過表達miR-378a修飾骨髓間充質(zhì)干細胞復(fù)合膠原蛋白海綿支架對大鼠股骨缺損的修復(fù)作用

孫皓，蒲胤瑄，劉佳林，吾凡別克·巴合提，都曼別克·阿曼臺，韓祥禎，何惠宇*

1新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院(附屬口腔醫(yī)院)口腔修復(fù)種植科，新疆烏魯木齊 830054；2新疆維吾爾自治區(qū)口腔醫(yī)學(xué)研究所，新疆烏魯木齊 830054；3西南醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔種植科，四川瀘州 646000；4新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院口腔科，新疆烏魯木齊 830001

骨缺損修復(fù)是近年臨床與基礎(chǔ)研究的熱點，但目前的骨缺損修復(fù)材料在成血管和成骨能力方面仍存在不足[1]。骨組織工程研究的領(lǐng)域主要包括細胞因子、種子細胞和支架材料，其中骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs)是骨組織工程領(lǐng)域中常用的種子細胞，具有多向分化潛能，能夠向骨、脂肪及血管等方向分化，且自體移植不引起排斥反應(yīng)[2]。種子細胞在形成組織之前生存并依附于組織工程支架材料上，而低免疫原性和高生物相容性等生物學(xué)性能良好的膠原蛋白海綿(collagen sponge，CS)常被用作組織工程支架[3]，內(nèi)含的Ⅰ型膠原基質(zhì)能夠通過整合素促進BMMSCs的黏附、增殖及向成骨細胞分化[4]?，F(xiàn)已明確，微小RNA(microRNA，miRNA)對骨細胞的生長、分化和功能均具有重要的調(diào)節(jié)作用。有研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-214、miRNA-155和miRNA-378可調(diào)控骨和血管的生成過程，其中miRNA-214可通過靶向Osterix 22(一種成骨細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子)來抑制C2C12成肌細胞的成骨分化，miR-155可通過下調(diào)小鼠前成骨細胞中SMAD同源物5(SMAD5)的翻譯來抑制成骨細胞分化的作用[5-6]，而miRNA-378被證實是骨再生的成骨-血管生成偶聯(lián)的理想靶標，并已成為調(diào)節(jié)成骨和血管生成的關(guān)鍵因素[7]。本課題組前期已證實，過表達miR-378a可促進BMMSCs膜片的體外成骨及成血管能力[8]。本研究在此基礎(chǔ)上將過表達miR-378a修飾的BMMSCs與CS支架復(fù)合后應(yīng)用于大鼠股骨缺損模型中，旨在探究過表達miR-378a在體內(nèi)修復(fù)骨缺損的能力。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(美國Gibco公司)，抗-Osteopontin(ab63856，美國Abcam公司)，LV-rno-miR-378a慢病毒載體、陰性對照病毒(ON137，hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRESpuromycin，上海吉凱基因有限公司)，蘇木素染液、封閉用山羊血清(北京中杉金橋公司)，伊紅染液(北京Solaibio公司)，Masson染色試劑盒(北京Solaibio公司)，CS(北京湃生生物科技有限公司)。熒光倒置顯微鏡(LASAF-CIP-HWS3LEICA，德國Leica公司)，微型CT掃描儀(AX2000，西安奧云電子科技有限公司)，骨鉆(德國Kavo公司)，切片機、脫水機、包埋機(德國Leica公司)。

1.2 實 驗 動 物 2 0 只S P F 級S D 雄 性 大 鼠 購自新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，許可證號：SCXK(新)2016-0003。其中5只4周齡大鼠用于原代細胞提取，體重80～100 g，15只8周齡大鼠用于動物實驗，體重2 5 0～2 8 0 g。本實驗經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物倫理委員會批準(IACUC-2021902-02)，實驗過程中對動物的所有操作均嚴格參照《實驗動物的護理和使用指南》進行。實驗前所有大鼠自由攝食、飲水，在相同條件下飼養(yǎng)，保持室溫(20±2) ℃，相對濕度40%～60%，每3 d更換一次鼠盒。

1.3 實驗方法

1.3.1 BMMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定 將5只4周齡的SD雄性大鼠脫頸椎處死，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)行全骨髓法培養(yǎng)BMMSCs。接種3 d后首次換液，以后每2 d換液一次，倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)，待細胞生長至90%融合時消化，并按1:2比例傳代，培養(yǎng)至第3代，采用流式細胞術(shù)鑒定細胞表型(CD44、CD29、CD45、CD34)后進行相關(guān)實驗。

