生物鐘基因Per2對Ang Ⅱ誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的影響及機制

李桑柔，劉超利，岳秀青，楊帆，陳睦虎，鐘武

1 西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)部，四川 瀘州 646000；2 四川省康復(fù)醫(yī)院

血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）根據(jù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的不同分為收縮型和合成型兩種表型，收縮型表達(dá)α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）［1］，向合成型轉(zhuǎn)換時，高表達(dá)骨橋蛋白（OPN），導(dǎo)致血管壁張力降低，引發(fā)心血管疾?。?-3］。有研究表明，血管緊張素Ⅱ（Ang Ⅱ）引起的VSMC 表型轉(zhuǎn)換可能是自噬依賴性的，適度的自噬可促進細(xì)胞增殖［4-6］。生物鐘基因使生理活動在24 h 內(nèi)表現(xiàn)出節(jié)律振蕩［7］。Per2 作為轉(zhuǎn)錄抑制基因，表達(dá)生物節(jié)律性，低表達(dá)的Per2 抑制細(xì)胞自噬性凋亡［8-9］。2021 年4 月—2022 年9 月，本研究通過Ang Ⅱ誘導(dǎo)VSMC 發(fā)生表型轉(zhuǎn)換，觀察沉默Per2 和過表達(dá)Per2 對VSMC 表型轉(zhuǎn)換的影響，進一步研究Per2在VSMC表型轉(zhuǎn)換中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 VSMC 購自武漢普諾賽生物科技有限公司。Ang Ⅱ購自北京索萊寶科技有限公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG 購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，DMEM/F12 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司，胎牛血清、0.25% EDTA 胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素、無血清細(xì)胞凍存液購自賽爾瑞成生命科學(xué)技術(shù)有限公司，PVDF 膜購自葆光生物技術(shù)有限公司，預(yù)染蛋白Marker 購自美國Thermo Fisher 公司，Per2 siRNA、riboFECTTMCP 轉(zhuǎn) 染試 劑、pcDNA-Per2、pcDNA3.1-3xFlag-C（對照質(zhì)粒）購自銳博生物科技有限公司，鼠一抗GAPDH、兔一抗β-actin、兔一抗OPN、兔一抗α-SMA、兔一抗Per2、兔一抗LC3、兔一抗p62 購自美國Proteintech 公司，BCA 蛋白濃度測定試劑盒、ECL 化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒、RIPA 裂解液、PMSF、蛋白質(zhì)磷酸酶抑制劑購自阿斯本生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清+1%青霉素-鏈霉素溶液+DMEM/F12培養(yǎng)基于5% CO2、37 ℃恒溫孵箱中，選取傳5～10代、狀態(tài)良好的VSMC用于實驗。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 沉默Per2：將VSMC 接種于6 孔板，2×105/孔，將其隨機分為Control A 組、siRNA 組、Per2 siRNA 組，分別給予常規(guī)培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染空載siRNA、轉(zhuǎn)染Per2 siRNA。將細(xì)胞培養(yǎng)至30%～50%融合時，按說明書用riboFECTTMCP Buffer 稀釋適量Per2 siRNA，再加入riboFECTTMCPReagent 制備成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，室溫孵育15 min，加入無雙抗完全培養(yǎng)基的6孔板中，37 ℃、5% CO2恒溫孵箱中培養(yǎng)48 h。Per2過表達(dá)：將VSMC接種于6孔板，5×105/孔，將其隨機分為Control B組、pcDNA組、pcDNA-Per2組，分別給予常規(guī)培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染空載pcDNA、轉(zhuǎn)染pcDNA-Per2。將細(xì)胞培養(yǎng)至50%～70%融合時，轉(zhuǎn)染前更換為無雙抗完全培養(yǎng)基，將10 μL FTLipoTM加入250 μL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中室溫孵育5 min，將4 μg 高質(zhì)粒DNA-Per2 加入250 μL基礎(chǔ)培養(yǎng)基混勻，將上述兩種混合物混勻室溫孵育20 min，加入6 孔板，37 ℃、5% CO2恒溫孵箱中培養(yǎng)6 h，更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)孵育48 h。用Western blotting法檢測各組Per2蛋白表達(dá)以確認(rèn)轉(zhuǎn)染效率。

1.4 Ang Ⅱ干預(yù) 根據(jù)前期實驗及參考文獻(xiàn)［10］選擇Ang Ⅱ最佳實驗濃度為1×10-7mol/L、最佳干預(yù)時間為48 h。選擇部分細(xì)胞隨機分為Control C組、Ang Ⅱ組、Ang Ⅱ+Per2 siRNA 組，分別給予常規(guī)培養(yǎng)、1×10-7mol/L Ang Ⅱ處理48 h、先轉(zhuǎn)染Per2 siRNA 后再加入1×10-7mol/L Ang Ⅱ處理48 h。另選部分細(xì)胞隨機分為Control D 組、Ang Ⅱ組、Ang Ⅱ+Per2 siRNA 組，分別給予常規(guī)培養(yǎng)、1×10-7mol/L Ang Ⅱ處理48 h、先 轉(zhuǎn) 染pcDNA-Per2 后 再 加 入1×10-7mol/L Ang Ⅱ處理48 h。

