澤瀉醇提物對(duì)亞臨床性甲狀腺功能減退癥母鼠甲狀腺功能及仔鼠神經(jīng)功能的作用及其機(jī)制

李燕君，俄洛吉，李玉琴

青海省人民醫(yī)院產(chǎn)科，青海 西寧 810000

亞臨床性甲狀腺功能減退癥(subclinical hypothyroidism，SCH)是妊娠女性常見的甲狀腺功能異常性疾病[1]，發(fā)病率為3.0%～5.0%，常因臨床表現(xiàn)不明顯而被忽略。目前發(fā)現(xiàn)SCH可增加患者妊娠不良結(jié)局的風(fēng)險(xiǎn)[2]，引起后代大腦發(fā)育異常等，嚴(yán)重影響母嬰安全[3-4]。左旋甲狀腺素(L-T4)替代治療SCH效果肯定，但對(duì)部分伴有心血管疾病的患者其應(yīng)用受到限制[5]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)健脾化痰活血方可調(diào)節(jié)SCH大鼠的甲狀腺功能[6]，提示中藥治療SCH具有一定可行性。中藥澤瀉屬于利水滲濕藥，現(xiàn)代藥理研究表明其提取物可調(diào)節(jié)機(jī)體代謝、抗炎、降血脂等[7]，但鮮有研究報(bào)道其在SCH中的應(yīng)用。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，SCH母鼠后代仔鼠神經(jīng)發(fā)育與原肌球蛋白受體激酶A(tropomyosin receptor kinase A，TrkA)/p75神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體(p75 neurotrophin receptor，p75NTR)通路有關(guān)[8]?；诖耍狙芯拷CH母鼠模型，探討澤瀉醇提物對(duì)SCH母鼠甲狀腺功能及仔鼠神經(jīng)功能的影響，旨在為臨床藥物研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 澤瀉購自四川沁信源商貿(mào)有限公司，L-T4鈉片購自德國默克公司，L-T4針劑購自美國Sigma公司；促甲狀腺素(thyroid stimulating hormone，TSH)、甲狀腺素(thyroxine，T4)檢測(cè)試劑盒購自上海透景生命科技公司，神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor，NGF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)試劑盒與兔抗大鼠TrkA、磷酸化TrkA(p-TrkA)、環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)、磷酸化CREB(p-CREB)、GAPDH一抗購自美國Abcam公司，山羊抗兔二抗(HRP標(biāo)記)購自美國Sigma公司；DYCZ-40D型轉(zhuǎn)印電泳儀購自武漢純度生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 85只SPF級(jí)Wistar雌鼠，8周齡，體重200～220 g，45只雄鼠，10周齡，體重230～250 g，均購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006]。將雌鼠飼養(yǎng)于安靜環(huán)境，室內(nèi)相對(duì)濕度為50%～70%，溫度為23～25 ℃，每12 h明暗交替，每周更換清潔籠具、墊料，消毒飲水瓶，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)過程符合國家及單位有關(guān)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定。

