五子衍宗丸對帕金森病小鼠腦組織中神經(jīng)營養(yǎng)因子及凋亡相關(guān)基因表達的影響

杭薇，樊慧杰，李艷榮，肖琪，范麗珊，王新亮，王青，肖保國，馬存根,3*，柴智*

1山西中醫(yī)藥大學多發(fā)性硬化益氣活血重點研究室/神經(jīng)生物學研究中心，山西 晉中 030619；2復旦大學華山醫(yī)院神經(jīng)病學研究所，上海 200025；3山西大同大學腦科學研究所，山西 大同 037009

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是發(fā)病率僅次于癡呆的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，年發(fā)病率5/(10萬)～35/(10萬)，其患病率隨年齡增長而上升[1]。PD以選擇性中腦黑質(zhì)多巴胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元變性、缺失及運動障礙為主要特征，發(fā)病機制尚不明確，臨床上多用西藥如左旋多巴制劑治療，但長期服用后療效減弱，且可能出現(xiàn)多種并發(fā)癥[2-3]。部分中藥復方對PD治療有一定療效[4-5]。有研究顯示，采用五子衍宗湯治療腎虛髓減型PD輕度認知功能障礙療效良好[6]；五子衍宗丸(Wuzi Yanzong Pill，WYP)亦可對神經(jīng)細胞發(fā)揮保護作用，治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病[7]。我們的前期研究顯示，五子衍宗丸治療PD療效顯著[8-9]。本研究采用神經(jīng)毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6- tetrahydropyridine，MPTP)誘導的PD小鼠模型，檢測PD小鼠腦內(nèi)黑質(zhì)紋狀體中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cellderived neurotrophic factor，GDNF)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)及細胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9的表達情況，探究五子衍宗丸治療PD的作用機制，為其治療PD提供新的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥材 五子衍宗丸購自太原市同仁堂藥店(生產(chǎn)商：北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠；批號：20035036；規(guī)格：0.1 g/粒)；藥丸用研磨機研磨成微細粉末，用0.9%氯化鈉注射液溶解配制成0.32 g/ml的五子衍宗丸藥液，現(xiàn)配現(xiàn)用，使用前于水浴鍋中加熱并混勻。

1.2 儀器 DigiGait動物步態(tài)檢測分析系統(tǒng)(美國MSI公司，型號：MSI-DIG-RT)；電泳儀(美國Bio-Rad公司，型號：PowerPacTM)；轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司，型號：PowerPacTM)；凝膠成像分析儀(美國Bio-Rad公司，型號：HOOD-Ⅱ)；酶標儀(德國Leica公司，型號：C-1150)；高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司，型號：5840)。

1.3 試劑 MPTP(M0896)購自美國Sigma公司。BDNF抗體(A1307)、GDNF抗體(A14639)、CNTF抗體(A1915)購自武漢Abconal公司，酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)抗體(#58844)購自美國Cell Signaling Technology公司。RNAprep pure Tissue Kit(DP431)購自天根生化科技(北京)有限公司。M5 Sprint qPCR RT kit with gDNA remover(MF949-T)、Realtime PCR Super mix(SYBR green，with anti-Taq)(MF013-01)購自北京聚合美生物科技有限公司。增強型RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer，RIPA)(AR0102)購自武漢博士德生物工程有限公司。Bcl-2、Bax、caspase-3和caspase-9的引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.4 實驗動物及其分組 8周齡雄性C57BL/6小鼠30只，體重(20±3) g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2021-0006]，按隨機數(shù)字表法隨機分為3組(每組10只)：對照組、PD模型組和PD+WYP組。對照組小鼠生理鹽水[50 ml/(kg.d)]灌胃，每天2次，間隔12 h，連續(xù)14 d。PD模型組小鼠腹腔注射MPTP，每天1次，持續(xù)7 d(第1天：15 mg/kg；第2天：20 mg/kg；第3－7天：30 mg/kg)[8-9,12]；同時給予生理鹽水灌胃[50 ml/(kg.d)]，每天2次，間隔12 h，連續(xù)14 d。PD+WYP組小鼠腹腔注射MPTP，每天1次，持續(xù)7 d(第1天：15 mg/kg；第2天：20 mg/kg；第3－7天：30 mg/kg)；給予五子衍宗丸灌胃[16 g/(kg.d)]，每天2次，間隔12 h，連續(xù)14 d。本研究動物實驗方案通過山西中醫(yī)藥大學醫(yī)學與動物倫理審查委員會審查批準(批準文號：2021DW268)，實驗過程符合國家和單位有關(guān)實驗動物的管理和使用規(guī)定。

