基于HS-SPME-GC-O-MS和E-nose解析不同熱加工方式下西瓜籽特征性香氣差異

張茹茹 余雄偉 歐陽輝 彭 武 徐瑋鍵 付琴利 李述剛

(1.合肥工業(yè)大學食品與生物工程學院，安徽 合肥 230009；2.武漢旭東食品有限公司，湖北 武漢 430000)

風味是目前堅果行業(yè)的一個熱點研究領(lǐng)域。堅果風味易受品種、產(chǎn)地、貯運條件、加工方式等因素影響。熱處理被認為是堅果提香加工的有效手段，然而大量的研究發(fā)現(xiàn)不同熱加工方式提香效果不同，如微波在山茶籽油[1]、腰果[2]中有較好的提香效果，烘烤使得小豆、豌豆風味發(fā)生了很大變化[3]，而空氣油炸原理為熱風干燥，即通過加熱絲加熱空氣，在內(nèi)部形成高速循環(huán)熱流以達到高溫干燥或烘烤的效果[4]。西瓜籽因其天然風味寡淡在生產(chǎn)加工過程中關(guān)注度較低，目前對西瓜籽的研究多集中在蛋白質(zhì)和油脂的提取優(yōu)化及功能特性上[5-6]，而就熱加工對其風味變化的研究更少。因此，為提升西瓜籽產(chǎn)品風味，探究不同熱加工方式下西瓜籽風味變化差異，構(gòu)建一種新型的產(chǎn)品香氣提升技術(shù)手段對休閑西瓜籽產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要的指導意義。

目前國內(nèi)外對于揮發(fā)性化合物的提取方法主要包括超臨界流體萃取、固相微萃取、頂空吸附等[7]，頂空固相微萃取—氣相色譜—嗅聞—質(zhì)譜技術(shù)(HS-SPME-GC-O-MS)因準確性、高分離性和物質(zhì)鑒定的優(yōu)越性而被廣泛應用于食品中揮發(fā)性成分的檢測[8-9]；電子鼻(E-nose)作為一種氣味檢測技術(shù)，通過模仿人類的嗅覺系統(tǒng)，對食品的新鮮度進行快速和較低成本的感官信息分析[10]。近年來，多種技術(shù)相結(jié)合對食品中揮發(fā)性化合物進行研究已經(jīng)成為熱門話題。Dou等[11]通過HS-SPME-GC-MS結(jié)合E-nose對3月和9月收獲的巴西和廣粉1號香蕉果實揮發(fā)性成分進行研究，發(fā)現(xiàn)3月收獲的香蕉醛類物質(zhì)含量更高導致香蕉香氣更明顯。Zhang等[12]通過化學計量技術(shù)結(jié)合HS-SPME-GC-MS對熱風干燥后的咖啡豆進行了揮發(fā)性化合物分析，發(fā)現(xiàn)苯甲醛、D-檸檬烯、苯乙烯等物質(zhì)在干燥過程中含量較高；并通過E-nose對不同干燥時間處理下的咖啡豆進行了區(qū)分。

研究擬以中國新疆維吾爾自治區(qū)產(chǎn)的西瓜籽為研究對象，借助HS-SPME-GC-O-MS和E-nose等技術(shù)手段，對比分析空氣油炸、微波和烘烤3種熱加工方式對西瓜籽特征性香氣影響，通過聚類與相關(guān)性分析明確其特征性香氣成分，旨在為西瓜籽加工提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西瓜籽仁：市售；

環(huán)己酮：HPLC級，美國Sigma-Aldrich公司；

微波爐：M1-L213C型，廣東省美的集團有限公司；

空氣炸鍋：KL26-VF171型，山東省九陽股份有限公司；

烤箱：X3U型，廣東省格蘭仕集團有限公司；

恒溫水浴鍋：HH-8型，常州億通分析儀器制造有限公司；

電子天平：CP114型，奧豪斯儀器有限公司；

氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀：Agilent5975C型，美國Agilent公司；

