經(jīng)治低水平病毒血癥慢性乙型肝炎患者耐藥突變的基因型特征

王建軍，紀冬*，李樂，思蘭蘭，陳容娟，李原華，葛斐林，姚增濤，徐東平，劉妍*

1解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心肝病醫(yī)學部，北京 100039；2解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心感染病醫(yī)學部，北京 100039

核苷(酸)類似物[nucleos(t)ide analogues，NAs]可強效抑制乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)復制[1-2]，實現(xiàn)完全病毒學應答(CVR)，然而部分患者始終無法獲得CVR，美國肝病研究學會(AASLD)將此種情況定義為低水平病毒血癥(low-level viremia，LLV)[3]。NAs經(jīng)治患者中，存在LLV者較易發(fā)生病毒耐藥，導致抗病毒治療失敗，進一步引發(fā)病情進展，導致肝纖維化、肝硬化甚至肝癌的發(fā)生，故經(jīng)治LLV不容忽視，尤其是其中發(fā)生藥物耐藥者。大樣本的LLV耐藥基因型分析少見報道，本研究通過大樣本回顧性調(diào)查研究，分析經(jīng)治的慢性乙型肝炎(CHB)合并LLV患者反轉(zhuǎn)錄酶(RT)區(qū)耐藥突變的基因型特征，以便精準調(diào)整治療策略。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2007年9月－2019年8月在解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學中心就診的經(jīng)治LLV CHB患者2096例。其中男1727例，女369例，年齡(45.6±12.0)歲，HBV DNA為(2.5±0.5) log10IU/ml，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)為(38.7±56.8) U/L，谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)為(39.2±50.8) U/L，總膽紅素(TBIL)為(23.9±50.1) μmol/L。其中乙型肝炎e抗原(HBeAg)陽性714例，乙型肝炎e抗體(HBeAb)陰性1382例。參照2005年中華醫(yī)學會修訂的慢性乙肝指南標準進行診斷[4]。經(jīng)過口服拉米夫定(LAM)、替比夫定(LdT)、阿德福韋(ADV)、恩替卡韋(ETV)等至少一種抗病毒藥物或序貫應用多種抗病毒藥物治療至少12個月后仍合并LLV(HBV DNA 20～2000 IU/ml)的患者，排除HBV與丙型肝炎病毒(HCV)、甲型肝炎病毒(HAV)、丁型肝炎病毒(HDV)、戊型肝炎病毒(HEV)或人免疫缺陷病毒(HIV)混合感染。

1.2 方法 提取患者的血清HBV DNA，并使用巢式PCR擴增HBV RT片段，長度為1225 bp(nt54-nt1278)，包含HBV RT基因(nt130-nt1161)及S基因(nt155-nt835)。對PCR產(chǎn)物進行雙向測序，用MEGA 4軟件對RT/S基因序列進行分子進化樹分析，以肝炎病毒數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.Cgi)的標準序列為參照進行HBV基因分型：B型301例，C型1780例，D型15例。分析RT區(qū)，根據(jù)不同的耐藥位點，將2096例患者分為LAM耐藥組(L180和M204位點，1216例)、ADV耐藥組(A181V和N236T位點，444例)、ETV耐藥組(L180和M204再加上T184L/A/S/I、S202G和M250等位點，376例)及多藥耐藥組(LAM/ADV或ADV/ETV耐藥位點，60例)，分析各耐藥組RT區(qū)耐藥突變的基因型分布特點。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組比較采用方差分析；非正態(tài)分布計量資料以M(Q1，Q3)表示，兩組比較采用Mann-Whitney檢驗，多組比較采用Kruskal-Wallis檢驗。計數(shù)資料以例(%)表示，組間比較采用χ2檢驗。P＆lt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各耐藥組CHB患者的臨床特征比較 各耐藥組CHB患者的性別、年齡、HBV基因型、TBIL、ALT、AST比較差異無統(tǒng)計學意義(P＆gt;0.05)。而各耐藥組HBeAg陽性率差異有統(tǒng)計學意義，均為HBeAg陽性患者的比例較低，其中ADV耐藥組的HBeAg陽性患者比例最低(P＆lt;0.05，表1)。

表1 各耐藥組CHB患者臨床特征比較Tab.1 Comparison of clinical characteristics among the patients with CHB in different drug resistant groups

2.2 各耐藥組RT區(qū)耐藥突變的基因型分布 LAM耐藥相關(guān)突變以M204I/V、L180M+M204V為主要形式，分別占29.5%、29.4%；ADV耐藥相關(guān)突變以A181V、N236T為主要形式，分別占44.8%、39.4%；ETV耐藥相關(guān)突變以L180M+M204I/V+T184L/A/S/I、L180M+M204V+S202G為主要形式，分別占39.6%、37.8%；多藥耐藥相關(guān)突變以L180M+M204I/V+A181V、L180M+M204V+N236T+A181V+S202G為主要形式，占76.7%(圖1)。

圖1 各耐藥組CHB患者反轉(zhuǎn)錄酶區(qū)耐藥突變的基因型分布Fig.1 Genotype distribution of drug resistance mutations in the reverse transcriptase domain of patients with CHB in different drug resistant groups