1.5 行為學實驗檢測小鼠的運動功能 五子衍宗丸給藥第14天，對小鼠進行行為學檢測。(1)步態(tài)實驗。將跑帶速度設(shè)置為15 cm/s，小鼠放置于水平步態(tài)儀的透明隔間中。通過DigiGait步態(tài)檢測分析系統(tǒng)在連續(xù)10 s內(nèi)記錄小鼠動態(tài)步態(tài)行為指標，測量小鼠各腳爪擺動的平均時間。每只小鼠進行3次檢測，每次間隔10 min，并進行統(tǒng)計分析。(2)爬桿實驗。將一直徑1 cm、長60 cm的木桿纏繞兩層紗布(防滑)，頂端固定一圓形木塞。將小鼠頭部朝下放于木塞上，使其自然下爬，記錄小鼠從桿頂自然爬到桿底平臺所用時間。測試3次，每次間隔10 min以上，中途停頓或反向爬行則重新測試，取均值進行統(tǒng)計分析。

1.6 樣品采集 灌胃2周后處死小鼠，開胸暴露心臟。每組采用隨機數(shù)字表法選取5只小鼠用生理鹽水進行心臟灌注直至肝臟發(fā)白，用4%多聚甲醛溶液進行心臟灌注固定體內(nèi)組織；取出完整腦組織，置于4%多聚甲醛溶液中4 ℃固定24 h，再放置于10%、20%、30%蔗糖溶液中梯度脫水。OCT包埋制作組織包塊，將組織制備成10 μm連續(xù)冠狀冷凍切片。每組其余5只小鼠用生理鹽水心臟灌注至肝臟發(fā)白后，取出完整腦組織，切取黑質(zhì)紋狀體部位，稱重后放置于研磨器中，加入組織裂解液充分研磨，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，離心半徑為5 cm，取上清液置于–80 ℃冰箱保存。

1.7 免疫組織化學染色 冷凍腦組織切片置于4%多聚甲醛溶液浸泡1 h，再浸于PBS溶液清洗，浸于含0.5% Triton X-100的PBS中，室溫孵育5 min。加TH一抗(1:1000)4 ℃孵育過夜；次日PBS清洗，加對應IgG熒光二抗，常溫孵育2 h；浸洗，甘油封片。采用ImageJ進行細胞計數(shù)。

1.8 RT-qPCR檢測細胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9的mRNA表達水平 各組小鼠按上述方法取腦后，放入預冷的PBS中洗凈血污和雜質(zhì)。在冰上的平面皿中迅速分離出黑質(zhì)和紋狀體組織，用RNAprep pure Tissue Kit提取樣本總RNA并測定濃度。根據(jù)說明書，用M5 Sprint qPCR RT kit with gDNA remover轉(zhuǎn)錄出cDNA。使用Realtime PCR Super mix(SYBR green，with anti-Taq)將cDNA、相應引物和試劑按照說明書的要求混合后，在實時PCR儀上進行檢測。對各組樣品的Ct值進行測定，取平均數(shù)，以β-actin作為內(nèi)參照，并用2–ΔΔCt法計算各mRNA表達量。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Tab.1 Primer sequences for RT-qPCR

1.9 Western blotting檢測BDNF、GDNF和CNTF蛋白表達水平 將各組小鼠黑質(zhì)紋狀體組織加入RIPA(1:100)在4 ℃條件下充分裂解提取腦蛋白，BCA法測定蛋白含量。加Loading buffer制備蛋白上樣緩沖液樣品，用10% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂奶粉室溫搖床上封閉1 h，TBST洗滌3次，分別加入BDNF、CNTF和GDNF抗體(1:1000)，4 ℃過夜。次日用TBST洗滌后加入相應的HRP偶聯(lián)二抗(1:5000)，室溫孵育2 h。TBST洗膜后加ECL化學發(fā)光液(A:B=1:1)，用化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)進行化學發(fā)光反應曝光條帶，用Bio-Rad凝膠成像分析儀檢測條帶，ImageJ軟件進行灰度值比較，并進行統(tǒng)計分析。

1.10 統(tǒng)計學處理 采用Prism 8.0.2軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＆lt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 五子衍宗丸對MPTP誘導的PD小鼠運動障礙的影響 步態(tài)實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，PD模型組小鼠左前爪、右前爪、左后爪和右后爪向前運動的擺動時間均明顯增多(P＆lt;0.001)；與PD模型組比較，PD+WYP組小鼠左前爪、右前爪、左后爪和右爪后向前運動的擺動時間均明顯減少(P＆lt;0.05，圖1A)。爬桿實驗結(jié)果顯示，與對照組比較，PD模型組小鼠爬桿時間明顯增多(P＆lt;0.001)；與PD模型組比較，PD+WYP組小鼠爬桿時間明顯減少(P＆lt;0.001，圖1B)。

圖1 五子衍宗丸對MPTP誘導的PD小鼠運動障礙的影響Fig.1 Effect of WYP on mitigating of movement disorder in gait experiment of PD mice induced by MPTP