固相微萃取手動進樣器、固相微萃取纖維：50/30 μm CAR/PDMS/DVB型，美國Supelco公司；

電子鼻：PEN3.5型，德國Airsense公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品熱處理 參照Lemarcq等[13]的方法，略微修改：① 將西瓜籽仁(100 g)在微波爐中700 W處理3 min(MV)；② 將西瓜籽仁(100 g)在空氣炸鍋中160 ℃處理5 min(AO)；③ 將西瓜籽仁(100 g)在烤箱中150 ℃處理7 min(RT)。樣品處理后，冷卻至室溫，以未經(jīng)處理的西瓜籽仁(CK)作為對照組，使用前在-20 ℃保存，最多放置7 d。

1.2.2 氣相色譜—質(zhì)譜分析

(1)頂空固相微萃取條件：準確稱取2.0 g研磨好的西瓜籽樣品于20 mL頂空進樣瓶中，向樣品中加入5 μL內(nèi)標物(環(huán)己酮，18.94 μg/μL)后迅速密封。樣品在50 ℃水浴條件下平衡20 min后，插入老化30 min后的萃取頭，在50 ℃條件下萃取20 min，萃取結(jié)束后在GC-MS進樣口(250 ℃)以不分流模式解析5 min。

(2)色譜條件：色譜柱為DB-WAX毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；升溫程序為起始溫度40 ℃，以5 ℃/min 升溫至200 ℃，保持2 min，再以5 ℃/min升溫至230 ℃，并保持2 min；載氣(He)流速1.0 mL/min；進樣口溫度為250 ℃，進樣方式設置為不分流模式。

(3)質(zhì)譜條件：電子轟擊(EI)離子源；電子能量70 eV；四極桿溫度150 ℃，離子源溫度230 ℃，質(zhì)量掃描范圍為40～450(m/z)。

(4)定性方法：正構(gòu)烷烴混合物單獨進樣，進樣量5 μL，升溫程序和GC-MS 檢測條件一致，分離出的未知物與NIST 14.0譜庫進行檢索，并與標準品的保留指數(shù)(RI)值進行對比。按式(1)計算化合物保留指數(shù)。

(1)

式中：

RI,i——保留指數(shù)；

n——碳原子的個數(shù)；

Ti——待測組分的調(diào)整保留時間，min；

Tn——具有n個碳原子的正構(gòu)烷烴調(diào)整保留時間，min；

Tn+1——具有n+1個碳原子的正構(gòu)烷烴調(diào)整保留時間，min。

(5)定量方法：使用內(nèi)標法定量，環(huán)己酮(18.94 ng/mL)為內(nèi)標物，并根據(jù)內(nèi)標的質(zhì)量濃度計算樣品中揮發(fā)性化合物的質(zhì)量濃度，定量公式：

(2)

式中：

Cx,i——樣品中揮發(fā)性化合物質(zhì)量濃度，ng/mL；

Ci——內(nèi)標物質(zhì)量濃度，ng/mL；

Ax——樣品中揮發(fā)性化合物的峰面積；

Ai——內(nèi)標物的峰面積。

1.2.3 電子鼻分析 參照Hong等[14]的方法并修改。使用電子鼻對西瓜籽樣品進行揮發(fā)性化合物分析，該分析儀器由10個傳感器組成，其類型及性能描述詳見表1。電子鼻條件：準確稱取2.0 g研磨好的西瓜籽樣品置于20 mL 頂空瓶中，加蓋密封后在60 ℃水浴條件下平衡15 min，同時收集樣品中的揮發(fā)物。測量階段持續(xù)90 s，足以讓傳感器達到穩(wěn)定的信號值。傳感器清洗時間為100 s，載氣流速為400 mL/min。

表1 PEN3.5電子鼻中各個傳感器的響應類型

1.2.4 氣味活度值(OAV)的計算 按式(3)計算從西瓜籽樣品中獲得的所有氣味劑的OAV，即每種化合物的濃度(由HS-SPME-GC-O-MS定量分析獲得)與水中相對應的氣味閾值的比率[15]。