1.5 VSMC內(nèi)Per2蛋白、表型轉(zhuǎn)換相關(guān)蛋白（α-SMA、OPN）及自噬相關(guān)蛋白（p62、LC3）表達(dá)檢測 采用Western blotting 法。取出培養(yǎng)箱中VSMC，移去培養(yǎng)基，4 ℃ PBS 洗滌2 次，加入適量的RIPA 冰上裂解30 min，12 000 r/min 離心15 min（離心半徑10 cm），取上清液至1.5 mL EP 管中-20 ℃保存，采用BCA法測定蛋白濃度，根據(jù)上樣量進行濃度調(diào)平，100 ℃煮沸5 min 進行蛋白變性，10 μg 蛋白上樣并SDS-PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上進行轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST 洗滌1 次5 min，在脫色搖床上一抗（1∶1 000 稀釋）4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3 次，各10 min，室溫孵育二抗（1∶1 000 稀釋）1 h，TBST 洗膜3 次，各10 min，ECL 法顯色，置于化學(xué)發(fā)光儀器中滴入適量ECL 發(fā)光液后曝成像，采用Image J 軟件進行灰度定量分析。目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白電泳條帶灰度值/對應(yīng)GAPDH 電泳條帶灰度值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism8.0、SPSS26.0軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Per2 siRNA、pcDNA-Per2 的轉(zhuǎn)染效率 Control A組、siRNA 組、Per2 siRNA 組Per2 蛋白相對表達(dá)量分 別 為0.448 ± 0.057、0.431 ± 0.043、0.245 ± 0.090，Per2 siRNA 組Per2 蛋 白 相 對 表 達(dá) 量 低 于Control B 組、siRNA 組（P均＜0.05）。Control 組、pcDNA 組、pcDNA-Per2組Per2蛋白相對表達(dá)量分別為0.427 ± 0.059、0.432 ± 0.061、0.682 ± 0.063，pcDNA-Per2組Per2蛋白相對表達(dá)量高于Control組、pcDNA組（P均＜0.05）。均轉(zhuǎn)染成功。

2.2 沉默Per2 對表型轉(zhuǎn)換相關(guān)蛋白及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 見表1。

表1 沉默Per2對表型轉(zhuǎn)換相關(guān)蛋白及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s）

表1 沉默Per2對表型轉(zhuǎn)換相關(guān)蛋白及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s）

注：與Control C組比較，*P＜0.05；與Ang Ⅱ組比較，△P＜0.05。

組別Control C組Ang Ⅱ組Ang Ⅱ+Per2 siRNA組α-SMA 0.729 ± 0.075 0.180 ± 0.087*0.355 ± 0.026△OPN 0.200 ± 0.018 0.891 ± 0.041*0.691 ± 0.057△p62 0.631 ± 0.043 0.079 ± 0.022*0.198 ± 0.038△LC3 0.374 ± 0.106 0.676 ± 0.071*0.445 ± 0.024△

2.3 Per2 過表達(dá)對表型轉(zhuǎn)換相關(guān)蛋白及自噬相 關(guān)蛋白表達(dá)的影響 見表2。

表2 Per2過表達(dá)對表型轉(zhuǎn)換相關(guān)蛋白及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s）

表2 Per2過表達(dá)對表型轉(zhuǎn)換相關(guān)蛋白及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s）

注：與Control D組比較，*P＜0.05；與Ang Ⅱ組比較，△P＜0.05。

組別Control D組Ang Ⅱ組Ang Ⅱ+pcDNA-Per2組α-SMA 0.673 ± 0.106 0.345 ± 0.066*0.158 ± 0.043△OPN 0.293 ± 0.081 0.437 ± 0.034*0.682 ± 0.041△p62 0.552 ± 0.079 0.325 ± 0.093*0.108 ± 0.016△LC3 0.239 ± 0.035 0.379 ± 0.062*0.503 ± 0.046△

