心肌細(xì)胞中早期內(nèi)涵體的作用研究進展

祖麗皮亞·阿不力海提，曾江正

1 海南醫(yī)學(xué)院第一臨床學(xué)院，?？?570102；2 海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科

內(nèi)涵體是膜運輸過程中的重要細(xì)胞器，根據(jù)其形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能分為三種類型，即早期內(nèi)涵體（EE）、晚期內(nèi)涵體（LE）和分選內(nèi)涵體（SE）［1-2］。EE是接受從細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)吞轉(zhuǎn)入物質(zhì)的第一個內(nèi)吞區(qū)室，而且是一個高度活躍的結(jié)構(gòu)，具有很高的同型融合傾向［3］。EE 的主要作用是根據(jù)內(nèi)吞物質(zhì)的去向而對內(nèi)吞物質(zhì)進行分類，決定這些物質(zhì)重新回到質(zhì)膜中還是進入溶酶體中被進一步降解或傳遞至反式高爾基網(wǎng)絡(luò)中［4］。SE是內(nèi)吞物質(zhì)進行細(xì)胞內(nèi)循環(huán)的膜室結(jié)構(gòu)，通過“快速”回收途徑和“慢速”回收途徑將內(nèi)吞物質(zhì)再次回收到細(xì)胞質(zhì)膜中。在“快速”回收途徑中，SE 將內(nèi)吞物質(zhì)直接從EE 上回收至細(xì)胞質(zhì)膜中，然而在“慢速”回收途徑中，膜小管先將物質(zhì)運送到核周的內(nèi)吞循環(huán)室（ERC）［5］。ERC 后續(xù)會產(chǎn)生流向細(xì)胞質(zhì)膜的循環(huán)內(nèi)涵體，從而將物質(zhì)回收至細(xì)胞質(zhì)膜中。這兩種途徑都是SE 維持細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)循環(huán)的作用機制。如果內(nèi)涵體的形態(tài)結(jié)構(gòu)或功能發(fā)生異常，都能夠影響細(xì)胞正常功能，導(dǎo)致機體出現(xiàn)相關(guān)疾病。心肌細(xì)胞的代謝非常旺盛，其功能由各種受體和體液調(diào)節(jié)。因此心肌細(xì)胞中的內(nèi)涵體，尤其是EE 的功能非常重要。本文對EE 在心肌細(xì)胞中的作用，尤其是近年來的研究進展進行概述。

1 EE的結(jié)構(gòu)和成熟過程

1.1 結(jié)構(gòu) EE是由于細(xì)胞內(nèi)吞作用形成含有內(nèi)吞物質(zhì)膜結(jié)合的細(xì)胞器，在大多數(shù)細(xì)胞中，EE表現(xiàn)為一個精細(xì)且復(fù)雜的多形性區(qū)室結(jié)構(gòu)，由薄管狀延伸物（直徑約為60 nm）和大囊泡（直徑約為400 nm）組成，具有膜內(nèi)陷且能形成多囊狀外觀的特點［6］。EE表面具有特定的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)成分，二者作為EE表面標(biāo)志物，在細(xì)胞內(nèi)吞過程中發(fā)揮重要作用。

EE中的重要蛋白質(zhì)包括以下幾種。①Ras相關(guān)結(jié)合蛋白（Rab）：也稱為小GTP結(jié)合蛋白，其中Rab5是EE最具代表性的表面標(biāo)志物，它參與物質(zhì)從質(zhì)膜到EE 的運輸過程［1，6］。②人VPS34/p150 磷脂酰肌醇3 激酶復(fù)合物：是Rab5 效應(yīng)蛋白之一，其最主要的作用是產(chǎn)生磷脂酰肌醇［PtdIns（3）P］，PtdIns（3）P為EE 中最豐富的磷酸肌醇［1-2］。③EE 抗 原-1（EEA1）：是Rab5 效應(yīng)蛋白，主要作用是調(diào)節(jié)EE 融合過程［1，5］。④可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子受體附著蛋白受體：它是一類高度保守的膜蛋白，可調(diào)節(jié)膜運輸中的融合過程。⑤C-末端Eps15 同源結(jié)構(gòu)域蛋白（EHD）：哺乳動物細(xì)胞中的EHD 主要包括EHD1～4 四種類型，既可調(diào)節(jié)受體的回收過程，又可在EE 運輸中與Rab5、Rab4 協(xié)同發(fā)揮作用。⑥EE 中的動力蛋白：如動力蛋白-動力蛋白激活蛋白復(fù)合物，它是參與EE 囊泡運動的運動蛋白復(fù)合物之一［1-2］。