(3)

式中：

OAV,i——氣味活度值；

Ci——揮發(fā)性化合物質(zhì)量濃度，ng/mL；

Ti——化合物氣味閾值，mg/kg。

1.2.5 感官分析 選取6名感官敏銳的成員(3名女性和3名男性，年齡20～30歲)對4種樣品進行感官評估。選取6個芳香屬性來評估4種樣品的香氣特征，即清香、果香、焦香、油脂香、烤堅果香、綠色，并使用以下評分標準評估6種不同氣味的強度：1(極弱)，3(弱)，5(中)，7(強)，9(非常強)[16]。不同小組成員對每個樣品進行3次評估，數(shù)據(jù)表示為平均值。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 試驗均重復3次，結(jié)果以平均值和標準差表示。使用方差分析(AVOVA)分析統(tǒng)計差異，顯著性水平為0.05，確定不同熱處理方式下的明顯差異；使用統(tǒng)計SPSS軟件(v17.0，SPSSInc.，Chicago，IL，USA)分析；使用在線工具Metabo Analyst 5.0(https://www.metaboanalyst.ca/)進行主成分分析(PCA)；聚類熱圖和雷達圖分別由TBTools1.098軟件和Origin8軟件(OriginLab Inc.，USA)進行繪制；使用 Unscrambler 10.4(CAMOASA，Oslo，Norway)進行偏最小二乘回歸(PLSR)分析西瓜籽樣品、感官屬性和關(guān)鍵香氣化合物之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 西瓜籽樣品的香氣成分分析

堅果中的特征性風味主要來源于揮發(fā)性化合物，西瓜籽本身帶有的清香以及熱加工后特有的堅果風味已經(jīng)成為消費者選擇的主要影響因素。由表2可知，研究共檢測出115種揮發(fā)性化合物，其中CK 37種、AO 58種、MV 63種和RT 44種，具體包含醇類27種，吡嗪類16種，烯烴類12種，醛類和酮類各10種，酯類、烷烴類和苯環(huán)類各8種，吡啶類3種，呋喃類和吡咯類各2種，醚類、酚類、咔唑類、吡唑類、噠嗪類和噻唑類各1種以及其他類揮發(fā)性化合物3種，詳細信息見表2。

表2 加工方式對西瓜籽樣品揮發(fā)性化合物含量的影響

如圖1所示，熱加工方式對西瓜籽風味影響顯著(P<0.05)。其揮發(fā)性化合物峰面積大小依次為MV>AO>RT>CK，說明熱加工方式對西瓜籽具有不同的提香效果，其中MV的提香效果最佳。各處理組中醇類物質(zhì)變化顯著(P<0.05)，CK、AO、MV、RT 4組樣品中醇類物質(zhì)含量分別占揮發(fā)性物質(zhì)總量的40.3%，22.5%，9.3%，41.9%，為西瓜籽提供濃郁的水果清香[12]；相比于CK組，各處理組中均檢測到較高含量的己醛，分別占AO、MV、RT的揮發(fā)性物質(zhì)總量的13.7%，5.4%，2.0%，為產(chǎn)品提供清香、果香、木香[17]；D-檸檬烯作為典型的烯烴類化合物在CK、AO、MV、RT中均被檢測到，其含量分別占揮發(fā)性物質(zhì)總量的11.5%，4.5%，5.0%，8.3%，為西瓜籽提供柑橘、薄荷香氣[18]；據(jù)報道[16-20]，吡嗪類化合物是高溫處理下美拉德反應的特定產(chǎn)物，為食品提供了獨特的烘烤、堅果、焦香和爆米花樣香氣，在AO、MV、RT樣品中分別檢測出9，14，3種吡嗪類化合物，分別占揮發(fā)性物質(zhì)總量的28.4%，53.3%，9.6%；其中4組樣品中2,5-二甲基吡嗪含量最高，分別占總揮發(fā)性物質(zhì)的17.2%，23.3%，6.2%，為西瓜籽提供可可、烤堅果、烤肉等香氣[20]。

