雙酚A通過(guò)氧化應(yīng)激干擾小鼠卵母細(xì)胞體外成熟

萬(wàn)遼，王爽，于金紅，丁婧如，鄒清，王喜艷*

1吉林醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林省 吉林市 132013；2吉林醫(yī)藥學(xué)院形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，吉林省 吉林市 132013；3吉林醫(yī)藥學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，吉林省 吉林市 132013；4吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，吉林省 吉林市 132013

雙酚A(bisphenol A，BPA)是一種常見(jiàn)的工業(yè)化合物，廣泛存在于食品包裝材料等多種日常生活用品中[1]，可隨食物等進(jìn)入人體。由于與人體的廣泛接觸，BPA對(duì)人體可能產(chǎn)生的不良影響日益受到關(guān)注。大量研究顯示BPA對(duì)女性生殖功能有干擾和損傷作用，尤其是干擾卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟。例如，BPA可干擾紡錘體的正常形態(tài)，進(jìn)而嚴(yán)重干擾減數(shù)分裂進(jìn)程，抑制卵母細(xì)胞的成熟[2-3]；BPA也可能通過(guò)其他途徑如氧化應(yīng)激損傷途徑干擾卵母細(xì)胞的成熟[4-6]。但是，以小鼠為研究對(duì)象的關(guān)于BPA對(duì)于抗氧化酶表達(dá)的相關(guān)研究結(jié)果尚存在爭(zhēng)議。本研究在小鼠卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中添加BPA，統(tǒng)計(jì)卵母細(xì)胞成熟率并檢測(cè)卵母細(xì)胞中活性氧(reactive oxygen species，ROS)的水平，同時(shí)檢測(cè)抗氧化酶的表達(dá)水平，探究BPA可能引起的小鼠卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，旨在為BPA是否干擾卵母細(xì)胞抗氧化酶表達(dá)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雌性性成熟ICR小鼠40只，清潔級(jí)，購(gòu)自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(吉)2021-0001]。實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合國(guó)家和單位有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的管理和使用規(guī)定。

1.2 小鼠卵母細(xì)胞體外成熟 注射孕馬血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin，PMSG)46 h后，采用頸椎脫臼法處死小鼠；取雙側(cè)卵巢置于含10%胎牛血清(FBS)的操作液中，體視顯微鏡下用1 ml注射器去除卵巢周圍的組織，然后用1 ml注射器刺破卵巢中的大卵泡，使卵丘復(fù)合體(cumulus-oocyte complexes，COCs)游離出來(lái)；將完整的COCs隨機(jī)分為對(duì)照組、二甲基亞砜(DMSO)組和BPA組，分別移入50 μl普通的α-MEM培養(yǎng)液[12571-063，美國(guó)Gibco公司，含5% FBS、0.1 U/ml促卵泡激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)、7.5 U/ml 人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)和0.2 mmol/L丙酮酸鈉]、含有0.1% DMSO或45 μmol/L BPA的α-MEM培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)16～18 h，用透明質(zhì)酸酶消化掉顆粒細(xì)胞，獲取卵母細(xì)胞；統(tǒng)計(jì)卵母細(xì)胞成熟率[處于第二次減數(shù)分裂中期(metaphase of the second meiosis，MⅡ)細(xì)胞的占比]。

1.3 DCFH-DA探針試劑盒檢測(cè)卵母細(xì)胞中ROS水平 取3組MⅡ期和BPA組生發(fā)泡期(germinal vesicle,GV)卵母細(xì)胞，移入1:1000稀釋的DCFH-DA探針中；另設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組，將活性氧陽(yáng)性對(duì)照刺激液(Rosup)按1:1000的比例稀釋于DCFH-DA探針稀釋液(1:1000)中，取對(duì)照組MⅡ期卵母細(xì)胞移入稀釋的Rosup液中。各組卵母細(xì)胞均在37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min；每隔3～5 min混勻一下，使探針和細(xì)胞充分接觸；然后用D-PBS(pH 7.0～7.2)洗3次，5 min/次，移入5 μg/ml Hochest 33342染色液中室溫孵育15 min。最后將卵母細(xì)胞移到載玻片上，在共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.4 免疫熒光法檢測(cè)卵母細(xì)胞中抗氧化酶的表達(dá)水平 取3組MⅡ期和BPA組GV期卵母細(xì)胞，將卵母細(xì)胞在4%多聚甲醛溶液中室溫固定30 min，用含0.1% PVP的D-PBS(pH 7.0～7.2)洗3次，5 min/次，然后將卵母細(xì)胞移入含0.5% TritonX-100的PBS中，室溫孵育1 h，再移入封閉液(2% BSA)中室溫封閉1 h。將卵母細(xì)胞移入兔源的過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)、超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1，SOD1)、超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2，S O D 2)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4(g l u t a t h i o n e perox idase 4，GPX4)抗體(A11777、A0274、A1340、A1933，武漢ABclonal生物科技有限公司)中4 ℃過(guò)夜孵育。次日用PBST(pH 7.0～7.2)洗滌3次后，將卵母細(xì)胞移到FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗(AS011，武漢ABclonal生物科技有限公司)中37 ℃孵育1 h，5 μg/ml Hochest 33342染色液中室溫孵育15 min。最后將卵母細(xì)胞移到載玻片上，在共聚焦顯微鏡下觀察拍照。重復(fù)3次后用 Image pro-Plus 6.0軟件對(duì)圖像進(jìn)行熒光強(qiáng)度值分析。