3 討論

VSMC 具有多樣性，就功能而言存在合成型和收縮型兩種表型，當(dāng)細(xì)胞受到一定刺激時，為應(yīng)對血管損傷，以收縮血管和調(diào)節(jié)血管的張力、血壓和血流分布為主要功能的VSMC 向合成型發(fā)生轉(zhuǎn)變，收縮型蛋白α-SMA、SM22-α 表達(dá)降低，合成型蛋白OPN表達(dá)升高，并分泌彈性蛋白酶、金屬蛋白酶等，促使血管病變的發(fā)生，從而引起主動脈夾層、高血壓、動脈粥樣硬化、肺動脈高壓、腦卒中等一系列疾?。?1-12］。有研究表明，Ang Ⅱ作為腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的重要效應(yīng)分子，可促進VSMC 細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)換。Ang Ⅱ促進VSMC 表型轉(zhuǎn)換可能是自噬依賴性的［13-14］。在心血管系統(tǒng)中，自噬抵抗外界環(huán)境改變對血管的損傷，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞物質(zhì)的合成，并且參與溶酶體降解衰老或者失去功能的細(xì)胞、細(xì)胞器和變性蛋白質(zhì)等生物大分子，使降解和重新利用達(dá)到平衡，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如PI3K/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白信號通路，表達(dá)自噬相關(guān)蛋白p62、LC3、Beclin1、ATG12 等［14］，在營養(yǎng)、能量不足等病理條件下可以調(diào)控細(xì)胞物質(zhì)的重新分配從而維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)［15-16］。然而，過度的自噬會導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下病理狀態(tài)下的細(xì)胞死亡，這種死亡是在生理狀態(tài)下是清除無用的細(xì)胞和受損的蛋白質(zhì)的一種保護機制，以維持自噬和細(xì)胞凋亡之間的平衡對于細(xì)胞發(fā)育至關(guān)重要［17］。

生物鐘基因廣泛存在于生物界，產(chǎn)生和控制各種生物的生理節(jié)律［9］。在哺乳動物中，生理節(jié)律的產(chǎn)生主要位于下丘腦視交叉上核，與調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律的基因組成了中樞生物鐘，適應(yīng)全天不同時間不同活動水平的需求，并調(diào)節(jié)代謝、細(xì)胞增殖、生理和行為等各個方面［18-19］。其中基因Per是主鐘基因，可編碼多種蛋白質(zhì)，若一個氨基酸被取代，就會使周期和轉(zhuǎn)錄循環(huán)發(fā)生改變［20］。生物鐘基因Per2 是維持生物鐘功能的重要轉(zhuǎn)錄抑制因子，研究發(fā)現(xiàn)，生物鐘基因Per2 過表達(dá)通過PI3K-AKT-mTOR 通路激活細(xì)胞自噬，但這種影響是否同樣存在于VSMC 中尚未被證實［21］。NONAKA 等［22］發(fā)現(xiàn)，小鼠主動脈中mPer2、Baml1 有明顯的節(jié)律振蕩，短暫給予Ang Ⅱ可引起mPer2 基因高表達(dá)，隨后引起生物鐘其他成分的同步周期性振蕩。由此猜想，生物鐘基因Per2 可能通過激活細(xì)胞自噬參與VSMC 表型轉(zhuǎn)換。為了進一步探討Per2 與表型轉(zhuǎn)換的關(guān)系，本研究體外構(gòu)建VSMC 表型轉(zhuǎn)換模型，通過沉默及過表達(dá)Per2 研究Per2對自噬及Ang Ⅱ誘導(dǎo)VSMC表型轉(zhuǎn)換的影響。

本研究采用Ang Ⅱ在體外誘導(dǎo)VSMC 發(fā)生表型轉(zhuǎn)換，成功構(gòu)建體外VSMC表型轉(zhuǎn)換模型。與Ang Ⅱ處理VSMC 比較，轉(zhuǎn)染Per2 siRNA 后Ang Ⅱ處理的VSMC，發(fā)現(xiàn)VSMC 表型轉(zhuǎn)換、自噬的發(fā)生被抑制。而pcDNA-Per2 轉(zhuǎn)染經(jīng)Ang Ⅱ處理的VSMC 后，發(fā)現(xiàn)促進VSMC 表型轉(zhuǎn)換及自噬的發(fā)生，再次驗證過表達(dá)Per2促進自噬的發(fā)生，增強VSMC發(fā)生表型轉(zhuǎn)換。

綜上所述，Per2 在VSMC 表型轉(zhuǎn)換中起重要作用。過表達(dá)生物鐘基因Per2 激活細(xì)胞自噬，并促進Ang Ⅱ介導(dǎo)的VSMC 表型轉(zhuǎn)換過程。因此，通過維持正常的生物節(jié)律并調(diào)控自噬抑制VSMC 表型轉(zhuǎn)換的發(fā)生可能減緩血管病變的進展，同時為心血管疾病提供新的治療靶點。本研究不足之處在于生物鐘基因Per2 具有晝夜節(jié)律性，改變正常節(jié)律是否對自噬及Ang Ⅱ誘導(dǎo)VSMC 表型轉(zhuǎn)換產(chǎn)生影響暫未明確；生物鐘基因Per2 如何調(diào)控自噬從而影響VSMC表型轉(zhuǎn)換需進一步研究證實。闡明生物鐘紊亂對VSMC 發(fā)生病理生理改變的影響，對指導(dǎo)心血管疾病的治療具有重大意義，未來的研究應(yīng)關(guān)注這些不足，以提供更全面的結(jié)果。