慢性乙型肝炎患者經(jīng)恩替卡韋治療后獲得顯著組織學應(yīng)答的影響因素及列線圖模型構(gòu)建

王春艷，紀冬,2,3*，陳艷，周光德，董政，王建軍，陳國鳳,2，楊永平,2*

1解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心肝病醫(yī)學部，北京 100039；2北京大學302臨床醫(yī)學院，北京 100039；3南方醫(yī)科大學第二臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510515；4首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院病理科，北京 100069

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是目前全球重大的公共衛(wèi)生問題。據(jù)報道，每年約有超過65萬人死于HBV相關(guān)終末期肝病，包括肝硬化、肝細胞癌等[1-3]。目前臨床應(yīng)用核苷(酸)類似物(nucleo(t)ide analogues，NAs)作為慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)抗病毒治療的主要手段，大多數(shù)CHB患者通過抗病毒治療可獲得生化學應(yīng)答[谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)復(fù)常]及病毒學應(yīng)答(HBV DNA持續(xù)低于檢測值下限)[4]，然而越來越多的研究表明，即使獲得持續(xù)的生化學應(yīng)答及病毒學應(yīng)答，部分CHB患者的肝纖維化仍在進展，甚至在獲得HBsAg陰轉(zhuǎn)后，仍有一部分CHB患者進展為原發(fā)性肝細胞癌[5]。

我國的指南及專家共識均指出，CHB的理想治療目標是獲得肝組織學改善，進而降低肝硬化及肝細胞癌的發(fā)生風險[6-7]。因此，如何評價CHB患者接受抗病毒治療期間是否獲得顯著組織學應(yīng)答(significant histological response，SHR)尤為重要。目前肝活檢仍然是評價SHR的金標準，但由于其屬于有創(chuàng)性操作，難以普及，且無法實現(xiàn)臨床治療過程中的動態(tài)監(jiān)測[8-11]。本研究納入恩替卡韋(entecavir，ETV)治療CHB患者的相關(guān)資料，分析SHR的影響因素，并建立無創(chuàng)列線圖模型，以期為減少肝活檢及將來實現(xiàn)臨床治愈提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究數(shù)據(jù)來源于一項進行中的前瞻性隨機對照雙盲試驗(注冊號：NCT01965418)[12-13]。選取2013年10月－2014年10月解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心等14家醫(yī)院收治的CHB患者共1000例，所有患者均符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[14]的診斷標準。納入標準：(1)年齡大于18歲且未接受過抗病毒治療的慢性HBV感染者；(2)符合NAs抗病毒治療的適應(yīng)證；(3)接受肝活檢；(4)肝纖維化Ishak評分≥3分，且6個月內(nèi)未接受抗纖維化治療。排除標準：(1)合并其他病毒感染；(2)其他類型肝臟疾病；(3)失代償期肝硬化；(4)具有惡性腫瘤病史；(5)嚴重的心臟、腎臟或其他臟器的原發(fā)疾病或精神系統(tǒng)疾??；(6)妊娠或哺乳期。本研究方案已獲解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心倫理委員會（批件號2018101D）以及其他13家參與醫(yī)院倫理委員會審批通過，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 治療方法與觀察指標 所有患者口服ETV(0.5 mg/d)進行抗病毒治療，并于治療72周后進行第2次肝活檢，排除未完成治療的患者54例及拒絕第2次肝活檢的患者219例，最終納入727例患者進行研究。收集治療前、治療72周后患者的一般資料(包括年齡、性別、體重指數(shù)等)及實驗室指標，包括血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、總膽紅素(TBIL)、血小板計數(shù)(PLT)、HBV DNA量、乙型肝炎e抗原(HBeAg)等，并計算谷草轉(zhuǎn)氨酶與血小板比值(APRI)及肝纖維化4因子指數(shù)(fibrosis-4，F(xiàn)IB-4)。公式如下：APRI=(AST/正常值上限×100)/PLT；FIB-4=(年齡×AST)/(PLT×ALT/2)。病毒學應(yīng)答定義為抗病毒治療開始后血清HBV DNA＆lt;20 IU/ml；ALT復(fù)常率定義為基線ALT升高亞組中ALT恢復(fù)正?；颊叩陌俜直?；HBeAg血清學轉(zhuǎn)換定義為基線HBeAg陽性亞組中HBeAg轉(zhuǎn)陰并且抗HBe轉(zhuǎn)陽。