1.3.2 慢病毒轉(zhuǎn)染BMMSCs及轉(zhuǎn)染效率檢測 取生長良好的第3代BMMSCs，加入感染復(fù)數(shù)(MOI)值=20的相應(yīng)病毒量，并添加感染增強P液行細胞轉(zhuǎn)染，將細胞分為3組：過表達miR-378a轉(zhuǎn)染BMMSCs組(LV-miR-378a組)，陰性對照慢病毒轉(zhuǎn)染BMMSCs組(LV-miR-NC組)，未轉(zhuǎn)染BMMSCs組(對照組)。采用流式細胞術(shù)檢測各組慢病毒EGFP基因的表達率。

1.3.3 掃描電鏡觀察細胞與支架的相容性 將無菌CS裁成3 mm(直徑)×2 mm(高)大小，放入24孔板內(nèi)，培養(yǎng)液平衡后待用。調(diào)整LV-miR-378a組及LV-miR-NC組細胞密度為1×105個/ml。按照細胞懸液反復(fù)滴加的方法，將0.1 ml混合懸液均勻分布于CS上，將細胞-支架復(fù)合物置于37 ℃、5% CO2恒溫箱中靜置4 h，加入10% α-MEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d換液一次。

1.3.4 骨缺損模型的建立及分組 選取15只8周齡SD大鼠，隨機分為3組(n=5)：LV-miR-378a+CS組(植入過表達miR-378a慢病毒轉(zhuǎn)染的BMMSCs復(fù)合CS支架)、LV-miR-NC+CS組(植入陰性空載慢病毒轉(zhuǎn)染的BMMSCs復(fù)合CS支架)、CS組(植入CS支架)。各組大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉，備皮，固定，使股骨外側(cè)面充分暴露后，鋪置洞巾，碘伏消毒，于左側(cè)股骨皮膚處切一條長約3 cm的切口，鈍性分離直至股骨面，于股骨外側(cè)中區(qū)使用低速骨鉆制備直徑約3 mm、深2 mm的圓形缺損，缺損深度達骨髓腔，但不穿過對側(cè)皮質(zhì)骨。LV-miR-378a+CS組與LV-miR-NC+CS組分別放置各組支架復(fù)合物，CS組單純放入支架，然后逐層嚴密縫合關(guān)閉創(chuàng)口。術(shù)后8周使用CO2吸入法處死各組大鼠，取手術(shù)側(cè)股骨樣本進行檢測。

1.3.5 大體觀察 于術(shù)后8周取各組股骨樣本進行大體觀察，檢查是否出現(xiàn)感染壞死和炎癥反應(yīng)，以及缺損區(qū)新骨形成情況等。

1.3.6 微型CT掃描重建 將術(shù)后8周各組股骨樣本以骨缺損處為中心，使用微型CT掃描(電壓：90 kV，電流：80 μA，分辨率：10 μm，曝光時間：600 ms)并進行三維重建。定量分析LV-miR-378a+CS組、LV-miR-NC+CS組及CS組感興趣區(qū)的骨密度(bone mineral density，BMD)與骨體積分數(shù)(bone volume/total volume，BV/TV)，檢驗骨修復(fù)情況。

1.3.7 HE、Masson及免疫組化染色觀察 于術(shù)后8周取各組股骨樣本，置于40 g/L多聚甲醛溶液中固定，10%EDTA脫鈣液脫鈣，骨組織變軟后制作石蠟切片，行HE、Masson及骨橋蛋白免疫組化染色，并在光學(xué)顯微鏡下觀察新骨的形成情況。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad Prism 9.0和SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料使用Shapiro-Wilk法檢驗數(shù)據(jù)是否具有正態(tài)性，符合正態(tài)分布者以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；不符合者則采用非參數(shù)檢驗(Kruskal-Wallis秩和檢驗)。P＆lt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BMMSCs培養(yǎng)及鑒定結(jié)果 取生長良好的第3代BMMSCs，在倒置顯微鏡下觀察，見其生長密集并呈紡錘形集落。流式細胞術(shù)檢測細胞表面抗原CD44陽性表達率為95.5%，CD29陽性表達率為94.7%，而CD45陽性表達率為0.8%，CD34陽性表達率為0.7%(圖1)。

