紫草素對完全弗氏佐劑誘導的類風濕性關(guān)節(jié)炎小鼠模型的治療作用

黃君霞, 解佑銀, 孔德一, 邵麗林, 張雷芳

（浙江海洋大學食品與藥學院/浙江省海洋生物醫(yī)用制品工程技術(shù)研究中心, 浙江 舟山 316022）

類風濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis, RA）是目前人類普遍存在的一種自身免疫性疾病, 該病發(fā)病時主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)及其四周組織產(chǎn)生非化膿性炎癥[1］。相關(guān)調(diào)查[2］顯示, RA 的發(fā)病年齡廣泛, 各個年齡段皆可發(fā)病, 且發(fā)病率高, 通常100 個人中會有1～2 人患有RA 疾病, 中國RA 發(fā)病率為0.4%, 患病人數(shù)多, 30～50 歲的病人很多, 且女性患者比男性患者高2～3 倍[3］。RA 如果不及時診斷與治療, 易侵襲其他器官和關(guān)節(jié)。相關(guān)調(diào)查顯示, 未及時治療的RA患者3 年致殘率高達75%[4］。臨床研究表明, RA 治療手段缺乏高度敏感性分子標志, 易造成誤診和誤治。因此, 需要研發(fā)有效、經(jīng)濟的治療RA 的藥物, 減輕RA 患者的經(jīng)濟壓力, 同時降低藥物的不良反應(yīng)及并發(fā)癥。

AA 模型是建立免疫性關(guān)節(jié)炎動物模型的常用方法[5］, 以小鼠足趾為注射點, 分2 次在小鼠皮內(nèi)注射0.1 mL 免疫制劑CFA 致炎[6, 7］。完全弗氏佐劑可以起到對機體產(chǎn)生刺激而引起繼發(fā)性自身免疫應(yīng)答反應(yīng)的作用。AA 小鼠模型所導致的關(guān)節(jié)炎病變屬于一種急性的對外來抗原等刺激產(chǎn)生相關(guān)反應(yīng)。注射免疫制劑后的小鼠致敏后會立即引起相關(guān)關(guān)節(jié)的腫脹和疼痛, 18～24 d 達到病情的峰值, 并持續(xù)3 d, 隨后越來越低。在對病變的研究過程中發(fā)現(xiàn), 小鼠會出現(xiàn)前肢或后肢的關(guān)節(jié)腫脹畸形甚至潰爛[8］。

紫草素（Shikonin, SHI）是從宗阜根中分離得到的重要活性化學成分。紫草素中化學物質(zhì)成分含量極多且種類豐富, 如生物堿類、三萜類、紫草多糖類等。SHI 具有良好的抗炎、免疫抑制、鎮(zhèn)痛等生物活性[9-14］。紫草素的抗炎作用多與NO、TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8 和NF-κB 等有關(guān)[15, 16］。

本研究以紫草素為研究對象, 評價其在AA 小鼠模型中的抗炎作用, 觀察足踝的病理變化, 測定炎癥因子和氧化應(yīng)激的相關(guān)指標。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物與試劑 IL-6 ELISA 試劑盒、IL-1β ELISA 試劑盒、TNF-αELISA 試劑盒、NO ELISA 試劑盒、SOD 檢測試劑盒、MDA 檢測試劑盒均購自上海碧云天公司。紫草素、美洛昔康、完全弗氏佐劑購自美國SIGMA 公司。

1.1.2 儀器 SpectraMax M3 型多功能酶標儀, 美國Molecular Devices 公司；DK-S24 型電熱恒溫水浴鍋, 上海森信實驗儀器有限公司；CF16RN 型高速臺式冷凍離心機, 日本HITACHI 公司；DHG-9140A 型鼓風干燥箱, 上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與模型建立 ICR 雄性小鼠40 只, 重25～30 g（中國杭州浙江實驗動物中心）, 飼養(yǎng)在標準環(huán)境條件下[溫度（24±2）℃, 40%～60%濕度和12 h光-暗循環(huán)］, 自由進食和飲水。適應(yīng)環(huán)境1 周后, 將小鼠隨機分為4 組：正常對照組、AA 模型組、陽性對照（美洛昔康）組、紫草素組。

