新型血清學(xué)標(biāo)志物在不同類型乙型肝炎病毒感染中的檢出特征分析

李樂(lè)，廖昊，思蘭蘭，陳容娟，王鈞，張珊，徐東平，紀(jì)冬*，劉妍*

1解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心感染病醫(yī)學(xué)部研究所，北京 100039；2解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心肝病醫(yī)學(xué)部肝病科，北京 100039

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染不但會(huì)引起急性乙型肝炎(acute hepatitis B，AHB)、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)，還與肝硬化(liver cirrhosis，LC)及肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的發(fā)生密切相關(guān)，在世界范圍內(nèi)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，我國(guó)77%的LC及84%的HCC是由HBV導(dǎo)致的[1-3]。由于感染HBV的肝細(xì)胞內(nèi)持續(xù)存在共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)，導(dǎo)致HBV難以被清除。目前缺乏可準(zhǔn)確評(píng)價(jià)肝組織cccDNA轉(zhuǎn)錄及病毒復(fù)制的有效血清學(xué)指標(biāo)。

新型血清標(biāo)志物HBV RNA及HBV核心抗原相關(guān)抗原(hepatitis B core-related antigen，HBcrAg)可反映肝組織cccDNA的轉(zhuǎn)錄活性，是近年研究的熱點(diǎn)[4-6]。其中，HBV RNA是來(lái)自肝細(xì)胞內(nèi)cccDNA的直接轉(zhuǎn)錄體，主要是未經(jīng)或僅經(jīng)部分反轉(zhuǎn)錄的前基因組RNA及其剪切變異體；HBcrAg包括HBeAg、HBcAg及中間產(chǎn)物22 ku前核心蛋白，由前-C/C區(qū)的開(kāi)放讀碼框編碼并包含一段由149個(gè)相同氨基酸組成的序列，可被同一抗體檢測(cè)。乙肝核心抗體(anti-HBc)是機(jī)體產(chǎn)生的針對(duì)HBcrAg的特異性抗體，其定量水平與肝臟組織學(xué)炎癥壞死程度呈顯著正相關(guān)[7-8]。檢驗(yàn)HBV RNA、HBcrAg及anti-HBc水平對(duì)初始治療方案的選擇、臨床療效和預(yù)后情況的評(píng)估具有重要作用，但目前對(duì)這些新指標(biāo)的研究主要集中于CHB患者，缺少對(duì)AHB、LC及HCC患者的研究。在不同疾病類型的HBV感染患者中，系統(tǒng)性地探討傳統(tǒng)及上述新型HBV標(biāo)志物的特征及意義的研究尚少。本研究選取不同類型的HBV感染患者，分析新型血清學(xué)標(biāo)志物及肝組織HBV總DNA(total DNA，tDNA)和cccDNA的檢出特征，以探討其臨床診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017年1月－2019年12月在解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心診治的不同類型HBV感染患者血清樣本。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《乙型病毒性肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)》(標(biāo)準(zhǔn)號(hào)WS 299-2008)以及《慢性乙型肝炎防治指南(2015更新版)》[9]，結(jié)合肝臟組織學(xué)以及HBV感染病程分期，符合抗病毒治療適應(yīng)證者給予核苷(酸)類似物(nucleoside/nucleotide analogues，NAs)治療。納入標(biāo)準(zhǔn)：接受肝組織活檢，并進(jìn)行肝組織HBV cccDNA檢測(cè)的HBV感染患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他病毒性肝炎、藥物性肝損傷、自身免疫性肝病及酒精性或非酒精性脂肪肝等其他肝臟疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)2017050D)。

1.2 臨床資料獲取及常規(guī)指標(biāo)檢測(cè) 采用查詢病歷的方式獲取患者的年齡、性別等資料。乙肝抗原抗體系統(tǒng)(HBsAg、anti-HBs、HBeAg、anti-HBe、anti-HBc)采用Roche Cobas e601電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(英國(guó)羅氏診斷產(chǎn)品有限公司)檢測(cè)，HBsAg定量檢測(cè)下限為0.05 IU/ml。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)血清HBV DNA水平(檢測(cè)下限為20 IU/ml)。