除此之外，EE 中的脂質(zhì)PtdIns（3）P 通過招募含有特定結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，在膜轉(zhuǎn)運途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用［1］。

1.2 成熟過程 EE 在形態(tài)、定位、組成、功能等方面具有明顯的異質(zhì)性，而且具備很強的同型和異型融合的能力［2］。內(nèi)涵體膜上的GTP 酶從Rab5 到Rab7的轉(zhuǎn)換標(biāo)志著EE逐漸成熟為LE。值得注意的是，Rab7 是典型的LE 標(biāo)志物。內(nèi)涵體中Rab5 的丟失與Rab7 的獲取同時發(fā)生的這一過程被稱為“Rab轉(zhuǎn)換”。研究表明，Rab 轉(zhuǎn)換是細(xì)胞外環(huán)境中的物質(zhì)從EE傳遞至LE的機制。內(nèi)涵體中所有的分子活動都具有嚴(yán)密且精準(zhǔn)的調(diào)控機制，EE的成熟過程也不例外。EE 向LE 的轉(zhuǎn)變是在復(fù)雜的正反饋環(huán)路調(diào)控下進行的。首先，Rab5 被Rabex5 募集到內(nèi)涵體上，Rabex5 是Rab5 特異性的鳥嘌呤交換因子。隨后，Rab5效應(yīng)因子Rabaptin-5進一步促進鳥嘌呤交換因子的活動，整個過程為Rab5的激活提供了一個正反饋環(huán)路［4］。SAND-1/Mon1 是EE 成熟為LE 過程（也稱為Rab 轉(zhuǎn)換）的轉(zhuǎn)換開關(guān)，可以調(diào)控Rab5 和Rab7的活性狀態(tài)。在這一過程中，SAND-1/Mon1 通過取代EE 膜上的Rabex5 而作為正反饋環(huán)路的干擾物，而且，它也通過與Rab7 的鳥嘌呤交換因子HOPS 復(fù)合物相互作用來積極推動Rab7 在內(nèi)涵體上的募集過程。除此之外，內(nèi)涵體成熟的另外一種機制是磷酸肌醇轉(zhuǎn)換（PI conversion），這里的PI指PtdIns（3）P、PtdIns（3，5）P（2），它們是鑒別EE 和LE 膜的兩種不可或缺的脂質(zhì)［2］。二者可以招募許多具有PI結(jié)合域的效應(yīng)蛋白，包括FYVE、PH、PX、GRAM，從而實現(xiàn)PI轉(zhuǎn)換。換句話說，PI轉(zhuǎn)換本質(zhì)上是通過PIKfyve的募集來實現(xiàn)PtdIns-3-P到PtdIns-3，5-P的轉(zhuǎn)換。除了內(nèi)涵體形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化，作為內(nèi)吞細(xì)胞器，內(nèi)涵體腔內(nèi)環(huán)境pH 的改變也是內(nèi)涵體成熟的必然條件。EE的pH 6.1～6.8，LE的pH 4.8～6.0，而溶酶體的pH則可降至大約4.5［4，7］。由此可見，內(nèi)涵體的成熟必須經(jīng)過酸化這一重要的腔內(nèi)變化。酸化是由液泡型H+ATP酶調(diào)控，它們是大型復(fù)雜的質(zhì)子泵，由膜相關(guān)的V0 復(fù)合體（可充當(dāng)質(zhì)子的跨膜孔）和可溶性的胞質(zhì)V1復(fù)合體（可結(jié)合并水解ATP）構(gòu)成。管腔pH 值的調(diào)節(jié)包括V-ATPase濃度的調(diào)節(jié)、V-ATPase亞型的選擇以及V0 和V1 復(fù)合物的結(jié)合、解離等［7］。在此過程中，越來越多的H+進入EE 管腔，引起pH 下降，導(dǎo)致EE向LE形態(tài)變化的發(fā)生。

2 EE的作用及相關(guān)疾病

2.1 作用

2.1.1 分選作用 如上所述，EE 是通過內(nèi)吞途徑對物質(zhì)（如受體和脂質(zhì)等）進行分類的關(guān)鍵站點，這正是EE 首要且最有價值的功能［1］。物質(zhì)被EE 吸收后分類到各種內(nèi)吞途徑中，包括被回收到細(xì)胞質(zhì)膜中、在溶酶體中降解或運送至反式高爾基體網(wǎng)絡(luò)（trans-Golgi 網(wǎng)）中［8］。EE 參與膜轉(zhuǎn)運介導(dǎo)的營養(yǎng)吸收、免疫、細(xì)胞遷移、黏附和細(xì)胞分裂等基本過程。因此，EE的分選作用對哺乳動物細(xì)胞維持正常功能至關(guān)重要［5］。