1.5 Western blotting檢測(cè)卵母細(xì)胞中抗氧化酶的表達(dá)水平 取3組MⅡ期和BPA組GV期卵母細(xì)胞各60個(gè)，置于10 μl Laemmli 緩沖液中溶解并全部上樣，100 V恒壓電泳約90 min，300 mA濕轉(zhuǎn)膜45 min，5%脫脂奶粉封閉1 h，然后將膜在兔源的CAT、SOD1、SOD2、GPX4抗體和β-actin抗體(A11777、A0274、A1340、A1933、AC026，武漢ABclonal生物科技有限公司)中4 ℃過(guò)夜孵育。次日，將膜在辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗(AS014，武漢ABclonal生物科技有限公司)中室溫孵育1 h。然后，將轉(zhuǎn)有蛋白的PVDF膜放入Tanon 4600成像系統(tǒng)中，覆上增強(qiáng)顯影液，用Tanon Imaging System軟件進(jìn)行拍照。重復(fù)3次后用 ImageJ軟件對(duì)圖像進(jìn)行灰度值分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＆lt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BPA處理對(duì)小鼠卵母細(xì)胞成熟率的影響 小鼠卵母細(xì)胞體外成熟16～18 h后獲取卵母細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與對(duì)照組和DMSO組比較，BPA組卵母細(xì)胞成熟率明顯降低(P＆lt;0.05，表1)。

表1 BPA對(duì)小鼠卵母細(xì)胞體外成熟率的影響(n=9)Tab.1 Effect on maturation rate of mouse oocytes exposure to BPA in vitro (n=9)

2.2 BPA處理對(duì)小鼠卵母細(xì)胞中ROS水平的影響

DCFH-DA探針試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組和DMSO組的MⅡ期卵母細(xì)胞比較，BPA組MⅡ期和GV期小鼠卵母細(xì)胞中ROS水平均明顯增高(P＆lt;0.05，圖1)。

圖1 DCFH-DA探針?lè)z測(cè)小鼠卵母細(xì)胞中ROS水平(n=3)Fig.1 Levels of ROS in mouse oocytes measured with DCFH-DA probe (n=3)

2.3 BPA處理對(duì)小鼠卵母細(xì)胞中抗氧化酶CAT和SOD2表達(dá)水平的影響 采用免疫熒光染色和Western blotting同時(shí)檢測(cè)CAT、SOD1、SOD2和GPX4的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與對(duì)照組和DMSO組的MⅡ期卵母細(xì)胞比較，BPA組MⅡ期和GV期卵母細(xì)胞中CAT和SOD2表達(dá)水平均明顯降低(P＆lt;0.05，圖2)；免疫熒光法和Western blotting均未檢測(cè)到3組卵母細(xì)胞中SOD1和GPX4蛋白的表達(dá)。

圖2 BPA對(duì)小鼠卵母細(xì)胞中抗氧化酶CAT和SOD2表達(dá)的影響(n=3)Fig.2 Effects on the expressions of antioxidant enzyme CAT and SOD2 in mouse oocytes exposure to BPA in vitro (n=3)

3 討 論

BPA是一種廣泛存在的內(nèi)分泌干擾物，常用于食品包裝袋、礦泉水瓶等塑料產(chǎn)品中，這些塑料產(chǎn)品中的少量BPA可逐漸釋放到食物中并隨食物進(jìn)入人體。BPA的結(jié)構(gòu)與己烯雌酚類似，作為一種外源性雌激素類似物進(jìn)入體內(nèi)后，與其他人工合成的雌激素類似，在肝內(nèi)代謝較慢；大部分BPA可在血液中與雌激素結(jié)合球蛋白結(jié)合，隨血液循環(huán)進(jìn)入雌激素的靶器官而發(fā)揮類雌激素作用。研究顯示，BPA可嚴(yán)重影響生殖功能和發(fā)育過(guò)程[7-9]，尤其是干擾女性生殖功能，包括干擾減數(shù)分裂[2]、胚胎發(fā)育[10]、激素生成[11]和后代的雌性比例。近年的研究顯示，BPA可引起睪丸的氧化應(yīng)激損傷而影響男性生殖功能[12-14]，而BPA干擾女性生殖功能是否也與氧化應(yīng)激損傷有關(guān)越來(lái)越受到關(guān)注。