1.3 模型制備 參考文獻(xiàn)[9]建立SCH模型。雌鼠稱重，腹腔注射麻醉，頸正中切口，分離暴露甲狀腺腺體，切除甲狀腺峽部、左腺葉、右腺葉，沖洗術(shù)野，分層間斷縫合，肌注青霉素鈉預(yù)防感染，術(shù)后頭偏一側(cè)，每籠一只，觀察有無分泌物窒息，并于術(shù)后靜推葡萄糖酸鈣防止甲狀旁腺摘除引起的低鈣抽搐。假手術(shù)組切開、分離等步驟同上，但不切除甲狀腺。術(shù)后恢復(fù)1個(gè)月，眼眶后采血檢查甲狀腺功能，當(dāng)血清TSH高于正常范圍上限、T4低于最低值時(shí)，判定成功建立甲狀腺功能減退(甲減)模型。隨后開始皮下注射L-T4針劑，9.5 μg/(kg.d)，每日測(cè)量體重以調(diào)整劑量，9 d后復(fù)查甲狀腺功能，當(dāng)雌鼠血清TSH高于正常、T4處于正常范圍時(shí)提示SCH模型建立成功。孕期繼續(xù)依據(jù)體重調(diào)整L-T4劑量，保證孕期SCH狀態(tài)，以作為模型組。建模成功后進(jìn)行雌雄合籠交配，雄:雌=1:2，次日雌鼠陰道栓發(fā)現(xiàn)精子確定為妊娠，妊娠0 d記為E0，分娩日記為P0，出生后7 d記為P7。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組與干預(yù)方法 取15只雌鼠經(jīng)假手術(shù)處理后作為假手術(shù)組，其余70只采用甲狀腺切除+L-T4皮下注射法建立SCH模型，棄去未成模雌鼠，成功建模62只，隨機(jī)分為模型組(n=15)、低劑量澤瀉醇提物組(n=15)、高劑量澤瀉醇提物組(n=16)、L-T4組(n=16)。澤瀉醇提物制備方法如下：取澤瀉粉末1 kg，與75%乙醇以1:10比例回流提取(2 h/次，2次)，合并醇提液層，旋轉(zhuǎn)、蒸發(fā)、回收溶劑，至無醇味后予以冷凍干燥，得到澤瀉醇提物，加入生理鹽水溶解，制備為0.9 g/ml的溶液備用。L-T4混懸液制備方法如下：碾碎L(zhǎng)-T4鈉片，溶于蒸餾水，灌胃時(shí)稀釋，調(diào)整濃度為1 μg/ml。各組均于E10開始干預(yù)，低、高劑量澤瀉醇提物組分別予以9 g/kg、36 g/kg澤瀉醇提物灌胃，L-T4組使用L-T46 μg/kg[10]灌胃，假手術(shù)組與模型組每日灌胃等體積生理鹽水，各組均每日灌胃1次，干預(yù)時(shí)間為E10至P21(即產(chǎn)后21 d離乳)。P21后雌雄仔鼠分籠飼養(yǎng)，各組母鼠停止干預(yù)。

1.5 電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)母鼠甲狀腺功能 大鼠雌鼠妊娠期為18～22 d，本研究取E17時(shí)測(cè)定母鼠甲狀腺功能，從各組母鼠眼眶后靜脈叢取血離心(3000 r/min×10 min，離心半徑10 cm)，離心后收集血清，–20 ℃保存。采用電化學(xué)發(fā)光法測(cè)定各組母鼠血清TSH、T4水平。

1.6 ELISA法檢測(cè)仔鼠海馬組織神經(jīng)因子水平 于離乳時(shí)(即P21時(shí))每組隨機(jī)選取10只仔鼠，脫頸處死取腦，冰皿中迅速剝離仔鼠海馬組織。處理方法如下：置于4 ℃生理鹽水，剪碎組織，玻璃勻漿器中研磨約5 min，制備組織勻漿后離心(4000 r/min×10 min，離心半徑3.5 cm)，取上清液，–20 ℃凍存待測(cè)。ELISA法檢測(cè)，制備標(biāo)準(zhǔn)品，混勻試劑，加標(biāo)準(zhǔn)品，抗體孵育，洗滌；加鏈霉親和素-HRP溫育后洗滌，加底物混勻溫育，加終止液，450 nm波長(zhǎng)測(cè)OD值，計(jì)算NGF、BDNF濃度。