2.2 五子衍宗丸對MPTP誘導的PD小鼠DA能神經(jīng)元的影響 免疫熒光染色結(jié)果顯示，與對照組比較，PD模型組TH陽性神經(jīng)元呈散在排列且數(shù)量明顯較少(P＆lt;0.001)；與PD模型組比較，PD+WYP組TH陽性細胞數(shù)量明顯增多(P＆lt;0.01，圖2A)。Western blotting檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，PD模型組小鼠TH蛋白表達水平明顯降低(P＆lt;0.01)；與PD模型組比較，PD+WYP組TH蛋白表達水平明顯增高(P＆lt;0.05，圖2B)。

圖2 免疫熒光法(A)和Western blotting(B)檢測PD小鼠多巴胺能神經(jīng)元中TH的表達水平Fig.2 Expression levels of TH in dopamine neurons of PD mice (A.Immunofluorescence staining; B.Western blotting)

2.3 五子衍宗丸對MPTP誘導的PD小鼠腦內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌的影響 Western blotting檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，PD模型組BDNF、GDNF和CNTF蛋白表達水平均明顯降低(P＆lt;0.05)；與PD模型組比較，PD+WYP組BDNF、GDNF和CNTF蛋白表達水平均明顯增高(P＆lt;0.05，圖3)。

圖3 Western blotting檢測各組小鼠腦內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF、GDNF和CDNF的表達水平Fig.3 Expression levels of BDNF, GDNF and CDNF in each group of mice (Western blotting)

2.4 五子衍宗丸對PD小鼠DA能神經(jīng)元的抗凋亡作用 RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，PD模型組Bcl-2mRNA表達水平明顯降低(P＆lt;0.05)，Bax、caspase-3和caspase-9的mRNA表達水平明顯增高(P＆lt;0.01)；與PD模型組比較，PD+WYP組Bcl-2mRNA表達水平明顯升高(P＆lt;0.01)，Bax、caspase-3和caspase-9的mRNA表達水平明顯降低(P＆lt;0.05，圖4)。

圖4 RT-qPCR檢測各組小鼠腦內(nèi)Bcl-2、Bax、caspase-3及caspase-9的mRNA表達水平Fig.4 Expression levels of mRNA of Bcl-2, Bax, caspase-3 and caspase-9 in each group of mice(RT-qPCR)

3 討 論

PD是一種較常見的神經(jīng)退行性疾病，以選擇性中腦黑質(zhì)DA能神經(jīng)元變性和缺失及運動障礙為主要特征。該病病因復雜，發(fā)病機制尚不明確，線粒體損傷、氧化應激、神經(jīng)炎癥、蛋白質(zhì)錯誤折疊、神經(jīng)營養(yǎng)因子保護等均有可能參與PD的發(fā)病和進展，目前尚無有效的臨床治療方法[10]。中醫(yī)理論認為，PD屬中醫(yī)學的“顫證”范疇，其病因病機復雜，其中一種證型是腎精損耗，不能滋養(yǎng)肝木，筋脈失于濡養(yǎng)，木燥生風發(fā)顫[5]。故可用補腎復方來治療PD。

五子衍宗丸出自唐代的《道藏·懸解錄》，由枸杞子、菟絲子(炒)、覆盆子、五味子(蒸)、車前子(鹽炒)組成，是補腎益精之良方。枸杞子滋補肝腎，益精明目；菟絲子補益肝腎，固精縮尿；覆盆子固精縮尿，養(yǎng)肝明目；五味子補肝腎，收斂，澀精止遺；車前子利水滲濕；五藥合用達補腎益精之功效?，F(xiàn)代藥理研究顯示，五子衍宗丸具有治療部分神經(jīng)系統(tǒng)疾病的作用[7,11]，可減少炎性因子的分泌，從而保護中樞神經(jīng)系統(tǒng)，延緩實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠的發(fā)病[12]。

MPTP可透過血腦屏障轉(zhuǎn)化為高毒性的MPP+，并選擇性進入黑質(zhì)DA能神經(jīng)元內(nèi)，導致致密部DA能神經(jīng)元程序性死亡，是建立經(jīng)典PD動物模型時使用較多的神經(jīng)毒素[13]。

