丙氨酸制備研究進(jìn)展

陸捷，王國棟，王瑞明,2，汪俊卿,2*

1(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)，生物工程學(xué)部，山東 濟(jì)南，250353) 2(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)，生物基材料與綠色造紙國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南，250353)

丙氨酸，又名氨基丙酸，其化學(xué)式為C3H7NO2，分子質(zhì)量為89.09，呈白色結(jié)晶粉末狀，無毒無臭，在水中易溶，在乙醇中微溶，在乙醚和丙醇中不溶，熔點(diǎn)為297 ℃，密度為1.432 g/cm3[1-2]，化學(xué)性能穩(wěn)定。丙氨酸分子內(nèi)包括羧基、氨基，是組成人體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的一類中性氨基酸。丙氨酸有2種同分異構(gòu)體，分別為α型和β型，其中α型丙氨酸分子又存在L型、D型立體鏡像[3]，DL-丙氨酸為α-丙氨酸的外消旋體。丙氨酸具有重要的生理學(xué)功能，如參與糖代謝活動(dòng)，它在轉(zhuǎn)氨反應(yīng)中提供氨基，并參與體內(nèi)的代謝循環(huán)，將氨基酸轉(zhuǎn)化為糖原?；瘜W(xué)法是生產(chǎn)丙氨酸的傳統(tǒng)方法。然而，丙氨酸生產(chǎn)的化工流程溫度高、壓力大、酸堿強(qiáng)，環(huán)境污染嚴(yán)重。因此，工業(yè)化生產(chǎn)丙氨酸采用發(fā)酵法和微生物酶法代替了原有的化學(xué)合成法。根據(jù)目前丙氨酸的國際市場調(diào)查，丙氨酸產(chǎn)業(yè)在世界分布廣泛，以美國、歐洲、中國為主，我國是最大的生產(chǎn)國，我國境內(nèi)丙氨酸公司主要生產(chǎn)L-丙氨酸、D-丙氨酸和DL-丙氨酸，盡管β-丙氨酸等占比較低，但發(fā)展環(huán)境較穩(wěn)定，對該領(lǐng)域的需求也在不斷增長，在未來市場非常有發(fā)展前景。

1 丙氨酸的應(yīng)用

1.1 丙氨酸在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用

在食品領(lǐng)域，丙氨酸是一種兼具甜味與鮮味的氨基酸，是天然的食品添加劑，是我國許可使用的9種增味劑之一[4]，可緩和酸辣苦澀等味道，柔和食品口感，提高食物營養(yǎng)價(jià)值，也能用于飲料中，既可以補(bǔ)充氨基酸的含量，也可以利用丙氨酸的堿性來降低酸度，從而調(diào)節(jié)飲料的口感。郭媛等[5]研究表明，在日常飲食中加入適量的L-丙氨酸可以讓人們更容易接受豆制品和蔬菜汁的口感，降低了令人不舒服的味道，同時(shí)也提升了產(chǎn)品的營養(yǎng)價(jià)值，擴(kuò)展了此類飲品的消費(fèi)市場。添加L-丙氨酸到魚露中能有效減少含硫化合物的相對含量，改善產(chǎn)品風(fēng)味[6]。L-丙氨酸和DL-丙氨酸可以使酒的味道更加醇正濃厚，增加了酒的甜味，抑制了美拉德反應(yīng)，還可防止發(fā)泡酒老化，并減少酵母氣味等。DL-丙氨酸還可用于改善浸漬品的風(fēng)味，防止油類及油類食品氧化，提高腌制效果，同時(shí)縮短腌制的時(shí)間[7]。DL-丙氨酸具有緩沖酸堿、螯合重金屬和抑制其他氨基酸褐化的功能。