1.7 Western blotting檢測(cè)仔鼠海馬組織TrkA通路蛋白的表達(dá) P21時(shí)，取仔鼠海馬組織，加入裂解液，4 ℃下15 000 r/min離心15 min，提取組織蛋白，進(jìn)行蛋白定量，100 ℃水浴煮沸，蛋白變性，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，置于5.0% BSA封閉液中，室溫封閉1 h，TBST洗膜3次，10 min/次；取出封閉PVDF膜，加入稀釋(1:1000)的兔抗鼠TrkA、p-TrkA、CREB、p-CREB一抗，4 ℃過夜，TBST洗膜，予以稀釋二抗(1:5000)，室溫孵育1.5 h，TBST洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光、顯影、曝光，采用ImageJ分析條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參照，計(jì)算目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.8 定位巡航實(shí)驗(yàn)及空間探索測(cè)試 各組取10只仔鼠，于P39時(shí)行Morris水迷宮訓(xùn)練，在P40時(shí)進(jìn)行定位巡航實(shí)驗(yàn)測(cè)試，P41時(shí)進(jìn)行空間探索測(cè)試，分3 d完成測(cè)試。(1)Morris水迷宮訓(xùn)練：保持水溫26 ℃，在水池中心放置平臺(tái)(高于水平面1.5 cm)，每只大鼠訓(xùn)練3次；水迷宮設(shè)置N、S、W、E 4個(gè)入水點(diǎn)，選一入水點(diǎn)，仔鼠背對(duì)平臺(tái)放入，60 s探索平臺(tái)，記錄找到平臺(tái)的時(shí)間，若60 s未找到平臺(tái)，記為60 s，然后引導(dǎo)其找到，每個(gè)入水點(diǎn)重復(fù)3次，每次入水間隔時(shí)間不少于10 min，共進(jìn)行12次訓(xùn)練，完成后放回鼠籠。(2)定位巡航測(cè)試：水池放脫脂奶粉，調(diào)低平臺(tái)高度(低于水平面1.5 cm，使大鼠看不見平臺(tái))，面向水池放仔鼠入水中，從電腦屏幕上觀察，其余步驟同Morris水迷宮訓(xùn)練，記錄仔鼠找到平臺(tái)時(shí)間，即逃避潛伏期。(3)空間探索測(cè)試：撤掉平臺(tái)，所有仔鼠選擇在N點(diǎn)入水，記錄30 s內(nèi)穿越平臺(tái)次數(shù)，以測(cè)定仔鼠的空間記憶能力。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＆lt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組母鼠甲狀腺功能比較 E17時(shí)5組母鼠血清TSH水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＆lt;0.05)，而母鼠血清T4水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＆gt;0.05)。模型組母鼠血清T S H 水平明顯高于假手術(shù)組(P＆lt;0.05)，低劑量澤瀉醇提物組、高劑量澤瀉醇提物組、L-T4組血清TSH水平明顯低于模型組(P＆lt;0.05)，高劑量澤瀉醇提物組、L-T4組血清TSH水平明顯低于低劑量澤瀉醇提物組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＆lt;0.05)，而高劑量澤瀉醇提物組與L-T4組血清TSH水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＆gt;0.05)(表1)。

表1 各組母鼠甲狀腺功能比較(±s)Tab.1 Comparison of thyroid function of female mice in each group (±s)

表1 各組母鼠甲狀腺功能比較(±s)Tab.1 Comparison of thyroid function of female mice in each group (±s)

TSH.促甲狀腺素；T4.甲狀腺素；L-T4.左旋甲狀腺素；與假手術(shù)組比較，(1)P＆lt;0.05；與模型組比較，(2)P＆lt;0.05；與低劑量澤瀉醇提物組比較，(3)P＆lt;0.05

組別 TSH(mU/L) T4(nmol/L)假手術(shù)組(n=15) 0.13±0.08 25.67±7.16模型組(n=15) 0.89±0.15(1) 24.34±6.85低劑量澤瀉醇提物組(n=15) 0.37±0.14(2) 25.03±7.01高劑量澤瀉醇提物組(n=16) 0.14±0.09(2)(3) 26.01±8.23 L-T4組(n=16) 0.12±0.08(2)(3) 26.45±7.17 F 132.698 0.199 P＆lt;0.001 0.938

2.2 各組仔鼠海馬組織NGF、BDNF水平比較P21時(shí)，模型組仔鼠海馬組織NGF、BDNF水平明顯低于假手術(shù)組(P＆lt;0.05)，低、高劑量澤瀉醇提物組及L-T4組明顯高于模型組(P＆lt;0.05)，高劑量澤瀉醇提物組、L-T4組明顯高于低劑量澤瀉醇提物組(P＆lt;0.05)，而高劑量澤瀉醇提物組、L-T4組海馬組織NGF、BDNF水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＆gt;0.05)(表2)。

表2 各組仔鼠海馬組織NGF、BDNF水平比較(±s, n=10)Tab.2 Comparison of NGF and BDNF levels in hippocampus of offspring mice in each group (±s, n=10)

表2 各組仔鼠海馬組織NGF、BDNF水平比較(±s, n=10)Tab.2 Comparison of NGF and BDNF levels in hippocampus of offspring mice in each group (±s, n=10)

NGF.神經(jīng)生長(zhǎng)因子；BDNF.腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；L-T4.左旋甲狀腺素；與假手術(shù)組比較，(1)P＆lt;0.05；與模型組比較，(2)P＆lt;0.05；與低劑量澤瀉醇提物組比較，(3)P＆lt;0.05