AA 模型建立方法：將小鼠右足跖周圍的毛去除, 對小鼠關(guān)節(jié)進行消毒, 正常對照組小鼠注射生理鹽水（0.02 mL/只）, 其余組均后右足跖部注射0.02 mL CFA, 以注射點周圍出現(xiàn)明顯白泡為佳, 使其致炎發(fā)展成佐劑性關(guān)節(jié)炎（AA）, 造模成功后的第15 天, 模型小鼠再次注射CFA 以更貼近于RA 臨床上反復發(fā)作的特點。在造模20 d 后開始給予藥物治療, 陽性對照組灌胃美洛昔康50 mg/（kg·d）, 紫草素組灌胃紫草素2 mg/（kg·d）, 正常對照組和AA 模型組均灌胃等體積的0.9%生理鹽水, 給藥周期為60 d。記錄小鼠體重和足踝處腫脹程度, 從而對關(guān)節(jié)炎癥狀進行評分。

1.2.2 樣本收集 小鼠最后一次灌胃給藥后禁食24 h, 解剖前稱重并記錄體重, 采血, 3 000 r/min 離心10 min, 血清-80 ℃保存?？焖偾谐暾挠易沲钻P(guān)節(jié)部位, 固定在4%磷酸鹽緩沖多聚甲醛中進行組織學分析, 4 ℃保存。取出脾臟和胸腺, 稱重后計算脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。免疫器官指數(shù)（mg/g）=免疫器官（脾臟、胸腺）/體質(zhì)量。

1.2.3 足跖腫脹度和關(guān)節(jié)炎評分 造模前測量小鼠的后肢足跖厚度, 取平均值作為基數(shù)后進行AA 造模。給藥前測定和給藥后每隔7 d 測定足跖厚度。足跖腫脹度=（給藥后足跖厚度-造模前足跖厚度）/造模前足跖厚度。

采用關(guān)節(jié)炎分數(shù)評分法于給藥前和給藥后每隔7 d 記錄關(guān)節(jié)炎病變嚴重程度, 每組盲選3 只, 取其平均值為關(guān)節(jié)炎分數(shù)。關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分標準見表1。

表1 關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分標準

1.2.4 組織學分析 采用HE 染色法觀察足踝關(guān)節(jié)組織學變化, 判定小鼠的滑膜炎癥程度和軟骨破壞程度以及骨浸潤程度。

1.2.5 測定血清中炎癥因子和抗氧化因子活性 測定血清中炎癥因子一氧化氮（NO）、腫瘤因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）和白細胞介素1β（IL-1β）含量, 血清中抗氧化因子丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活力。

1.2.6 統(tǒng)計分析 使用Graph-Pad Prism 8.0 軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)值以均數(shù)±標準差（s）表示。組間均數(shù)比較采用t檢驗或單因素方差分析, 然后采用紐曼-科伊爾斯檢驗。P＜0.05 時, 對比組之間的差異具有顯著性意義；P＜0.01 時, 對比組之間的差異具有極顯著性意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 造模前后小鼠關(guān)節(jié)變化

在第二次免疫完成后, 拍照記錄造模后的變化情況。根據(jù)圖1 可知, 對正常的小鼠進行建模后, AA 模型組與正常組小鼠相比關(guān)節(jié)處可見明顯的紅腫, 足跖腫大現(xiàn)象, 表明AA 模型建立成功。

圖1 正常小鼠和AA 模型小鼠關(guān)節(jié)變化對比情況

2.2 給藥后小鼠關(guān)節(jié)變化

在處死前拍照記錄小鼠足跖處情況, 分析給藥前后變化情況。給藥60 d 后, 可見正常對照組的小鼠關(guān)節(jié)處正常, 未出現(xiàn)紅腫和關(guān)節(jié)變形的現(xiàn)象（圖2）。AA 模型組明顯出現(xiàn)紅腫和潰爛現(xiàn)象。而美洛昔康組和紫草素組, 小鼠足跖腫脹明顯消退, 關(guān)節(jié)處的潰爛情況也得到改善。類風濕關(guān)節(jié)炎的臨床表現(xiàn)關(guān)節(jié)紅腫、僵硬、疼痛, 嚴重者出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形。紫草素組與美洛昔康組腫脹程度均弱于AA 模型組, 說明紫草素可以減輕炎癥, 對小鼠關(guān)節(jié)炎有很好的治療作用, 并且效果與美洛昔康相近。