1.2 丙氨酸在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用

在醫(yī)藥領(lǐng)域中，L-丙氨酸作為營養(yǎng)劑和生糖氨基酸的成分之一[5]，可以用來檢測肝臟功能，制作生物化學(xué)藥劑等。也可用作術(shù)前、術(shù)后的營養(yǎng)劑[7]；L-丙氨酸作為一種原料，可用于生產(chǎn)多種藥物，例如作為前體物質(zhì)合成某些抗癌藥物，用于治療宮頸癌、喉癌等，也可以用于生產(chǎn)索非布韋，治療慢性肝炎感染，及生產(chǎn)依那普利治療高血壓等；此外，血液保存劑中還包含L-丙氨酸，其代謝及豐度與氨基糖苷抗生素耐藥性有關(guān)[8]。L-丙氨酸還是維生素B6的重要原料，合成氨基丙醇用來制造氧氟沙星等高效抗菌藥，也可以增強(qiáng)吡啶酮酸等抗菌藥的殺菌效果，增加細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，起到協(xié)同抗分枝桿菌的作用，為抵抗結(jié)核病做出貢獻(xiàn)[9]。結(jié)核分枝桿菌引起的結(jié)核病仍然是一個(gè)主要的全球衛(wèi)生問題，結(jié)核分枝桿菌的耐藥性和持久性進(jìn)一步加劇了這種情況。在保健品行業(yè)，L-丙氨酸是一種護(hù)肝配方成分，可以有效地減少酒精中毒程度，還可以制成預(yù)防疲勞的營養(yǎng)品[10]；在生理醫(yī)學(xué)上研究發(fā)現(xiàn)D-丙氨酸能防止機(jī)體的脂質(zhì)受到氧化損害?？梢砸种芅-亞硝基二甲胺等致癌物質(zhì)，在腫瘤細(xì)胞質(zhì)中使體內(nèi)的氨基酸氧化酶異位表達(dá)，從而消除細(xì)胞內(nèi)的毒素，可以作為一種抗癌藥物[11]；在制藥方面，D-丙氨酸是抗生素維吉尼亞霉素系列藥物的原料[3]，也是合成二肽阿力甜的重要原料[12]；D-丙氨酸在精神分裂癥、阿爾茲海默癥和腎臟疾病等多種人類疾病中具有相關(guān)性，為各種神經(jīng)和精神疾病以及許多其他疾病的新生物標(biāo)志物和治療策略鋪平道路[13]。β-丙氨酸合成巴柳氮后可用在治療直腸炎以及結(jié)腸炎等腸胃疾病，也可以合成泛酸鈣或帕米磷酸二鈉減輕腫瘤性骨痛和高血鈣癥。

1.3 丙氨酸在日化及其他領(lǐng)域中的應(yīng)用

L-丙氨酸作為溫和的氨基酸表面活性劑表現(xiàn)出良好的去污、乳化及滲透能力，在護(hù)理品中具有美白保濕、延緩衰老等功能，更適用于敏感性肌膚，生物降解性好并且綠色環(huán)保；在化妝品中，D-丙氨酸不但有抗菌效果，而且是天然的保濕成分，起到了保持角質(zhì)層水分的作用[14]。在用于生產(chǎn)新型螯合劑如甲基甘氨酸二乙酸時(shí)，L-丙氨酸避免了一些傳統(tǒng)磷酸鹽對生態(tài)系統(tǒng)的破壞，可以自然降解，減少了對人類和環(huán)境的損害。古戶波等[15]將L-丙氨酸和鳥嘌呤組合作為原料，合成了鳥嘌呤-氨基酸衍生物緩蝕劑，具有新型、綠色和無毒性的特點(diǎn)。β-丙氨酸晶體還可增強(qiáng)大腸桿菌的抑菌活性并用于廢水處理[16]。