圖1 第3代BMMSCs光鏡下觀察大鼠(A，×50)與細胞表型鑒定(B)Fig.1 Microscopic image (A, ×50) of the 3rd generation BMMSCs of rat and identification of cell phenotype (B)BMMSCs.骨髓間充質(zhì)干細胞

2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染效率檢測結(jié)果 LV-miR-378a組、LV-miR-NC組及對照組的轉(zhuǎn)染效率分別為85.7%、85.8%及0，與對照組比較，LV-miR-378a組及LVmiR-NC組轉(zhuǎn)染效率明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＆lt;0.05)，而LV-miR-378a組與LV-miR-NC組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＆gt;0.05)(圖2)。

2.3 掃描電鏡觀察細胞與支架的相容性結(jié)果 將LV-miR-378a組與LV-miR-NC組細胞與CS支架材料共培養(yǎng)7 d后使用掃描電鏡觀察，低倍鏡下可見CS組CS支架材料具有良好的三維空洞結(jié)構(gòu)，高倍鏡下可見LV-miR-378a組與LV-miR-NC組細胞均可黏附生長在支架材料上并分泌細胞外基質(zhì)(ECM)，但LVmiR-378a組細胞較LV-miR-NC組在支架材料表面鋪展的區(qū)域更大，細胞呈團簇狀生長，伸出的偽足更多，呈聚集性分布在材料的表面或空隙內(nèi)(圖3)。

圖3 共培養(yǎng)7 d后各組細胞與支架復(fù)合材料掃描電鏡觀察結(jié)果Fig.3 Scanning electron microscopic results of composite materials of cells and scaffolds in each group 7 days after coculture

2.4 股骨標本大體觀察結(jié)果 術(shù)后8周各組骨缺損區(qū)域均呈閉合狀態(tài)，可見LV-miR-378a+CS組骨缺損區(qū)修復(fù)較為完全，缺損區(qū)礦化的骨質(zhì)與正常骨組織連續(xù)且顏色與質(zhì)地較一致，缺損輪廓也已消失；而LV-miR-NC+CS組及CS組骨缺損區(qū)修復(fù)尚未完全，缺損中心可觀察到未完全礦化的新生骨質(zhì)，且CS組仍可見缺損區(qū)大致輪廓(圖4)。

圖4 術(shù)后8周各組大鼠股骨樣本大體觀察結(jié)果Fig.4 Gross observation of femoral samples of rats in each group 8 weeks after surgery

2.5 微型CT掃描重建結(jié)果 微型CT掃描各組術(shù)后8周股骨標本并進行三維重建，結(jié)果顯示，3組骨缺損區(qū)均可見新生骨質(zhì)，其中LV-miR-378a+CS組骨缺損區(qū)較其余兩組修復(fù)效果更好，新骨沉積量較多，骨質(zhì)愈合連續(xù)，密度均一；LV-miR-NC+CS組及CS組缺損區(qū)均未完全修復(fù)；而CS組新骨沉積量較少，密度不均一(圖5A)。相關(guān)參數(shù)定量分析結(jié)果顯示，LV-miR-378a+CS組BMD及BV/TV值均明顯高于其余兩組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＆lt;0.05)，且LV-miRNC+CS組BMD及BV/TV值均明顯高于CS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＆lt;0.05)(圖5B)。

圖5 微型CT掃描重建分析各組大鼠術(shù)后8周骨缺損修復(fù)情況Fig.5 Analysis of bone defect repair of rat in each group 8 weeks after operation (micro CT scanning reconstruction)

2.6 骨缺損區(qū)HE及Masson染色結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示，術(shù)后8周LV-miR-378a+CS組支架材料完全降解，可見較多成熟骨小梁，新生骨與宿主骨交界區(qū)連續(xù)性較好；LV-miR-NC+CS組成熟骨小梁相對較少，新生骨與宿主骨交界區(qū)未完全相連；CS組支架材料未完全降解，處于改建重塑中的骨小梁仍較多，新生骨與宿主骨交界區(qū)骨小梁排列紊亂(圖6A)。Masson染色結(jié)果與HE染色結(jié)果一致，與LV-miR-NC+CS組相比，LV-miR-378a+CS組骨缺損區(qū)骨小梁較致密，彼此連接且形態(tài)規(guī)則；CS組骨缺損區(qū)中有較多不規(guī)則的新生骨小梁(圖6B)。