組別 NGF(pg/mg) BDNF(pg/g)假手術(shù)組 0.61±0.20 108.36±20.21模型組 0.19±0.08(1) 74.15±9.34(1)低劑量澤瀉醇提物組 0.32±0.10(2) 85.64±14.28(2)高劑量澤瀉醇提物組 0.50±0.13(2)(3) 99.87±19.53(2)(3)L-T4組 0.54±0.15(2)(3) 105.59±21.11(2)(3)F 15.538 6.848 P＆lt;0.001 ＆lt;0.001

2.3 各組仔鼠Tr k A 通路蛋白表達(dá)水平比較Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，P21時(shí)，模型組仔鼠海馬組織p-TrkA、p-CREB表達(dá)水平明顯低于假手術(shù)組(P＆lt;0.05)，低、高劑量澤瀉醇提物組及L-T4組仔鼠海馬組織p-TrkA、p-CREB表達(dá)水平明顯高于模型組(P＆lt;0.05)，高劑量澤瀉醇提物組、L-T4組仔鼠海馬組織p-TrkA、p-CREB表達(dá)水平明顯高于低劑量澤瀉醇提物組(P＆lt;0.05)，高劑量澤瀉醇提物組與L-T4組仔鼠海馬組織p-TrkA、p-CREB表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＆gt;0.05)(圖1)。

圖1 各組仔鼠海馬組織TrkA、p-TrkA、CREB、p-CREB表達(dá)水平比較Fig.1 Comparison of expression levels of TrkA, p-TrkA, CREB and p-CREB in hippocampus of offspring mice in each group

2.4 各組仔鼠逃避潛伏期比較 P40時(shí)5組仔鼠逃避潛伏期比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＆lt;0.05)。進(jìn)一步兩兩比較顯示，模型組仔鼠逃避潛伏期明顯長(zhǎng)于假手術(shù)組(P＆lt;0.05)，低、高劑量澤瀉醇提物組及L-T4組仔鼠逃避潛伏期均短于模型組(P＆lt;0.05)，高劑量澤瀉醇提物組、L-T4組仔鼠逃避潛伏期短于低劑量澤瀉醇提物組(P＆lt;0.05)，高劑量澤瀉醇提物組與L-T4組仔鼠逃避潛伏期比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＆gt;0.05)(圖2)。

圖2 各組仔鼠逃避潛伏期比較Fig.2 Comparison of escape latency of offspring in each group

2.5 各組仔鼠穿越平臺(tái)次數(shù)比較 P41時(shí)，模型組仔鼠穿越平臺(tái)次數(shù)少于假手術(shù)組(P＆lt;0.05)，低、高劑量澤瀉醇提物組及L-T4組仔鼠穿越平臺(tái)次數(shù)均多于模型組(P＆lt;0.05)，高劑量澤瀉醇提物組、L-T4組仔鼠穿越平臺(tái)次數(shù)多于低劑量澤瀉醇提物組(P＆lt;0.05)，而高劑量澤瀉醇提物組與L-T4組仔鼠穿越平臺(tái)次數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＆gt;0.05)(圖3)。

圖3 各組仔鼠穿越平臺(tái)次數(shù)比較Fig.3 Comparison of the number of offspring crossing platforms in each group

3 討 論

目前研究認(rèn)為，妊娠可對(duì)母體甲狀腺功能產(chǎn)生影響，人絨毛膜促性腺激素(hCG)與TSH受體結(jié)合可引起三碘甲腺原氨酸(T3)、T4需求增加，且妊娠會(huì)引起甲狀腺體積增大，使機(jī)體T4需求量增加，導(dǎo)致母體妊娠期間發(fā)生甲減或SCH，而T4可影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，對(duì)后代生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生嚴(yán)重影響[11-13]，因此，促進(jìn)T4生成或補(bǔ)充外源性T4是其治療的根本[14]。中藥療法近年來逐漸被應(yīng)用于甲狀腺疾病的治療，并顯示出安全、獨(dú)特的價(jià)值[15-16]。中醫(yī)認(rèn)為，SCH屬于“虛損”“水腫”等范疇，其基本病機(jī)為脾腎陽虛[17]，治療當(dāng)以化氣利水與溫補(bǔ)腎陽為主。澤瀉歸腎經(jīng)，可利水、清濕熱、補(bǔ)腎陽，具有抗代謝紊亂、利尿、調(diào)節(jié)血脂等療效，且有研究證實(shí)其提取物在一定劑量?jī)?nèi)無明顯不良反應(yīng)[18-19]。