2 丙氨酸的合成

2.1 L-丙氨酸的合成

2.1.1 傳統(tǒng)方法制備L-丙氨酸

生產(chǎn)L-丙氨酸的傳統(tǒng)制備方法主要有提取法、蛋白質(zhì)水解法和化學(xué)合成法。提取法可采用酸水解或酶解法，將玉米蛋白或者明膠等L-丙氨酸含量高的原料進(jìn)行分解，再經(jīng)過手性拆分可以獲得L-丙氨酸。然而該工藝成本較高，不利于大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。早期在我國應(yīng)用蛋白質(zhì)水解法比較廣，因?yàn)樵蟻碓雌毡椤r(jià)格低廉，并且工藝也簡單。但其生產(chǎn)效率低，易造成三廢污染，難以在工業(yè)化生產(chǎn)中占有優(yōu)勢，目前該方法已經(jīng)被淘汰?；瘜W(xué)合成法有3種途徑，可通過溴丙酸、氨水和碳酸氫銨混合作用，經(jīng)過蒸發(fā)、去溴化銨、過濾、脫色等一系列步驟生成丙氨酸；亦可將乙醛和氫氰酸與氨反應(yīng)制備氨基丙酸鈉，最后采用離子交換法生成終產(chǎn)物；也可通過丙酸氯化法進(jìn)行合成，但存在產(chǎn)量低、質(zhì)量差和環(huán)境污染等問題，目前基本不采取該方法。

2.1.2 微生物發(fā)酵法合成L-丙氨酸

在大腸桿菌中L-丙氨酸和α-酮戊二酸通過谷丙轉(zhuǎn)氨酶的催化生成丙酮酸和谷氨酸，且此反應(yīng)為可逆反應(yīng)，如圖1所示。

圖1 L-丙氨酸和α-酮戊二酸的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)式Fig.1 The transamination reaction formula of L-alanine and α-ketoglutarate

雖然谷丙轉(zhuǎn)氨酶可以催化L-丙氨酸的生物合成，但其效率很低。D-乳酸、乙醇和乙酸等經(jīng)由丙酮酸進(jìn)一步代謝產(chǎn)生[17]，諸如此類的代謝途徑與L-丙氨酸代謝途徑爭奪碳源，不利于其生物合成，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的部分L-丙氨酸通過膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白運(yùn)輸?shù)桨?，另一部分L-丙氨酸在消旋酶的催化下變成D-丙氨酸，用作細(xì)胞壁的生成，ZHANG等[18]通過敲除甲基乙二醛合成酶基因(mgsA)以減少生成乳酸的途徑，敲除分解性丙氨酸外消旋酶基因(dadX)以減少L-丙氨酸到D-丙氨酸的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而提高L-丙氨酸的產(chǎn)量。通過選擇改善糖酵解途徑以利于丙氨酸生產(chǎn)。結(jié)果表明，菌株XZ132在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中發(fā)酵48 h，L-丙氨酸的產(chǎn)率為95%。曹杰[19]研究了以價(jià)格低廉的葡萄糖為原料發(fā)酵制備L-丙氨酸，將丙氨酸合成的支路代謝基因L-乳酸脫氫酶ldh從枯草芽孢桿菌IBL23染色體上敲除，提升了丙氨酸產(chǎn)率。周麗等[20]探究刪除了支路代謝產(chǎn)物合成途徑，將源于嗜熱脂肪芽孢桿菌的丙氨酸脫氫酶基因alaD取代菌株染色體上的丙氨酸消旋酶基因dadX，以甘油作為唯一碳源進(jìn)行發(fā)酵，促進(jìn)了L-丙氨酸的合成水平。孫金凱[21]在產(chǎn)酸克雷伯氏菌上敲除了甲基乙二醛合成酶基因mgs，并在此基礎(chǔ)上將丙氨酸脫氫酶基因alaD替換乳酸脫氫酶編碼基因ldh，以葡萄糖為原料，有效提升了丙氨酸的轉(zhuǎn)化。潘海亮等[22]研究所用的碳源是10%混合糖(5%葡萄糖和5%木糖)，敲除轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖的關(guān)鍵基因ptsG以大幅減弱了葡萄糖效應(yīng)，為以木質(zhì)纖維素為原料制取丙氨酸奠定了良好的工業(yè)應(yīng)用基礎(chǔ)。王燦等[23]研究通過敲除關(guān)鍵基因ptsG以及mglB抑制葡萄糖作用，采用葡萄糖60 g/L、木糖30 g/L、水稻秸稈水解液作為碳源，提高水解液對L-丙氨酸的發(fā)酵效果。發(fā)酵法生產(chǎn)用到的原料葡萄糖供應(yīng)充足，價(jià)格低廉，但丙氨酸的產(chǎn)量不高，工業(yè)化生產(chǎn)效率低。發(fā)酵法是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，其優(yōu)越性將得到進(jìn)一步的發(fā)展。