1.3 肝組織學檢查 采用超聲引導(dǎo)下經(jīng)皮肝穿刺活檢，使用一次性16G活檢針，要求肝組織長度≥15 mm，至少包括11個匯管區(qū)[15]，由兩位病理醫(yī)師集中進行雙盲法閱片。肝臟炎癥活動指數(shù)(histology activity index，HAI)及纖維化評分分級參照Ishak評分系統(tǒng)判定[16-17]，炎癥改善定義為治療后Ishak炎癥活動指數(shù)降低≥2分，肝纖維化逆轉(zhuǎn)定義為治療后Ishak纖維化分級下降≥1分，SHR定義為治療后后者≤2分且前者≤4分。

1.4 肝臟彈性檢測 由經(jīng)驗豐富的操作員使用FibroScan?(法國Echosens公司)按照標準操作方法測量肝臟硬度值(liver stiffness measurement，LSM)。測量時患者取仰臥位，右手抱頭，選擇右側(cè)腋前線至腋中線第7、8、9肋間，在檢測處涂抹耦合劑，將探頭貼緊皮膚并與皮膚垂直。連續(xù)成功檢測10次，取10次有效測量的中位數(shù)作為最終LSM值。有效性判定：四分位間距(IQR)小于中位數(shù)的30%，成功率(成功檢測次數(shù)/總檢測次數(shù))≥60%[18]。LSM下降≥30%定義為有臨床意義[19]。

1.5 無創(chuàng)列線圖模型的創(chuàng)建與檢驗 將多因素logistic回歸分析篩選的5個影響因素引入R軟件，建立評估治療72周獲得SHR的個體化列線圖模型，并繪制校準曲線及臨床決策曲線(decision curve analyses，DCA)。通過Bootstrap自抽樣法對模型進行內(nèi)部驗證，用一致性指數(shù)(concordance index，C指數(shù))、校準曲線及DCA曲線[20]來評價列線圖的區(qū)分度、校準度及臨床實用性。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)以±s或M(Q1，Q3)表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗或Mann-WhitneyU檢驗。計數(shù)資料以例(%)表示，兩組比較采用χ2檢驗。通過多因素logistic回歸模型，采用進入法篩選SHR的相關(guān)因素，采用R語言(v3.6.1)的RMS程序包構(gòu)建列線圖模型。P＆lt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組CHB初治患者一般資料比較 本組727例患者中，男497例(68.4%)，女230例(31.6%)，平均年齡(42.2±9.8)歲，HBeAg陽性415例(57.1%)，ALT升高455例(62.6%)，其他資料見表1。其中ALT正常的272例CHB患者中72.4%(197/272)有顯著肝臟炎癥(HAI≥5分)，57.7%(152/272)有肝硬化(F≥5分)。根據(jù)治療72周后是否獲得SHR，將727例患者分為無應(yīng)答組(n=567)與應(yīng)答組(n=160)，兩組年齡、性別、體重指數(shù)、HBV DNA量、TBIL、PLT、LSM、Ishak炎癥活動指數(shù)、Ishak纖維化分級及肝硬化比例差異均有統(tǒng)計學意義(P＆lt;0.05)，而兩組ALT、AST水平及HBeAg陽性、ALT升高比例差異無統(tǒng)計學意義(P＆gt;0.05，表1)。

表1 兩組CHB初治患者一般資料比較Tab.1 Comparison of the general data between two groups of CHB patients

2.2 兩組C H B 初治患者的臨床結(jié)局比較 治療7 2 周后，所有患者的總體纖維化逆轉(zhuǎn)率為51.2%(372/727)，炎癥改善率為74.4%(541/727)，病毒學應(yīng)答率為86.0%(625/727)，ALT復(fù)常率為8 3.5%(3 8 0/4 5 5)，H B e A g 血清學轉(zhuǎn)換率為13.3%(55/415)。其中獲得病毒學應(yīng)答的625例患者中，306例(49.0%)經(jīng)病理學檢查證實未獲得纖維化逆轉(zhuǎn)；ALT復(fù)常的380例患者中，342例(90.0%)獲得組織學炎癥改善，但165例(43.4%)未獲得纖維化逆轉(zhuǎn)(圖1)。應(yīng)答組的纖維化逆轉(zhuǎn)率、炎癥改善率、ALT復(fù)常率均高于無應(yīng)答組，兩組ALT、AST、TBIL、PLT及LSM差異有統(tǒng)計學意義(P＆lt;0.05)，但兩組LSM降低≥30%的比例、病毒學應(yīng)答率及HBeAg血清學轉(zhuǎn)換率差異無統(tǒng)計學意義(P＆gt;0.05，表2)。53.8%(391/727)的患者LSM降低≥30%，但其中只有53.1%(85/160)被組織學證實，46.9%(75/160)為假陽性。