1.3 新型血清病毒學(xué)標(biāo)志物檢測(cè) 血清HBV RNA熒光定量采用北京熱景生物公司研發(fā)的HBV pgRNA試劑盒，檢測(cè)下限為100 拷貝/ml。血清HBcrAg檢測(cè)采用Lumipulse G夾心免疫檢測(cè)技術(shù)(日本富士瑞必歐株式會(huì)社)，檢測(cè)范圍3.0～7.0 log10U/ml。血清anti-HBc檢測(cè)采用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫檢測(cè)法，試劑盒購(gòu)自廈門萬(wàn)泰凱瑞生物技術(shù)有限公司，檢測(cè)有效范圍為100～100 000 IU/ml，檢測(cè)下限為0.25 IU/ml。

1.4 肝臟組織HBV tDNA及cccDNA檢測(cè) 檢測(cè)方法由本課題組自主創(chuàng)建(國(guó)家技術(shù)發(fā)明專利ZL201010273282.9)并臨床應(yīng)用，使用Qiagen公司的QIAamp DNA Mini Kit試劑盒提取新鮮肝組織tDNA，直接進(jìn)行HBV PCR定量檢測(cè)，獲得結(jié)果為HBV tDNA，主要包括肝組織的松弛環(huán)狀DNA(rcDNA)、雙鏈線性DNA及cccDNA。肝組織tDNA經(jīng)PSAD酶消化、滾環(huán)擴(kuò)增及跨缺口PCR定量檢測(cè)，獲得結(jié)果為HBV cccDNA[6-7]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；偏態(tài)分布的計(jì)量資料以M(Q1，Q3)表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。P＆lt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 新型血清學(xué)指標(biāo)在不同疾病類型HBV感染患者中的檢出特征 共納入227例患者，男154例，女73例，年齡(39.2±10.3)歲。按疾病類型，AHB組16例，CHB組184例，LC組18例，HCC組9例。227例HBV感染患者的血清HBV RNA檢出率為55.5%，定量水平為5.5(2.9，6.7) log10拷貝/ml；血清HBcrAg檢出率為90.3%，定量水平4.8(3.4，8.3) log10IU/ml；血清anti-HBc檢出率為96.5%，定量水平3.8(3.1，4.3) log10IU/ml，不同類型檢出特征見(jiàn)表1。

AHB組的HBV RNA及anti-HBc定量明顯低于CHB組(P＆lt;0.05)，而兩組的HBcrAg定量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＆gt;0.05，表1)。在4例HBsAg發(fā)生血清學(xué)轉(zhuǎn)換的AHB患者中，有3例HBV DNA陽(yáng)性，3例HBcrAg陽(yáng)性，1例HBV RNA陽(yáng)性。在184例CHB患者中，34例(18.5%)接受了NAs治療，其HBV RNA與HBcrAg定量均明顯低于未治療組，anti-HBc定量明顯高于未治療組(P＆lt;0.05)；在18例LC患者中，9例(50.0%)接受了NAs治療，其HBV RNA、HBcrAg及anti-HBc定量與未治療組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＆gt;0.05，圖1)。

圖1 新型血清病毒學(xué)指標(biāo)在不同疾病類型HBV感染患者中的檢出特征Fig.1 Novel serum biomarkers in HBV-infected patients with different category of clinical illness

2.2 傳統(tǒng)血清學(xué)指標(biāo)在不同疾病類型HBV感染患者中的檢出特征 傳統(tǒng)血清學(xué)指標(biāo)HBV DNA檢出率為86.8%，定量水平為4.2(3.0，7.9) log10IU/ml，血清HBsAg檢出率為92.5%，定量水平為3.4(2.7，4.3) log10IU/ml；血清HBeAg檢出率為45.8%，定量水平為3.1(1.3，3.3) log10COI。不同類型患者的檢出特征見(jiàn)表1。

AHB組的HBV DNA、HBsAg及HBeAg定量均明顯低于CHB(P＆lt;0.05，表1)。在184例CHB患者中，NAs治療組HBV DNA、HBsAg及HBeAg定量均明顯低于未治療組(P＆lt;0.05)；在18例LC患者中，NAs治療組的HBsAg及HBeAg定量與未治療組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＆gt;0.05，圖2)。

圖2 傳統(tǒng)血清病毒學(xué)指標(biāo)在不同疾病類型HBV感染患者中的檢出特征Fig.2 Traditional serum biomarkers in HBV-infected patients with different category of clinical illness

表1 不同類型HBV感染患者臨床資料Tab.1 Clinical characteristics of HBV-infected patients with different category of clinical illness