2.1.3 酶催化法合成L-丙氨酸

汪芳[24]將來源于德阿昆哈假單胞菌中編碼L-天冬氨酸β-脫羧酶的基因aspD克隆至大腸桿菌BL21(DE3)中，通過誘導(dǎo)表達(dá)重組菌，使蛋白的可溶性表達(dá)提升。利用定點(diǎn)突變技術(shù)改善酶在酸性條件下的酶活力，構(gòu)建組合突變株，在優(yōu)化后的條件下進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化，結(jié)果表明，突變株N34D/L484M在12 h內(nèi)摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)99.6%，L-丙氨酸生成速率為4.17 g/(L·h)。發(fā)酵轉(zhuǎn)化27 h時(shí)，L-丙氨酸產(chǎn)量為371.05 g/L，摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到92.3%。于佳印[25]研究篩選到Acinetobacterradioresistens來源L-天冬氨酸β-脫羧酶(ArAsd)并通過分子改造提高ArAsd的酸穩(wěn)定性。構(gòu)建一系列突變體，其中N35D、A179E突變體顯示出比較好的酸穩(wěn)定性。構(gòu)建了ArAsd-N35D與EcAspA雙酶偶聯(lián)重組菌，通過全細(xì)胞催化底物富馬酸生成L-丙氨酸達(dá)971.26 mmol/L，轉(zhuǎn)化率為97.3%。通過表1對比微生物發(fā)酵法與酶催化法的國內(nèi)外研究水平，可知該工藝較其他方法具有高效、綠色、環(huán)保的特點(diǎn)，但原料價(jià)格偏高。

表1 微生物發(fā)酵法與酶催化法合成L-丙氨酸的國內(nèi)外研究水平對比Table 1 Comparison of domestic and foreign research levels on the synthesis of L-alanine by microbial fermentation and enzymatic catalysis

2.2 D-丙氨酸的合成

2.2.1 化學(xué)合成法合成D-丙氨酸

不對稱合成法和手性拆分法是化學(xué)合成的主要方法。不對稱合成法是直接利用化學(xué)原料合成D-丙氨酸，而手性拆分法則是先合成中間產(chǎn)物DL-丙氨酸，再通過光學(xué)方法對其進(jìn)行分離，得到純品的D-丙氨酸[26]。由于該反應(yīng)所需的手性試劑或金屬絡(luò)合物的價(jià)格昂貴，且存在諸多不足如反應(yīng)機(jī)制復(fù)雜、生產(chǎn)周期長等，限制了這些方法推廣與應(yīng)用。ZHANG等[27]利用枯草芽孢桿菌HLZ-68固定化細(xì)胞不對稱降解DL-丙氨酸生產(chǎn)D-丙氨酸，用聚乙烯醇和海藻酸鈣等不同的化合物對枯草桿菌HLZ-68細(xì)胞進(jìn)行固定化并具有更高的降解活性。采用陽離子交換樹脂可方便地從反應(yīng)液中提取D-丙氨酸，其化學(xué)純度和光學(xué)純度分別為99.1%和99.6%。該方法不僅提高了固定化細(xì)胞的利用率，而且滿足了工業(yè)化生產(chǎn)的要求。王傳磊[28]根據(jù)微生物降解機(jī)理不對稱性，在一定條件下培養(yǎng)，使菌體Ala-D45產(chǎn)生氨基酸氧化酶，具有強(qiáng)氧化性，氧化DL-丙氨酸中的L-丙氨酸，從而獲得D-丙氨酸。丁兆偉[29]研究獲得了一株能夠迅速徹底降解L-丙氨酸而對D-丙氨酸幾乎不降解的菌株Ala-D45。優(yōu)化培養(yǎng)條件后通過發(fā)酵分析得到：D-丙氨酸的總回收率為67.72%，純度達(dá)99.86%。