根據(jù)大鼠妊娠、發(fā)育的時(shí)間點(diǎn)，胚胎組織一般從E11時(shí)開始分泌T3、T4，E18－E22時(shí)可分娩，P21時(shí)斷乳，P40時(shí)可進(jìn)行游泳相關(guān)實(shí)驗(yàn)。因此，本研究從E10時(shí)開始進(jìn)行分組干預(yù)，E17時(shí)檢測(cè)母鼠甲狀腺功能，P21時(shí)行仔鼠神經(jīng)因子、蛋白等檢測(cè)，P40時(shí)檢測(cè)仔鼠學(xué)習(xí)與記憶能力。本研究結(jié)果顯示，低、高劑量澤瀉醇提物組及L-T4組母鼠血清TSH水平低于模型組，而高劑量澤瀉醇提物組母鼠血清TSH水平低于低劑量組，且與L-T4組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示澤瀉醇提物可改善母鼠甲狀腺功能，考慮與澤瀉醇提物具有利尿、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌紊亂的作用有關(guān)，可促使母鼠T4趨近孕期正常表達(dá)。甲狀腺相關(guān)激素可維持人體代謝平衡，尤其是在神經(jīng)遞質(zhì)的生理表達(dá)中起關(guān)鍵作用，進(jìn)而可影響個(gè)體的神經(jīng)功能[20]。本研究建模成功后進(jìn)行分組干預(yù)發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，低、高劑量澤瀉醇提物組及L-T4組仔鼠海馬組織NGF、BDNF表達(dá)水平升高，逃避潛伏期縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)增多，且高劑量組上述指標(biāo)改善程度優(yōu)于低劑量組，與L-T4組相當(dāng)，提示高劑量澤瀉醇提物在仔鼠神經(jīng)功能發(fā)育中具有藥用價(jià)值。使用澤瀉醇提物后仔鼠可從母體胚胎、乳汁及自身發(fā)育中獲得生理作用量的T4，通過調(diào)控甲狀腺受體等促進(jìn)神經(jīng)因子正常表達(dá)，維持仔鼠神經(jīng)系統(tǒng)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。

國外有研究發(fā)現(xiàn)，保護(hù)海馬組織中NGF/TrkA通路的活性有望成為阿爾茨海默病的有效治療策略，NGF等神經(jīng)因子主要與TrkA結(jié)合，再通過CREB調(diào)節(jié)神經(jīng)元再生、存活等生理活動(dòng)，激活TrkA通路以促進(jìn)相關(guān)蛋白的表達(dá)有利于神經(jīng)元的分化及神經(jīng)元突觸可塑性的誘導(dǎo)，并可改善機(jī)體的神經(jīng)功能[21-22]。本研究采用Western blotting檢測(cè)仔鼠海馬組織TrkA通路蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低、高劑量澤瀉醇提物組p-TrkA、p-CREB表達(dá)水平均明顯高于模型組，且高劑量組表達(dá)升高更為明顯，提示澤瀉醇提物可改善孕期及哺乳期母鼠的甲狀腺功能失調(diào)，促進(jìn)仔鼠p-TrkA、p-CREB蛋白趨近于正常表達(dá)，從而改善神經(jīng)功能，并可提高后代的學(xué)習(xí)與記憶能力。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，澤瀉醇提物可恢復(fù)SCH母鼠甲狀腺功能，提高仔鼠海馬組織NGF、BDNF的表達(dá)水平，改善仔鼠神經(jīng)功能，其機(jī)制可能與澤瀉醇提物激活TrkA信號(hào)通路，促進(jìn)p-TrkA、p-CREB蛋白的表達(dá)有關(guān)，這為相關(guān)藥物的研發(fā)提供了理論基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但本研究所用劑量為預(yù)實(shí)驗(yàn)判定的劑量，同時(shí)僅初步探討了澤瀉在SCH母鼠及仔鼠中的應(yīng)用，且僅選取了川澤瀉進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其他不同產(chǎn)地的澤瀉效力如何尚待研究論證，后期可進(jìn)一步分析不同產(chǎn)地澤瀉是否具有同等效果。此外，澤瀉醇提物是否可通過調(diào)控其他相關(guān)通路來改善SCH母鼠后代的神經(jīng)功能仍需進(jìn)一步探索。