不清晰。由圖2可知，兩種鐵皮石斛多糖溶液對DPPH自由基的清除能力均與質量濃度呈正相關，但同一質量濃度下的DOP-w和DOP-p對DPPH自由基的清除能力存在差異。維生素C對DPPH自由基的清除能力遠遠強于鐵皮石斛多糖，當質量濃度為0.04 mg/mL時，維生素C對DPPH自由基的清除率達90%，但當多糖溶液質量濃度為3 mg/mL時，DOP-w的清除率為39.7%，DOP-p的為53.1%，說明DOP-p對DPPH自由基的清除能力高于DOP-w。

圖2 兩種鐵皮石斛多糖對DPPH自由基清除能力的影響

2.3.2 對Fe3+的還原能力 由圖3可知，DOP-w、DOP-p對Fe3+的還原力均隨樣品溶液質量濃度的升高而增強，呈明顯的劑量效應。當質量濃度為3 mg/mL時，DOP-p對Fe3+的還原能力為0.15，高于DOP-w的0.14，但其差距在各質量濃度下均不明顯，說明兩種方法提取的鐵皮石斛多糖對Fe3+的還原能力差異較小。

圖3 兩種鐵皮石斛多糖對Fe3+的還原能力

2.3.3 對羥自由基清除能力的比較 由圖4可知，DOP-w在各質量濃度下對羥自由基的清除能力均高于DOP-w。當質量濃度為3 mg/mL時，DOP-w對羥基自由基的清除率為10.0%，DOP-p的清除率為14.2%。

圖4 兩種鐵皮石斛多糖對羥自由基清除能力的比較

2.3.4 對Fe2+螯合能力的比較 由圖5可知，兩種鐵皮石斛多糖對Fe2+的螯合能力均與質量濃度呈正相關，存在明顯的劑量效應，但同一質量濃度下，DOP-w和DOP-p對Fe2+的螯合能力存在差異。EDTA對Fe2+的螯合能力遠遠強于鐵皮石斛多糖，當質量濃度為0.1 mg/mL時，EDTA對Fe2+的螯合率達87%，而DOP-w在質量濃度為3 mg/mL時的螯合率為56.2%，DOP-p的為60.8%，兩種多糖對Fe2+的螯合率差異較小，但總體來說，螯合能力大小為DOP-p>DOP-w。

圖5 兩種鐵皮石斛多糖對Fe2+的螯合能力

2.3.5 總抗氧化能力(T-AOC)比較 由圖6可知，DOP-w和DOP-p對Fe3+的還原力均隨樣品質量濃度的升高而增強，呈明顯的劑量—作用關系。且DOP-p在各質量濃度下的總抗氧化能力均高于DOP-w，說明超高壓提取的鐵皮石斛多糖的總抗氧化能力強于熱水提取法提取的，與Luo等[29]的結果基本一致。

圖6 兩種鐵皮石斛多糖的總抗氧化能力比較

3 結論

采用正交試驗優(yōu)化了超高壓技術提取鐵皮石斛多糖的工藝條件，比較了傳統熱水浸提法、超高壓法兩種提取方法下的鐵皮石斛多糖的相對分子量及單糖組成，并分析了兩種鐵皮石斛多糖的體外抗氧化活性。結果表明，超高壓技術可以顯著提高鐵皮石斛干粉的多糖得率。優(yōu)化后的超高壓提取鐵皮石斛多糖的工藝條件為超高壓壓力200 MPa，料液比1∶25(g/mL)，保壓時間5 min，此條件下鐵皮石斛多糖得率為33.3%，比傳統熱水浸提法下的提高了128%。兩種提取方法下鐵皮石斛多糖的性質不同，超高壓法提取的多糖蛋白含量和相對分子量下降，甘露糖含量提高。相較于傳統的熱水浸提法，超高壓提取可以有效提高鐵皮石斛多糖的體外抗氧化活性。兩種鐵皮石斛多糖對DPPH自由基、羥自由基均具有一定的清除能力，對Fe3+有一定的還原力，對Fe2+有一定的螯合能力，兩種多糖的體外抗氧化能力為高壓提取法鐵皮石斛粗多糖 > 熱水浸提法鐵皮石斛粗多糖，且均與多糖濃度呈正相關，量效關系明顯。但提取方法究竟如何影響多糖的結構和抗氧化活性尚未完全明晰，后續(xù)可對多糖精細結構及糖鏈結構進行研究。