圖6 術(shù)后8周各組大鼠骨缺損區(qū)HE(A)及Masson(B)染色結(jié)果Fig.6 Histological hematoxylin-eosin (A) and Masson (B) staining results in bone defect area of rats in each group 8 weeks after operation

2.7 骨橋蛋白免疫組化染色結(jié)果 骨缺損區(qū)骨橋蛋白免疫組化染色結(jié)果顯示，術(shù)后8周CS組骨小梁棕染表達強于其余兩組，可見骨橋蛋白強陽性表達；與CS組比較，LV-miR-NC+CS組只在部分骨缺損處可見骨橋蛋白陽性表達，而LV-miR-378a+CS組新生骨組織礦化程度較高，成熟骨小梁較多，因成骨細胞數(shù)量相對較少，骨橋蛋白陽性表達較少(圖7A)。定量分析結(jié)果顯示，與CS組比較，LVmiR-378a+CS組及LV-miR-NC+CS組骨橋蛋白陽性表達率降低(P＆lt;0.001或P＆lt;0.05)，且LV-miR-378a+CS組陽性表達率低于LV-miR-NC+CS組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＆lt;0.01)(圖7B)。

圖7 術(shù)后8周各組大鼠骨缺損區(qū)骨橋蛋白免疫組化染色結(jié)果Fig.7 Immunohistochemical stain of osteopontin in bone defect area of rats in each group 8 weeks after operation

3 討 論

由創(chuàng)傷、先天畸形或其他疾病引起的骨缺損已成為臨床工作者和科研人員研究的熱點。骨組織工程是一種有效的骨再生方法，能通過使用合適的支架材料、可行的種子細胞和生物活性因子組合來制造新的功能性骨組織，細胞和生物活性因子接種到生物材料支架上可創(chuàng)建人工骨移植替代物[9]，從而廣泛應(yīng)用于骨缺損的治療中。這些人工骨移植替代物可促進間充質(zhì)干細胞分泌多種生長因子和趨化因子，并提高骨缺陷再生的速度和質(zhì)量[10-11]。BMMSCs具有優(yōu)越的自我更新和多向分化能力，常作為組織工程中的種子細胞，在組織維持、修復(fù)和再生中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[12]。本研究選用BMMSCs作為種子細胞，經(jīng)流式細胞術(shù)鑒定，其抗原表型CD44、CD29陽性率均在90%以上，而CD45、CD34為低表達，所提取的細胞純度和濃度已達到標準，可用于后續(xù)實驗。研究證實，miRNA可通過多種信號通路正向或負向調(diào)節(jié)骨骼穩(wěn)態(tài)和成骨細胞的形成，且對細胞增殖、遷移和分化起著重要的調(diào)節(jié)作用[13]。研究表明，miR-7b、miR-9、miR-26a、miR-210、miR-378等可提高骨相關(guān)疾病及骨再生方面的治療潛力[14]。miR-378a是位于Ppargc1b基因中的一個內(nèi)含子miRNA，有研究發(fā)現(xiàn)其可參與MC3T3-E1細胞的分化，并在BMP2誘導(dǎo)的成骨分化中發(fā)揮作用[15]。靶基因預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，miR-378是Wnt和MAPK信號通路的交叉點[7]，且Lee等[16]發(fā)現(xiàn)，miR-378可通過靶向SuFu和Fus-1來促進細胞存活及血管生成，進而影響細胞的成骨分化。但是，未來仍需進一步探索miR-378在細胞分化過程中的靶標和發(fā)揮作用的機制。慢病毒可長期穩(wěn)定地整合到宿主DNA中，當前骨組織工程中基于miRNAs遞送系統(tǒng)的應(yīng)用研究大多使用慢病毒代替其他病毒作為基因遞送載體[17]。本研究使用感染復(fù)數(shù)值為MOI=20進行慢病毒轉(zhuǎn)染[8]，分別將過表達miR-378a的慢病毒和空載慢病毒轉(zhuǎn)染BMMSCs，流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，兩組轉(zhuǎn)染效率均＆gt;85%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＆gt;0.05)，提示兩組慢病毒均成功轉(zhuǎn)染至BMMSCs中，且轉(zhuǎn)染效能較好。