表2 兩組CHB初治患者治療72周后的臨床結(jié)局比較Tab.2 The clinical outcomes in two groups of CHB patients after 72 weeks of treatment

圖1 病毒學應(yīng)答(A)與谷丙轉(zhuǎn)氨酶復(fù)常(B)患者的肝組織纖維化逆轉(zhuǎn)比例Fig.1 Reversal ratio of liver fibrosis in patients with virologic response (A) and ALT normalization (B)

2.3 SHR的影響因素分析 以表1、2中單因素分析差異有統(tǒng)計學意義的變量為自變量，以SHR為因變量進行l(wèi)ogistic回歸分析。結(jié)果顯示，基線時的年齡、PLT、LSM，以及治療72周后的ALT、LSM為SHR的獨立影響因素(P＆lt;0.05，表3)。

表3 影響顯著組織學應(yīng)答的logistic回歸分析Tab.3 Logistic regression analysis for significantly influencing histological response in CHB patients

2.4 列線圖制作及檢驗 基于2.3中的因素建立的列線圖模型的C指數(shù)為0.784(95%CI 0.746～0.821)，明顯優(yōu)于單獨使用APRI(C指數(shù)為0.643，95%CI 0.686～0.729)、FIB-4(C指數(shù)為0.691，95%CI 0.647～0.736)及LSM(C指數(shù)為0.735，95%CI 0.694～0.776)，差異有統(tǒng)計學意義。校正曲線貼近于理想曲線(對角線)，斜率為1.013，Hosmer-Lemeshow擬合優(yōu)度檢驗無統(tǒng)計學意義(χ2=4.316，P=0.828)。DCA曲線顯示該模型在較廣的閾值概率范圍內(nèi)(0.1～0.65)，均高于APRI、FIB-4及LSM，臨床實用性較強(圖2)。

圖2 慢性乙型肝炎患者抗病毒治療72周后獲得顯著組織學應(yīng)答的列線圖(A)、校正曲線(B)及DCA曲線(C)Fig.2 A nomogram (A), calibration curve (B) and DCA curve (C) of CHB patients getting significant histological response after 72 weeks of antiviral treatment

3 討 論

目前，核苷(酸)類藥物已經(jīng)廣泛應(yīng)用于CHB患者的抗病毒治療，積極的抗病毒治療可以持續(xù)抑制HBV DNA的復(fù)制，減輕肝細胞的炎癥損傷，進而改善肝纖維化，降低肝細胞癌的發(fā)生率[4,21-22]。隨著抗病毒藥物的不斷優(yōu)化，追求的目標不斷進步，CHB的臨床治愈已成為目前國內(nèi)外最新指南推薦的理想治療目標。然而有研究顯示，獲得持續(xù)的生化學應(yīng)答及病毒學應(yīng)答并不能真正反映肝組織的病理學改善[23]。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，即使CHB患者在達到停藥標準后停藥，仍然具有非常高的復(fù)發(fā)率[24-25]。如何更好地評估組織學應(yīng)答，并將其用于實現(xiàn)臨床治愈患者的長期無創(chuàng)隨訪已成為當前研究的熱點之一。