運動遲緩和整體運動能力下降是PD患者常見的行為學表現(xiàn)。在本研究中，PD小鼠表現(xiàn)出明顯的運動功能異常，包括四肢向前運動的擺動時間和爬桿時間均增多，提示PD小鼠在運動時反應更慢或者需要更長時間才能完成制動。本研究中免疫熒光染色結(jié)果顯示，PD小鼠出現(xiàn)了DA能神經(jīng)元的損傷和丟失；PD小鼠腦黑質(zhì)紋狀體中TH蛋白的表達水平也明顯降低。這一結(jié)果與我們的前期研究結(jié)果一致，提示成功建立了MPTP導致的PD小鼠模型。經(jīng)五子衍宗丸治療后，PD小鼠四肢向前運動的擺動時間和爬桿時間均減少，且黑質(zhì)紋狀體中TH蛋白表達增高，提示五子衍宗丸對DA神經(jīng)元具有保護作用。綜上所述，本研究結(jié)果表明，五子衍宗丸可減輕DA能神經(jīng)元損傷，進而改善PD小鼠的運動障礙。在此基礎(chǔ)上，本研究進一步觀察了五子衍宗丸對PD小鼠腦黑質(zhì)紋狀體區(qū)神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌及細胞凋亡的影響。

神經(jīng)營養(yǎng)因子是支持神經(jīng)元發(fā)育、成熟和存活的小分泌蛋白。研究顯示，神經(jīng)營養(yǎng)因子可以保護DA能神經(jīng)元，促進神經(jīng)退行性疾病中丟失的某些神經(jīng)元群的存活或再生[14-15]。BDNF是一種在機體內(nèi)分布廣泛的神經(jīng)營養(yǎng)因子，在小鼠黑質(zhì)致密部DA能神經(jīng)元的維持中起關(guān)鍵作用[16]。近年研究顯示，BDNF與多種神經(jīng)血管疾病有密切關(guān)聯(lián)[17]。GDNF在全身各種組織發(fā)育的不同階段及神經(jīng)損傷后的不同階段均有不同程度的表達[18]。Deng等[19]報告，共移植過表達GDNF的神經(jīng)干細胞和胎兒DA能神經(jīng)元的效果優(yōu)于神經(jīng)干細胞和胎兒DA能神經(jīng)元移植，前者移植細胞存活率明顯增高，能更有效地緩解PD大鼠的運動癥狀，說明過表達的GDNF和胎兒DA能神經(jīng)元具有協(xié)同作用，可促進干細胞存活及向DA能神經(jīng)元分化，這也提示GDNF在保護和促進神經(jīng)元發(fā)育中有重要作用。CNTF對DA能神經(jīng)元也有營養(yǎng)、保護和促進其存活的作用[20]。CNTF受體α可阻止DA能神經(jīng)元的活性退化并促進其功能恢復[21]。在本研究中，經(jīng)五子衍宗丸治療后，MPTP誘導的PD小鼠腦內(nèi)黑質(zhì)紋狀體區(qū)BDNF、GDNF和CNTF的表達均明顯增高，提示五子衍宗丸可誘導神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌，進而保護DA能神經(jīng)元。

細胞凋亡是PD神經(jīng)元死亡的主要機制[22]。細胞凋亡指機體內(nèi)發(fā)生的涉及一系列基因激活、表達及調(diào)控的細胞自主死亡過程，主要受凋亡誘導因子和凋亡抑制因子共同調(diào)控。Bcl-2家族和caspase家族被認為是PD中細胞凋亡的關(guān)鍵標志[23]。Bcl-2基因家族是一類重要的凋亡調(diào)控基因，分為抗凋亡基因(如Bcl-2、Bcl-1、Bcl-xL等)和促凋亡基因(如Bax、Bak、Bad、Bid等)兩大類[24]。Caspase家族是細胞凋亡的中心環(huán)節(jié)，活化的凋亡啟動因子caspase-9激活下游的凋亡執(zhí)行因子caspase-3，抑制多聚ADP-核糖聚合酶活性，增強核酸內(nèi)切酶的活性，導致DNA片段化，引起細胞凋亡。已在PD患者的黑質(zhì)中檢測到活化的caspase-3[25]。研究顯示，敲除caspase-3可抑制MPTP誘導的PD小鼠黑質(zhì)細胞凋亡[26]。本研究結(jié)果顯示，MPTP誘導的PD小鼠腦黑質(zhì)紋狀體中促凋亡基因Bax、caspase-3、caspase-9表達水平增高，抗凋亡基因Bcl-2表達降低，而五子衍宗丸治療后部分逆轉(zhuǎn)了上述變化，提示五子衍宗丸可能通過調(diào)控上述凋亡基因的表達而抑制PD小鼠DA能神經(jīng)元的凋亡，起到防治PD的作用。

綜上，五子衍宗丸對MPTP誘導的PD小鼠具有神經(jīng)保護作用，可顯著改善PD小鼠的運動表現(xiàn)，其作用可能是通過增加黑質(zhì)紋狀體神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌及調(diào)控凋亡相關(guān)的基因表達而實現(xiàn)的。但五子衍宗丸治療PD的具體機制，以及是否還參與其他生物學過程尚不清楚，有待后續(xù)進一步研究和探討。