圖1 不同熱加工方式下西瓜籽揮發(fā)性化合物的相對峰面積和峰面積

綜上所述，熱加工方式對西瓜籽特征香氣影響顯著，CK樣品組中以醇類、烯烴類化合物為主，AO、MV中則以醛類、吡嗪類化合物為主，而RT中則以醇類、吡嗪類化合物為主。相比于空氣油炸與烘烤，微波處理下樣品香氣最為濃郁，其中2,5-二甲基吡嗪含量高達23.3%，使西瓜籽呈現(xiàn)典型的烤堅果香。

2.2 氣味活度值(OAV)分析

OAV用于評估香氣化合物對于堅果氣味的貢獻，一般認為OAV>1的化合物對樣品特征香氣具有積極作用[21]。4組樣品中，共檢出45種OAV>1的化合物，為更加直觀了解這些化合物在西瓜籽整體風味中的作用，將其進行熱圖分析。如圖2所示，CK、AO、MV、RT 4組樣品中OAV>1的化合物分別有17，24，23，21種。CK中D-檸檬烯、正己醇、草蒿腦的OAV值較高，為西瓜籽提供柑橘、薄荷、甘草香；AO中D-檸檬烯、己醛的OAV值較高，為西瓜籽提供柑橘、脂肪、杏仁香；MV中2-乙基-5-甲基吡嗪、己醛的OAV值較高，為西瓜籽提供可可、烤牛肉以及明顯的烤堅果風味；RT中正己醇、己醛的OAV值較高，為西瓜籽提供青草、脂肪香。

圖2 不同熱加工處理下西瓜籽樣品中揮發(fā)性化合物(OAV>1)的熱圖

經(jīng)過熱加工西瓜籽整體香氣由淺淡的清香向明顯的烤堅果香轉(zhuǎn)變，可能是由于低揮發(fā)性的醇類等物質(zhì)在熱加工后損失，而高溫處理后美拉德反應產(chǎn)生的醛類和吡嗪類化合物顯著增加導致的風味變化[1]。其中MV組樣品具有最為明顯的烤堅果香，表明微波處理是3種熱加工方式中最佳的西瓜籽提香方式，與GC-MS分析結(jié)果相符。

2.3 感官評價

如圖3所示，CK的香氣特征主要為清香、果香、綠色，而3種熱加工樣品主要集中在焦香、油脂香、烤堅果香，其中AO的整體香氣略弱于MV和RT組。MV、RT兩組樣品整體風味最為接近，但RT組可能由于樣品焦香味太重，覆蓋了部分烤堅果香味，整體來說風味略低。MV組樣品的烤堅果香味在4組樣品中最強，對西瓜籽樣品整體香氣起到了最大貢獻?？傮w而言，4種西瓜籽樣品之間的感官差異明顯，表明西瓜籽的香氣特性在熱加工后會發(fā)生顯著變化，且微波處理對西瓜籽的提香效果最好，與GC-MS分析結(jié)果一致。

圖3 不同熱加工處理下西瓜籽樣品的香氣分布差異圖

2.4 電子鼻分析

研究通過電子鼻對西瓜籽4種樣品進行了香氣特征評估，并將69～71 s的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成雷達圖，見圖4。對于CK樣品，在傳感器W1W、W5S、W2W處給出了較強的響應。與CK相比，AO、MV、RT整體風味的輪廓相似，但W1W響應更強，W1S響應減弱。3種熱加工方式相對比，RT在W1W、W2W、W5S傳感器中提供了較強的響應值，此外，在整個檢測過程中，RT樣品的響應值較高，而AO樣品中傳感器的響應值較低。這些結(jié)果表明，未處理與熱加工后的西瓜籽樣品之間存在顯著差異，且不同熱加工方式之間存在差異。