優(yōu)良的骨組織工程支架應(yīng)具有生物相容性能好、孔隙率合適、生物可降解性優(yōu)越等幾個基本因素，且必須能促進其結(jié)構(gòu)內(nèi)部的細胞生長[18-20]。Ⅰ型膠原蛋白是骨細胞外基質(zhì)的主要有機成分，可通過多種方式加工成如海綿或水凝膠等生物材料[21]。因免疫原性低和生物相容性佳等優(yōu)點，CS常被用作組織工程支架，可被細胞因子、生長因子、藥物和酶抑制劑修飾，從而具有骨誘導(dǎo)性[22]。本研究通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，CS支架呈多孔狀，具有良好的空間結(jié)構(gòu)及表面積，隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞長入孔隙內(nèi)，呈集落或團簇狀連接成片，提示該材料對細胞具有黏附作用，且因該材料具有較大的空間結(jié)構(gòu)和表面積，可以為BMMSCs提供更為廣闊的生長空間。其中，LV-miR-378a組形成的細胞集落或團簇與細胞鋪展區(qū)域更大，伸出的偽足更多，推測原因可能與過表達miR-378a修飾的BMMSCs有關(guān)。

本課題組前期研究表明，過表達miR-378a在體外實驗中表現(xiàn)出優(yōu)越的成骨與成血管能力[8]。因此，本實驗在大鼠股骨缺損處植入過表達miR-378a的BMMSCs復(fù)合CS支架，探索過表達miR-378a基因的復(fù)合物在體內(nèi)修復(fù)骨缺損的能力。術(shù)后各組大鼠并未出現(xiàn)因感染或其他原因?qū)е碌乃劳?，提示轉(zhuǎn)染慢病毒的BMMSCs及CS支架均無免疫排斥反應(yīng)，與組織有較好的相容性。術(shù)后8周，各組骨缺損處均有新生骨形成，無感染組織包繞、纖維組織溶解及壞死，且LV-miR-378a+CS組骨缺損區(qū)修復(fù)較為完全，而LV-miR-NC+CS組及CS組缺損中心仍可觀察到未完全礦化的新生骨質(zhì)，且CS組骨缺損區(qū)周圍有較多的編織骨。微型CT是測量骨骼微觀結(jié)構(gòu)的金標準，本實驗采用微型CT對缺損處進行影像學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)術(shù)后8周時，LV-miR-378a+CS組較其余兩組新生骨質(zhì)礦化重塑程度更佳，骨質(zhì)愈合連續(xù)，密度均一，且LV-miR-378a+CS組BMD及BV/TV值均高于其余兩組，提示隨著礦化時間延長，過表達miR-378a的復(fù)合支架在體內(nèi)的成骨誘導(dǎo)性能較好，而LV-miR-NC+CS組BMD及BV/TV值雖然高于CS組，但差異不大，這可能是因為LV-miR-NC+CS組中空載慢病毒轉(zhuǎn)染的BMMSCs已有部分分化為成骨細胞，而CS組只能通過自身骨生成能力愈合，因而新生骨礦化進程較慢。此外，術(shù)后8周時，采用HE及Masson染色觀察新骨礦化的組織學(xué)特性發(fā)現(xiàn)，LV-miR-378a+CS組較LV-miR-NC+CS組和CS組的骨小梁更規(guī)則，宿主骨與新生骨交界區(qū)連續(xù)性更好，且有較多成熟骨質(zhì)形成，提示過表達miR-378a的復(fù)合物有利于骨組織的形成。骨橋蛋白在骨代謝中發(fā)揮著重要作用，且參與多種骨相關(guān)細胞的增殖、遷移和黏附等生物學(xué)活動。骨橋蛋白主要表達于成骨細胞，而正常骨組織中僅少量表達。本研究術(shù)后8周骨橋蛋白免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，LV-miR-378a+CS組骨橋蛋白陽性表達率低于LV-miR-NC+CS組及CS組，可能是由于術(shù)后8周LV-miR-378a+CS組新生骨組織礦化程度較好，有較多成熟骨質(zhì)，而成骨細胞較少，故骨橋蛋白陽性表達率較低。

綜上所述，本研究通過將過表達miR-378a轉(zhuǎn)染BMMSCs復(fù)合CS支架植入到大鼠股骨缺損模型中，從動物實驗的角度證實了miR-378a復(fù)合物可加速體內(nèi)的骨再生進程，探索了miR-378a用于臨床骨缺損治療的潛力。但本研究尚存在不足之處，如動物實驗觀察時間較短，缺少更長時間的對比研究，且未進行miR-378a參與骨修復(fù)重建的具體調(diào)控機制研究，尚有待后續(xù)實驗進一步探索。