在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中，ROS作為卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞新陳代謝的中間產(chǎn)物和第二信使而自然產(chǎn)生[16-17]。但是，ROS生成增加可引起細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，后者可降低DNA自我修復(fù)能力、擾亂細(xì)胞周期進(jìn)程，甚至引發(fā)細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，BPA可導(dǎo)致卵母細(xì)胞中ROS生成增多，過(guò)多的ROS可抑制卵母細(xì)胞成熟，與既往研究結(jié)果[18-19]一致。

關(guān)于BPA影響抗氧化酶表達(dá)的研究結(jié)果目前仍存在一定爭(zhēng)議[5,18]。以豬卵母細(xì)胞為研究對(duì)象的結(jié)果較為一致，均顯示在卵母細(xì)胞內(nèi)ROS含量增高的同時(shí)，抗氧化酶的表達(dá)也增高[4,20]。以小鼠卵母細(xì)胞為對(duì)象的研究結(jié)果則不一致。Alireza等[21]的研究顯示，連續(xù)21 d皮下注射50 μg/(kg.d)或100 μg/(kg.d)的BPA替代物雙酚S(bisphenol S，BPS)，可致卵巢組織內(nèi)抗氧化酶CAT、SOD和GPX的表達(dá)明顯下降；但Ding等[5]的研究顯示，在小鼠卵母細(xì)胞體外成熟過(guò)程中接觸100 μmol/L的BPA替代物雙酚AF(bisphenol AF，BPAF)可導(dǎo)致卵母細(xì)胞內(nèi)SOD2水平顯著升高。上述兩項(xiàng)研究給予小鼠BPA替代物的途徑不同，且前者檢測(cè)的是整個(gè)卵巢組織而非卵母細(xì)胞中的抗氧化酶的表達(dá)水平，后者僅檢測(cè)了卵母細(xì)胞內(nèi)SOD2的表達(dá)水平，未報(bào)告其他過(guò)氧化酶的表達(dá)情況。鑒于BPA對(duì)小鼠卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷尤其是對(duì)抗氧化酶的影響研究較少，且結(jié)果并不一致，本研究再次探討了BPA在小鼠卵母細(xì)胞體外成熟中產(chǎn)生的氧化應(yīng)激損傷，采用免疫熒光和Western blotting兩種方法著重觀察抗氧化酶的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，BPA導(dǎo)致小鼠卵母細(xì)胞中抗氧化酶CAT和SOD2的表達(dá)明顯下降，而小鼠卵母細(xì)胞中均未檢測(cè)到SOD1和GPX4的表達(dá)。因此推測(cè)45 μmol/L BPA對(duì)于小鼠卵母細(xì)胞中抗氧化酶CAT和SOD2的表達(dá)具有抑制作用，但抑制作用是發(fā)生在基因轉(zhuǎn)錄還是翻譯階段尚待進(jìn)一步研究；人正常卵母細(xì)胞中是否表達(dá)SOD1和GPX4也有待觀察。

本研究還發(fā)現(xiàn)，45 μmol/L BPA可將小鼠卵母細(xì)胞阻滯在GV期，提示BPA能干擾卵母細(xì)胞第一次減數(shù)分裂的恢復(fù)，導(dǎo)致卵母細(xì)胞未發(fā)生生發(fā)泡破裂(GVBD)；另外，與對(duì)照組比較，接觸45 μmol/L BPA后未被阻滯而進(jìn)入MⅡ期的卵母細(xì)胞中ROS水平顯著增高，且CAT和SOD2的表達(dá)顯著降低，提示接觸BPA未被阻滯而獲得的MⅡ期卵母細(xì)胞存在氧化應(yīng)激損傷，可能導(dǎo)致卵母細(xì)胞的早期凋亡或影響其受精和胚胎發(fā)育能力，但其受影響程度有待進(jìn)一步觀察與研究。

總之，本研究顯示，BPA可通過(guò)氧化應(yīng)激損傷途徑抑制小鼠卵母細(xì)胞的體外成熟，為BPA抑制抗氧化酶表達(dá)的觀點(diǎn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。45 μmol/L BPA抑制抗氧化酶表達(dá)的機(jī)制及其是否會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞凋亡或受精和早期胚胎發(fā)育能力異常尚待進(jìn)一步研究。