2.2.2 微生物發(fā)酵法合成D-丙氨酸

張學(xué)禮等[30]敲除了大腸桿菌XZ-A26的乳酸脫氫酶、乙醇脫氫酶、甲基乙二醛合成酶等支路途徑基因，減少了副產(chǎn)物的積累，并將源于枯草芽孢桿菌的L-丙氨酸脫氫酶基因和丙氨酸消旋酶基因轉(zhuǎn)化到宿主內(nèi)，構(gòu)建獲得工程菌株大腸桿菌XZ-A30，以葡萄糖等糖類為原料進(jìn)行發(fā)酵，產(chǎn)物DL-丙氨酸產(chǎn)量達(dá)114.6 g/L，D-丙氨酸產(chǎn)量達(dá)57.3 g/L。微生物發(fā)酵技術(shù)是安全、簡單、應(yīng)用廣泛的工業(yè)化生產(chǎn)方法，但生產(chǎn)菌株的選育難度大、培養(yǎng)周期長及反應(yīng)能量消耗大，分離技術(shù)也有待進(jìn)一步突破。

2.2.3 生物酶法合成D-丙氨酸

王勝鋒等[14]以乳酸為原料通過兩步法生產(chǎn)D-丙氨酸，先利用乳酸氧化酶催化乳酸生產(chǎn)丙酮酸，然后通過D-氨基酸脫氫酶還原成D-丙氨酸，在此過程中加入輔酶，條件優(yōu)化后，D-丙氨酸的轉(zhuǎn)化總摩爾收率能達(dá)到64.9%，產(chǎn)品的對映體過量(enantiomeric excess, ee)值達(dá)到99.9%。與傳統(tǒng)方法相比，該法制備工藝具有環(huán)保、成本低、質(zhì)量好等特點(diǎn)，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。張衛(wèi)衛(wèi)等[31]利用天冬氨酸消旋酶全細(xì)胞催化L-天冬氨酸消旋得到DL-天冬氨酸，先通過離心去除天冬氨酸消旋酶全細(xì)胞，經(jīng)升溫使殘留的天冬氨酸消旋酶滅活，再加入純化后的D-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶酶液，催化D-天冬氨酸和丙酮酸發(fā)生轉(zhuǎn)氨反應(yīng)得到D-丙氨酸。在優(yōu)化條件下，D-天冬氨酸轉(zhuǎn)化率達(dá)94%，D-丙氨酸收率為84%，ee值達(dá)98%。LI等[32]采用共固定化來自嗜熱共生桿菌的二氨基庚氨酸脫氫酶和來自嗜熱假絲酵母的甲酸脫氫酶催化丙酮酸鈉制備D-丙氨酸。優(yōu)化固定化和生物轉(zhuǎn)化條件后，D-丙氨酸平均產(chǎn)率為75.7%，ee值為99.5%。這表明共固定化酶系統(tǒng)是一種很有前途的生物催化劑，可用于丙酮酸的綠色生產(chǎn)。如表2所示，生物酶法合成D-丙氨酸質(zhì)量品質(zhì)好，但收率還有提高的空間。

2.3 DL-丙氨酸的合成

2.3.1 化學(xué)法合成DL-丙氨酸

化學(xué)合成法存在反應(yīng)過程復(fù)雜、工藝周期長、生產(chǎn)成本高及環(huán)境污染大等問題。毛建衛(wèi)等[33]通過研究提出了將多元溶劑循環(huán)合成與離子膜分離技術(shù)結(jié)合的新工藝。在反應(yīng)的過程中除了生成所需產(chǎn)品DL-α-丙氨酸外還得到了高附加值的氯化銨結(jié)晶副產(chǎn)物，再經(jīng)膜過濾，將反應(yīng)后的母液回收用作多元溶劑循環(huán)利用，母液里含有反應(yīng)體系所需的催化劑以及沒有反應(yīng)完全的合成原料，進(jìn)行新一輪合成反應(yīng)時(shí)，不用再另外添加催化劑，未反應(yīng)完全的原料可以進(jìn)行下次反應(yīng)。利用這種方法合成的產(chǎn)物是混合物，利用新型反饋式離子膜分離技術(shù)，獲到DL-丙氨酸產(chǎn)物，并同步獲得副產(chǎn)品。此方法減少了有毒溶劑-甲醇的使用，可極大降低能耗，減少了生產(chǎn)成本，提高了產(chǎn)品質(zhì)量，基本消除了三廢。