圖2 給藥后小鼠關(guān)節(jié)變化情況

2.3 紫草素對小鼠體重的影響

根據(jù)圖3 可知, 正常對照組小鼠體重平穩(wěn)增長, 變化幅度明顯, AA 模型組小鼠體重增長幅度不大。與AA 模型組相比, 紫草素組與美洛昔康組小鼠體重增長幅度明顯, 差異顯著或極顯著（P＜0.05 或P＜0.01）。正常組小鼠體重最大, 其次為紫草素組、美洛昔康組, 最后為AA 模型組, 說明致炎后小鼠的體重增長受到了嚴重抑制, 紫草素治療對小鼠體重恢復具有促進作用。類風濕關(guān)節(jié)炎會引起胃腸道并發(fā)癥, 對小鼠的消化吸收產(chǎn)生影響。因此, 小鼠出現(xiàn)食欲下降從而導致體重下降的現(xiàn)象。

圖3 紫草素對小鼠體重的影響（n=6, ±s）

2.4 紫草素對小鼠足跖腫脹和關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響

通過測量足跖厚度和觀察組織外觀, 計算足跖腫脹度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分來判定小鼠關(guān)節(jié)炎程度。由圖4a 可知, 與AA 模型組相比, 紫草素組和美洛昔康組小鼠組織腫脹度顯著下降（P＜0.05 或P＜0.01）。由圖4b 可知, 與AA 模型組相比, 紫草素組和美洛昔康組小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分顯著下降（P＜0.05 或P＜0.01）。紫草素可以減輕足跖腫脹, 降低關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分, 表明對關(guān)節(jié)炎有一定的治療作用。

圖4 紫草素對AA 模型小鼠足跖腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)的影響（n=6, ±s）

2.5 紫草素對小鼠免疫器官指數(shù)的影響

通過測定免疫器官指數(shù)來判定小鼠的免疫程度。由圖5a 可知, 與正常對照組相比, AA 模型組小鼠的胸腺指數(shù)明顯增加。與AA 模型組相比, 紫草素組和美洛昔康組小鼠胸腺指數(shù)明顯下降, 差異顯著（P＜0.05）；由圖5b 可知, 與正常對照組比較, AA模型組小鼠的脾臟指數(shù)顯著增加。與AA 模型組相比, 紫草素組和美洛昔康組小鼠脾臟指數(shù)明顯下降, 差異顯著（P＜0.05）。AA 模型組小鼠由于機體免疫過度表達導致免疫器官指數(shù)大幅增加, 而紫草素組和美洛昔康組顯著降低了AA 模型組小鼠免疫器官指數(shù), 并且和正常組相比, 免疫器官指數(shù)略有增加。紫草素對胸腺和脾臟促進恢復的作用, 降低脾臟及胸腺過度腫大, 減少適應(yīng)性免疫細胞的過度增殖。

圖5 紫草素對AA 模型小鼠免疫器官指數(shù)（脾臟、胸腺）的影響（n=6, ±s）

2.6 紫草素對AA 模型小鼠足踝關(guān)節(jié)組織病理學特征的影響

通過對AA 模型小鼠足踝關(guān)節(jié)組織HE 染色, 了解AA 模型所致關(guān)節(jié)炎的情況。由圖6 可知, AA 模型組明顯出現(xiàn)滑膜增生, 滑膜組織內(nèi)出現(xiàn)炎性細胞浸潤和細胞壞死情況, 關(guān)節(jié)處出現(xiàn)部分骨質(zhì)破壞, 關(guān)節(jié)腔間隙減小。與AA 模型組相比, 紫草素組與美洛昔康組關(guān)節(jié)軟骨破壞有明顯改善, 炎性細胞浸潤和滑膜增生也明顯減少, 表明紫草素可以明顯改善AA 模型小鼠的關(guān)節(jié)組織病理學損傷, 保護滑膜組織和細胞結(jié)構(gòu)的完整性。

圖6 紫草素對AA 模型小鼠足踝關(guān)節(jié)組織病理學特征的影響（400×）

2.7 紫草素對AA 模型小鼠血清中MDA 含量和SOD 酶活力的影響

測定了小鼠血清中MDA 含量和SOD 酶活力以評價紫草素的抗氧化效果。由圖7 可知, 與正常對照組相比, AA 模型組小鼠血清中MDA 的含量明顯增加, SOD 酶活力明顯下降。而與AA 模型組相比, 紫草素組和美洛昔康組血清中MDA 含量顯著減少, SOD 酶活力顯著增加（P＜0.05）, 表明紫草素可以減少MDA 含量、增加SOD 酶活力, 從而減輕AA 模型所致RA 的氧化應(yīng)激。