2.3 肝組織學(xué)指標(biāo)在不同疾病類型HBV感染患者中的檢出特征 肝組織HBV tDNA檢出率為97.8%，定量水平為5.5(4.8，7.3) log10拷貝/105，肝組織HBV cccDNA檢出率為88.5%，定量水平為4.7(3.8，6.0) log10拷貝/105。不同類型患者的檢出特征見(jiàn)表1。

AHB組的肝組織HBV tDNA及HBV cccDNA定量明顯低于CHB組(P＆lt;0.05，表1)。在184例CHB患者中，NAs治療組HBV tDNA及HBV cccDNA定量均明顯低于未治療組(P＆lt;0.05)；在18例LC患者中，NAs治療組HBV tDNA及HBV cccDNA定量與未治療組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＆gt;0.05，圖3)。

圖3 肝組織HBV tDNA (A)及cccDNA(B)在不同疾病類型HBV感染患者中的檢出特征Fig.3 Intrahepatic HBV tDNA and cccDNA in HBV-infected patients with different category of clinical illness

3 討 論

近年來(lái)，HBV新型血清標(biāo)志物在HBV感染不同自然病程分期的特征及預(yù)測(cè)抗病毒應(yīng)答和新藥研發(fā)中的價(jià)值已成為研究熱點(diǎn)[10]。本研究對(duì)227例不同疾病類型HBV感染患者的新型血清學(xué)標(biāo)志物的特征進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示，AHB患者除HBcrAg外其他病毒學(xué)標(biāo)志物定量均低于CHB患者，分析可能與AHB患者體內(nèi)的免疫清除狀態(tài)有關(guān)，另外在HBsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的4例AHB患者中，仍有HBV DNA、HBV RNA及HBcrAg陽(yáng)性，推測(cè)其原因如下：患者體內(nèi)Dane病毒顆粒約為108/ml，而HBV RNA病毒樣顆粒約106/ml，未包裹核酸的空衣殼顆粒1011/ml，HBsAg的小球型顆粒及管型顆粒約1014/ml[11]，AHB患者體內(nèi)的抗-HBs首先中和大部分有包膜的Dane病毒顆粒、HBV RNA病毒樣顆粒以及HBsAg的小球型顆粒及管型顆粒，殘余部分無(wú)包膜的裸病毒顆粒則更晚被清除，導(dǎo)致HBV DNA及HBcrAg的清除較其他指標(biāo)更滯后，因此，HBcrAg可作為AHB患者是否徹底治愈的鑒別指標(biāo)。

在CHB患者中，NAs治療可以明顯降低血清HBV RNA、HBcrAg、HBV DNA、HBsAg、HBeAg及肝組織tDNA、cccDNA水平，并升高anti-HBc定量水平，提示新型血清學(xué)標(biāo)志物與傳統(tǒng)標(biāo)志物均可反映CHB抗病毒治療過(guò)程中HBV DNA復(fù)制的變化。但在LC患者中，盡管NAs治療可以明顯降低HBV DNA水平，但其HBV RNA、HBcrAg、anti-HBc定量均無(wú)明顯變化，表明患者體內(nèi)低水平的HBV DNA仍可通過(guò)其他病毒顆粒如HBV RNA病毒樣顆粒或空病毒顆粒促進(jìn)疾病進(jìn)展[12-13]，故應(yīng)進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)即使HBV DNA降至不可檢測(cè)水平，但只要仍能檢測(cè)出HBV RNA，就不能中斷抗病毒治療。另有研究發(fā)現(xiàn)，HBcrAg可預(yù)測(cè)HCC的發(fā)生[14-16]，而本研究也再次證實(shí)LC經(jīng)抗病毒治療后HBcrAg沒(méi)有顯著下降，推測(cè)這可能是LC患者HCC發(fā)生率較高的原因之一。HCC具有更高的HBsAg陰性率及HBeAg陰性率，其機(jī)制目前仍不清楚，推測(cè)可能由于多數(shù)患者已經(jīng)過(guò)渡到免疫控制及再活動(dòng)期，導(dǎo)致病毒復(fù)制減弱。

綜上所述，HBcrAg可作為AHB徹底治愈的鑒別指標(biāo)；若抗病毒治療后HBV DNA降至不可測(cè)，但HBV RNA仍然可測(cè)出，則不能停止抗病毒治療；HBV RNA及HBcrAg或可作為肝組織HBV cccDNA的血清學(xué)替代指標(biāo)。由于本研究為回顧性研究，存在亞組間樣本例數(shù)不均衡的問(wèn)題，其結(jié)果尚需后續(xù)大樣本隊(duì)列研究進(jìn)一步驗(yàn)證。