3 討 論

乙型肝炎是嚴重危害我國人民健康的疾病，其抗病毒治療方案最初為干擾素，但不良反應較多，患者依從性不佳[5-6]。自1999年LAM獲批上市以來，陸續(xù)有ADV、LdT、ETV、替諾福韋(TDF)、丙酚替諾福韋(TAF)等NAs藥物上市，該類藥物可強效抑制HBV復制，實現(xiàn)CVR；然而有部分患者始終無法獲得CVR，臨床上可以檢測到HBV DNA長期的低病毒載量復制(20～2000 IU/ml)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)或間斷的LLV與肝纖維化的進展相關(guān)[7-8]，并可顯著增高肝硬化患者發(fā)生肝癌的概率[9]，甚至造成失代償期肝硬化患者的死亡風險明顯增高[10]。因此，LLV越來越受到重視。

口服NAs可引起病毒耐藥，HBV DNA的耐藥突變主要體現(xiàn)為基因RT區(qū)位點的突變，但目前尚無TDF耐藥的報告[11]。在LLV患者中，由于病毒長期存在，藥物無法完全清除病毒，在長時間低水平病毒持續(xù)刺激下，即使是目前常見的強效、低耐藥性的ETV，也存在耐藥情況[11-13]。

本研究中LAM耐藥患者最多，占58%(1216/2096)，主要原因是L AM是既往最常用的抗病毒藥物，應用時間最久，耐藥突變最常見，其5 年耐藥率可達60%～70%，且L AM與LdT耐藥位點有交叉，還可增高ETV的耐藥率[14]。既往研究發(fā)現(xiàn)，LAM耐藥后基因變異的主要位點為rtM204V/I和(或)rtL180M[15-16]。在本研究中，LAM耐藥相關(guān)突變以M204V、L180M+M204V為主要形式，分別占29.5%、29.4%；其他突變形式包括L180I/V+M204V、L180M+M204I/V及L180M+M204I等。

與L A M 相比，A D V 的耐藥率要低得多，長期應用人群的2 年和5 年耐藥率分別為2%和29%[17]。在本研究中，ADV耐藥占所有篩選病例的21.2%(444/2096)，以A181V、N236T為主要形式，分別占ADV耐藥病例的44.8%、39.4%；A181V+N236T變異占15.8%。有研究表明，A181V變異還可降低患者對LAM、TDF治療的敏感性，且單個A181V變異可導致LAM與ADV產(chǎn)生交叉耐藥[18]，故在進行ADV的挽救治療時，需特別重視該變異的存在與否。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)各耐藥組的HBeAg陽性患者比例均較低，其中ADV耐藥組的HBeAg陽性患者比例最低，提示HBeAg陰性患者可能更容易出現(xiàn)ADV耐藥。

ETV耐藥的變異位點是在LAM耐藥變異位點L180M、M204的基礎(chǔ)上，再加上T184、S202及M250中至少一個位點才能導致ETV耐藥，所以ETV耐藥的基因屏障較高。有研究顯示ETV初治患者的耐藥率為1.7%，但對已發(fā)生LAM變異的患者，再應用ETV治療后耐藥比例明顯增大[19]。在本研究中，ETV耐藥占所有篩選病例的17.9%(376/2096)，以L180M+M204I/V+T184L/A/S/I、L180M+M204V+S202G為主要形式，分別占39.6%、37.8%；ETV耐藥比例的增高主要考慮這部分患者在應用ETV治療之前就應用了LAM或LdT，然后再換用ETV，先出現(xiàn)的LAM或LdT耐藥降低了ETV耐藥的基因屏障，所以耐藥比例增大。本研究中多藥耐藥的比例較小，占2.9%(60/2096)，以LAM+ADV耐藥的L180M+M204I/V+A181V及ETV+ADV耐藥的L180M+M204V+N236T+A181V+S202G為主要形式，分別占61.7%及15.0%。

通過上述LLV耐藥基因位點的分析可以發(fā)現(xiàn)，既往長期應用LAM、LdT及ADV的患者在LLV耐藥中占主要部分，且LAM及LdT的應用降低了ETV的耐藥基因屏障，提高了ETV的耐藥率，增加了發(fā)生耐藥后挽救治療的難度。所以目前提倡初治選擇一線藥物ETV、TDF或TAF。對于既往應用二線藥物LAM、LdT或ADV的患者，即使目前沒有耐藥，也最好換用一線藥物治療。對于應用一線抗病毒藥物治療后仍存在LLV的患者，目前尚無明確的指導意見。對于接受TAF、TDF或ETV單藥治療的LLV患者，無論ALT水平如何，AASLD 2018版指南均建議維持當前單藥治療，但該建議證據(jù)質(zhì)量等級極低，且推薦等級為酌情[20]，具體情況有待進一步研究。對于應答不佳的CHB患者，我國指南建議采用ETV、TDF或TAF治療48周，若HBV DNA＆gt;2×103IU/ml，排除依從性和檢測誤差后，對于采用ETV治療者，可換用TDF或TAF；對于采用TDF或TAF治療者，可換用ETV，或兩種藥物聯(lián)合使用[21]。目前有研究表明，對于采用ETV治療的LLV患者，換用TAF治療后可獲得CVR，ALT復常率也明顯提高，肝臟硬度也可得到明顯改善[22]。

綜上所述，對于LLV患者，換用另一種藥物治療可以獲得更好的預后，但聯(lián)合另一種強效抗病毒藥物治療的有效性、長期使用替代治療方案的安全性及具體機制尚需隨機對照研究進一步證實。