2.3.2 生物酶法合成DL-丙氨酸

生物法合成DL-丙氨酸目前主要以生物酶法催化為主。孫洪露[7]將大腸桿菌K-12的丙氨酸消旋酶Alr基因通過載體質(zhì)粒pET-28a克隆到大腸桿菌BL21(DE3)中，并表達(dá)出重組丙氨酸消旋酶。減壓蒸餾結(jié)晶后，可以得到90.6 g的DL-丙氨酸，回收率為90.6%。這種制備DL-丙氨酸的方法產(chǎn)率較低但成本低，簡單易操作，且污染小，可以應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。焦慶才等[34]利用富馬酸為原料，配制成一定濃度的富馬酸氨水溶液，再將含有天冬氨酸-β-脫羧酶、天冬氨酸酶以及丙氨酸消旋酶的菌體細(xì)胞或者是表達(dá)后3種酶的粗酶液與富馬酸氨水溶液混合，再利用等電點(diǎn)結(jié)晶與陰陽離子交換樹脂相結(jié)合的方式進(jìn)行分離，再經(jīng)過干燥最后得固體DL-丙氨酸31.5 g，結(jié)晶母液利用乙醇回收后循環(huán)利用，2次結(jié)晶共得DL-丙氨酸132 g，收率89.6%。該方案的主要技術(shù)創(chuàng)新點(diǎn)是使用多酶偶聯(lián)技術(shù)生產(chǎn)DL-丙氨酸，具有高生產(chǎn)效率且原材料來源廣、生產(chǎn)工藝操作簡單、酶促時(shí)間短和生產(chǎn)成本低。

2.4 β-丙氨酸的合成

2.4.1 化學(xué)合成法合成β-丙氨酸

丙烯腈法、β-氨基丙腈法、琥珀酰亞銨降解法存在成本高、污染較嚴(yán)重等問題，在工業(yè)生產(chǎn)中已較少使用。

2.4.2 微生物發(fā)酵法合成β-丙氨酸

雖然微生物發(fā)酵是工業(yè)化生產(chǎn)β-丙氨酸的一種很有前途的方法，但目前還缺乏高效的微生物細(xì)胞，ZOU等[35]通過敲除3個(gè)天冬氨酸激酶的基因，來防止天冬氨酸的支路丟失，從而促進(jìn)β-丙氨酸的合成。以L-天冬氨酸脫氫酶基因代替天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因，同時(shí)優(yōu)化啟動(dòng)子來過表達(dá)天冬氨酸脫氫酶基因，增加天冬氨酸的含量，進(jìn)一步提高了β-丙氨酸的產(chǎn)量。通過高效表達(dá)天冬氨酸脫氫酶基因和導(dǎo)入丙酮酸脫羧酶，提高了草酰乙酸的生物合成。陳可泉等[36]構(gòu)建重組菌株E.coliBL-pET28a-aspC，構(gòu)建E.coliBL-pET28a-panD葡萄糖代謝缺陷型菌株；選取重組菌株加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，以葡萄糖和甘油為碳源生產(chǎn)β-丙氨酸。通過在2個(gè)細(xì)胞中分別表達(dá)aspC和panD，利用混合細(xì)菌發(fā)酵的方法，降低了生產(chǎn)成本，相比于利用E.coliBL-pET28a-panD單一發(fā)酵生產(chǎn)，β-丙氨酸的收率提高了40%。