我國指南將肝組織學應(yīng)答定義為肝組織炎癥壞死降低且無肝纖維化評分增高，或纖維化評分降低[12]。首先，目前用于評價肝組織炎癥活動的無創(chuàng)指標以ALT為主[26]，指南推薦對于持續(xù)存在ALT異常且HBV DNA陽性的CHB患者需進行抗病毒治療，但有研究表明，在ALT正常患者中仍有15.7%～50.2%存在明顯的肝組織學損傷[27-29]，與本研究結(jié)果一致。因此單純采用ALT無法充分反映肝臟炎癥程度。其次，評價肝纖維化的無創(chuàng)診斷方法包括LSM、APRI及FIB-4等[7]。既往研究表明，LSM能準確識別進展期肝纖維化與早期肝硬化，然而其測定結(jié)果受肝臟炎癥、重度脂肪變等多種因素的影響[7,12,30]。最新研究發(fā)現(xiàn)，CHB患者在抗病毒治療過程中LSM下降并不能準確評價肝纖維化的逆轉(zhuǎn)情況，LSM評價肝纖維化具有一定局限性[31]；有研究也指出單獨采用APRI、FIB-4評估HBV相關(guān)肝纖維化程度的準確性較低[32]。本研究是基于國家“十三五”課題中隨機對照試驗研究的深度挖掘，旨在評價聯(lián)合使用復(fù)方鱉甲軟肝片對恩替卡韋初治CHB患者的協(xié)同療效[12-13]，以治療前后的肝活檢病理作為評價指標，并建立新的無創(chuàng)列線圖模型，用于評估SHR，結(jié)果更客觀。

本研究最終篩選出SHR的5個獨立影響因素，包括基線的年齡、PLT、LSM及治療72周的ALT、LSM。既往有研究表明，年齡與慢性肝病患者疾病進展相關(guān)，年齡越大患者的肝組織炎癥及纖維化程度越重[33-34]。本研究發(fā)現(xiàn)基線年齡與肝組織學應(yīng)答呈負相關(guān)，列線圖模型顯示，年齡較大的CHB患者經(jīng)抗病毒治療后的組織學應(yīng)答率相對較低，因此，對符合抗病毒適應(yīng)證的CHB患者應(yīng)盡早治療，以獲得較高的組織學應(yīng)答率。PLT及ALT作為APRI、FIB-4的參數(shù)之一，已被充分證實與肝纖維化程度有關(guān)[35-36]，尤其是PLT亦被Baveno Ⅵ共識推薦用于無創(chuàng)評估及監(jiān)測肝硬化門脈高壓患者的食管靜脈曲張情況[37-38]，而靜脈曲張程度與患者的預(yù)后相關(guān)。本研究將PLT、ALT納入列線圖模型，可能更有利于評估CHB患者肝臟疾病的預(yù)后。另外，LSM作為一種成熟的肝纖維化無創(chuàng)診斷技術(shù)已廣泛應(yīng)用于臨床，我國指南指出“動態(tài)評估CHB患者的肝臟疾病嚴重程度比單次檢測更有臨床意義”，雖然LSM的診斷效能可能受到多種因素的影響，但準確評估基線及抗病毒治療過程中LSM的變化對于預(yù)測治療72周后的SHR仍具有重要價值。

本研究建立的列線圖模型可將多因素分析結(jié)果可視化，并且具有可量化、個體化評估CHB患者抗病毒治療獲得SHR的優(yōu)勢，可作為肝活檢的有效替代方式。根據(jù)本研究的列線圖模型，假設(shè)某30歲的CHB患者，基線血小板為250×109/L、LSM為15 kPa，經(jīng)NAs抗病毒治療72周后，LSM為5.5 kPa、ALT為10 U/L，則該患者總得分為206.2分，獲得SHR率僅為60%，需要繼續(xù)抗病毒治療。為了更好地評價列線圖的區(qū)分度、校準度，本研究采用內(nèi)部驗證法并進一步繪制校準曲線，結(jié)果顯示C指數(shù)為0.784，高于單獨的APRI、FIB-4、LSM，而校正曲線幾乎貼近于理想曲線，充分證實了模型的準確性良好。另外，本研究通過DCA曲線進一步比較了列線圖模型與APRI、FIB-4、LSM的實際臨床診斷價值，同樣顯示出列線圖的臨床實用性最高。

綜上所述，CHB患者接受抗病毒治療期間獲得生化學應(yīng)答及病毒學應(yīng)答并不能真正反映肝組織的病理學改善，單獨采用LSM無法準確評價肝纖維化的逆轉(zhuǎn)。基于基線年齡、PLT、LSM以及治療72周后ALT、LSM構(gòu)建的列線圖模型具有良好的準確性，可用于個體化評價CHB患者抗病毒治療期間的SHR率，減少肝活檢，有助于臨床醫(yī)生進一步評估病情、指導(dǎo)臨床治療及隨訪病情轉(zhuǎn)歸，為實現(xiàn)臨床治愈提供參考，其臨床應(yīng)用價值較高，值得進一步推廣應(yīng)用。