圖7 紫草素對AA 模型小鼠血清中MDA 含量和SOD 酶活力的影響（n=6）

2.8 紫草素對AA 模型小鼠血清中炎癥因子含量影響

測定了小鼠血清中NO、TNF-α、IL-6 和IL-1β的含量以評價紫草素的抗炎效果。從圖8 可知, 與正常對照組相比, AA模型組血清中NO、TNF-α、IL-6和IL-1β 含量明顯增加。而與AA 模型組相比, 紫草素組和美洛昔康組血清中NO、TNF-α、IL-6 和IL-1β 含量顯著減少（P＜0.05）。紫草素通過下調(diào)炎癥因子表達來減輕RA 的炎癥反應(yīng)。

圖8 紫草素對AA 模型小鼠血清中炎癥因子含量的影響（n=6）

3 小結(jié)與討論

關(guān)節(jié)內(nèi)如果含有大量的氧自由基會抑制軟骨細胞增殖, 并且會導致軟骨細胞凋亡。MDA 是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物, SOD 是超氧陰離子清除劑, 測定MDA 含量和SOD 活力可間接反映體內(nèi)氧自由基的數(shù)目[17］。MDA 含量高低與機體抗氧化能力有關(guān), 是反映機體組織過氧化損傷程度的重要參數(shù)之一。MDA 的產(chǎn)生會加劇細胞膜的損傷, 因此測定小鼠血清中MDA含量的高低可以反映機體脂質(zhì)是否過氧化, 也可以進一步反映組織的損傷程度。MDA 含量越高, 表明組織損傷越嚴重, 炎癥越嚴重。由MDA 含量和SOD活力測定結(jié)果可知, 紫草素對細胞和組織損傷有一定的恢復效果, 并且清除了體內(nèi)過多的氧自由基。在抗氧化因子測定中, 紫草素可以降低MDA, 提高SOD 活力, 提高機體抗氧化能力, 降低AA 模型所致的氧化應(yīng)激損傷的程度。王喜歡等[18］發(fā)現(xiàn)紫草素對高糖誘導的內(nèi)皮細胞有抗氧化應(yīng)激和抑制細胞凋亡作用, 通過升高MDA 和ROS, 降低SOD 和GSH-Px的活力來實現(xiàn)。并且紫草素可以提高高糖誘導的內(nèi)皮細胞的細胞活力, 其作用機理為抑制Nrf2/HO-1通路的激活。楊登科等[19］發(fā)現(xiàn)紫草素對過氧化氫誘導的人黑素細胞有干預氧化應(yīng)急作用, 紫草素可以增強細胞活力, 抑制細胞凋亡, 并且其作用效果跟濃度成正比。

NO 屬于炎癥介質(zhì), 會介導炎癥因子的病理作用。炎癥關(guān)節(jié)中NO 來源主要是軟骨細胞和滑膜細胞。紫草素通過清除炎癥關(guān)節(jié)中的NO 來達到治療關(guān)節(jié)炎和保護細胞的效果。研究表明, TNF-α同樣也會刺激黏附分子, 被刺激的黏附分子可以黏附越來越多的白細胞, 使炎癥作用越來越強, 對巨噬細胞或者非雙核細胞產(chǎn)生刺激, 可以分泌趨化性細胞因子。趨化性細胞因子可以使白細胞在炎癥某一特定部位聚集。根據(jù)國內(nèi)外已有研究顯示RA 的發(fā)病機制主要和TNF-α、IL-1β 有關(guān), 細胞活化能力強的T細胞對巨噬細胞和滑膜細胞有激活的作用, 并且可以釋放IL-1β 和TNF-α[20-22］。RA 患者血清TNF-α、IL-1β 含量明顯高于常人。紫草素具有抗炎作用, Fu 等[23］發(fā)現(xiàn)紫草素可以抑制雄性SD 大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型中炎癥因子（IL-1β、TNF-α 和iNOS）的升高, Yang 等[24］在LPS 誘導的乳腺炎模型中, 發(fā)現(xiàn)紫草素能降低組織上游促炎性細胞因子TNF-α、IL-6 和IL-1β 的水平。本研究表明紫草素對AA 模型小鼠模擬RA 有一定的治療作用, 同時可以改善關(guān)節(jié)和滑膜組織病理損傷, 維持小鼠體重穩(wěn)定。紫草素通過降低炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α 和NO 的含量, 減輕RA 的炎癥反應(yīng)達到治療目的。

本研究利用完全弗氏佐劑進行二次免疫, 成功誘導小鼠AA 模型模擬人類風濕關(guān)節(jié)炎, 證明紫草素可以通過抗氧化應(yīng)激和降低炎癥反應(yīng)來治療AA小鼠, 但并未對其作用機制進行深入探討。