2.4.3 生物酶法合成β-丙氨酸

β-丙氨酸是一種重要的L-天冬氨酸衍生氨基酸，在酶法合成β-丙氨酸過程中，通常以L-天冬氨酸為底物，在L-天冬氨酸-α-脫羧酶催化下，經(jīng)過脫羧作用生成β-丙氨酸。酶催化法在過去的幾十年里受到越來越多的關(guān)注。目前研究較多的天冬氨酸脫羧酶主要來源于大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌、枯草芽孢桿菌和結(jié)核分枝桿菌。范文超等[37]通過分子改造得到了一種天冬氨酸脫羧酶的突變體，具有較高的酶活力，能高效催化反應(yīng)使天冬氨酸脫羧生成β-丙氨酸，之后對反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，最終將天冬氨酸的底物濃度改良到250 g/L，經(jīng)過24 h轉(zhuǎn)化后，轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到98.3%以上，具有工業(yè)應(yīng)用前景。QIAN等[38]利用位點(diǎn)飽和和C-末端缺失，產(chǎn)生變異體Q5。變異體Q5與L-天冬氨酸在15 L生物反應(yīng)器中偶聯(lián)，以富馬酸為底物，形成線性級(jí)聯(lián)反應(yīng)體系，產(chǎn)率為118.6 g/L β-丙氨酸，產(chǎn)物/催化劑為5.9 g/g，轉(zhuǎn)化率>99%。結(jié)果表明，重塑PAND的質(zhì)子化構(gòu)象可以有效地解除機(jī)理失活，提高催化穩(wěn)定性。

3 總結(jié)與展望

化學(xué)合成法等傳統(tǒng)方法由于存在原料價(jià)格高、生產(chǎn)工藝復(fù)雜、效率低下、產(chǎn)量低以及環(huán)境污染嚴(yán)重等問題，工業(yè)生產(chǎn)丙氨酸已經(jīng)逐步淘汰這些方法，取而代之的是微生物發(fā)酵法和酶轉(zhuǎn)化法。從20世紀(jì)中期就開始研究發(fā)酵法生產(chǎn)丙氨酸，但是由于當(dāng)時(shí)技術(shù)水平有限，發(fā)酵法存在諸多弊端。進(jìn)入21世紀(jì)后，隨著發(fā)酵設(shè)備的升級(jí)以及生物技術(shù)的發(fā)展，帶動(dòng)了發(fā)酵法的技術(shù)進(jìn)步，葡萄糖是發(fā)酵法制備丙氨酸的原材料，近年來葡萄糖的市場化程度越來越高，供應(yīng)充足，價(jià)格低廉。微生物發(fā)酵法不僅提升了產(chǎn)酸率，還促進(jìn)了提取及分離的水平，使生物發(fā)酵法相對其他合成方法具有非常明顯的競爭優(yōu)勢，開拓了發(fā)展前景。但丙氨酸的產(chǎn)量不高，工業(yè)化生產(chǎn)效率低。發(fā)酵法是目前研究的熱點(diǎn)，隨著技術(shù)的進(jìn)步，發(fā)酵法的優(yōu)勢將會(huì)得到進(jìn)一步發(fā)展。酶催化技術(shù)是目前工業(yè)上應(yīng)用最為廣泛的丙氨酸合成方法，它的優(yōu)勢在于采用生物酶作催化劑，反應(yīng)條件溫和，同時(shí)避免了化學(xué)催化劑的污染，也大大降低了成本。近幾十年來，隨著對更綠色、可持續(xù)化制造需求的增加，生物酶法制備丙氨酸已成為替代傳統(tǒng)化學(xué)法生產(chǎn)的有效替代方案。但此過程中酶的用量較大，L-天冬氨酸或富馬酸等原料資源緊張、價(jià)格高漲，同時(shí)此法生產(chǎn)的效率也較低，所以酶轉(zhuǎn)化法難以用于工業(yè)化生產(chǎn)。若對酶催化法進(jìn)一步優(yōu)化，使用物美價(jià)廉的原料，利用雙酶法提升表達(dá)量及效率，進(jìn)一步擴(kuò)大產(chǎn)量應(yīng)用在工業(yè)化生產(chǎn)中，未來在丙氨酸市場中會(huì)有非常好的發(fā)展前景。