圖4 不同處理下西瓜籽樣品的雷達圖

對電子鼻的數(shù)據(jù)進行了PCA分析，結(jié)果表明，第一方差占比50.20%，第二方差占比37.78%，總方差為87.98%，大于85%，表明該PCA圖可以很好地解釋大部分數(shù)據(jù)。如圖5所示，生西瓜籽的數(shù)據(jù)主要在左下象限處檢測到，與3種熱處理的西瓜籽樣品明顯分開，說明熱處理明顯改變了西瓜籽的揮發(fā)性化合物。AO與MV樣品距離較近，主要是與兩種加工方式下西瓜籽樣品風味都具有較為明顯的烤堅果香相關(guān)，這與OAV值的分析相對應。RT組數(shù)據(jù)主要在右側(cè)檢測到，與其余3組相距較遠，與GC-MS中得到的結(jié)果相對應。由此可知，電子鼻的PCA能夠較好地表征西瓜籽樣品，并且能夠有效地區(qū)分不同熱加工方式下的西瓜籽樣品之間的風味差異。

圖5 不同熱加工處理下西瓜籽樣品電子鼻的PCA分析

2.5 西瓜籽樣品主要芳香化合物與感官屬性之間的相關(guān)性分析

采用偏最小二乘回歸(PLSR)法確認從4種樣品中鑒定出來的主要芳香化合物與感官屬性之間的相關(guān)性。根據(jù)每組樣品中檢測到的化合物峰面積，分別選取5種實際峰面積最大的化合物作為主要的揮發(fā)性成分，共13種化合物，分別為D-檸檬烯、正己醇、環(huán)己醇、2,6-二羥基苯乙酮、草蒿腦、戊醛、己醛、1-戊醇、2,5-二甲基-吡嗪、甲基吡嗪、2-乙基-5-甲基-吡嗪、三甲基吡嗪、2-乙基環(huán)丁酮。如圖6所示，PLSR解釋了88%的X-方差(11種主要芳香化合物)與84%的Y-方差(6個感官屬性)，內(nèi)外兩個橢圓分別顯示了解釋方差的50%與100%。所有的方差都被放置于兩個橢圓中，表明其可以很好地被PLSR模型解釋。

圖6中，“油脂香”“烤堅果香”“焦香”屬性與吡嗪類化合物、醛類化合物以及D-檸檬烯呈正相關(guān)關(guān)系，“清香”“果香”“綠色”屬性與環(huán)己醇及草蒿腦呈正相關(guān)關(guān)系。然而，正己醇以及1-戊醇與任何感官屬性的相關(guān)性較弱。這些結(jié)果與感官評估及GC-MS分析相對應?！翱緢怨恪薄坝椭恪睂傩允艿竭拎侯悡]發(fā)性化合物的強烈影響；“烤堅果香”“焦香”屬性與己醛、戊醛相關(guān)性較高，與Lin等[22]對松子的研究相似。

圖6 不同熱加工處理下西瓜籽樣品的感官屬性與主要芳香化合物在PLSR上的載荷分布

3 結(jié)論

利用電子鼻和頂空固相微萃取—氣相色譜—嗅聞—質(zhì)譜技術(shù)對不同熱加工處理的西瓜籽芳香特征和關(guān)鍵芳香化合物進行了分析。結(jié)果顯示，4組西瓜籽的揮發(fā)性化合物有明顯不同，且主成分分析與電子鼻相結(jié)合，在西瓜籽樣品中顯示出良好的鑒別力；相比較而言，微波處理比空氣油炸和烘制加工對西瓜籽風味提升更為明顯，其中2,5-二甲基吡嗪、甲基吡嗪和三甲基吡嗪等吡嗪類揮發(fā)性化合物為整體風味做出了重大貢獻。研究系統(tǒng)分析了不同熱加工方式對西瓜籽揮發(fā)性成分的變化及特征性香氣的影響，表明熱加工方式對西瓜籽特征香氣影響顯著，這對提升西瓜籽產(chǎn)品品質(zhì)有著重要作用。熱加工方式能夠促進西瓜籽風味物質(zhì)的形成，關(guān)于其醛類、醇類、吡嗪類等風味物質(zhì)的代謝途徑和影響機制仍有待進一步研究。