2.1.2 在細(xì)胞中的多種作用 EE 是信號通路中的調(diào)控連接器［9］，EE 的運動在細(xì)胞中具有多種作用。EE 可以將致病因子從感染的菌絲頂端轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核。而且，EE的運動在信號正確解碼過程中的作用不可忽視［10］。N-甲基-D-天冬氨酸受體（NMDAR）激活的ERK/MAPK 信號通路也是由EE 分選調(diào)控。NMDAR信號通路異常與幾種癌癥相關(guān)，如阻斷NMDAR 受體可對乳腺癌細(xì)胞株中EE 的功能產(chǎn)生顯著作用，這表明異常的谷氨酸信號通路可能通過內(nèi)吞動力學(xué)的失調(diào)促進了癌的發(fā)生［9］。因此，糾正NMDAR 依賴性膜轉(zhuǎn)運過程中的缺陷可能為癌癥治療提供潛在的研究方向。

2.1.3 在細(xì)胞自噬中的作用 自噬是在正常和應(yīng)激條件下維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的細(xì)胞內(nèi)降解途徑。EE參與自噬囊泡或降解性自噬囊泡的形成［11］。內(nèi)涵體中的一些蛋白質(zhì)，如Rab 蛋白（Rab11、Rab33b、Rab5、Rab7）及EEA1都可影響自噬過程［12］。細(xì)胞內(nèi)吞和自噬之間存在著相互作用［13］。因此，Rab 蛋白既可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)吞又參與自噬過程，從而能夠控制細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。因此，EE是內(nèi)吞和自噬通路調(diào)節(jié)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)所必需的。

2.2 相關(guān)疾病 蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等大分子物質(zhì)與EE聯(lián)系途徑中的缺陷干擾了EE 的成熟過程和功能。EE 成熟過程中Rab5-Rab7“轉(zhuǎn)換開關(guān)”的破壞可能是導(dǎo)致EE 腫大的機制之一，而EE 的異常腫大或數(shù)量增多是多種疾病的發(fā)病機制［2］。研究表明，在阿爾茨海默病的早期階段，許多神經(jīng)元的Aβ 肽水平升高，并且Rab5 陽性的EE 增大［14］。類似的內(nèi)吞缺陷也見于唐氏綜合征、尼曼-皮克病C型和老年性黃斑變性。Rab5 內(nèi)涵體運動能力的降低導(dǎo)致亨廷頓病患者的神經(jīng)退行性變。EEA1 的表達恢復(fù)了MECP2 缺失神經(jīng)元的穩(wěn)態(tài)突觸可塑性，為干預(yù)Rett綜合征提供了新的靶點［15］。而且，研究發(fā)現(xiàn)，在帕金森病和HIV-1 Tat神經(jīng)毒性中均存在內(nèi)涵體-溶酶體系統(tǒng)功能障礙［14］。

3 EE在心肌細(xì)胞中的作用

3.1 EE 在心臟電生理中的作用 正常的心臟功能依賴于膜離子通道、轉(zhuǎn)運體、泵、激素受體的協(xié)同活動來動態(tài)調(diào)節(jié)膜電化學(xué)梯度以應(yīng)對急性和慢性應(yīng)激［16］。在膜蛋白的表達和定位過程中，內(nèi)涵體系統(tǒng)是主要的調(diào)節(jié)因子，同時它也調(diào)節(jié)心臟的興奮性。EHD3 是EE 的標(biāo)志物之一，是心臟內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運的重要組成部分，通過調(diào)節(jié)心室內(nèi)Na+/Ca2+交換器（NCX）和電壓門控L型Ca2+通道的順行轉(zhuǎn)運，維持心臟興奮性［16］。EHD3 在心臟膜蛋白運輸和正常生理中起關(guān)鍵作用，并與心臟疾病的發(fā)生密切相關(guān)。EHD3 缺乏的小鼠表現(xiàn)出心動過緩、心率下降、Ⅱ型傳導(dǎo)阻滯和對β2-腎上腺素受體刺激的遲鈍反應(yīng)，在保持心輸出量不變的情況下，EHD3 缺乏小鼠的心臟顯著增大。此外，EHD3 與細(xì)胞骨架膜適配蛋白（AnkB）之間存在直接的蛋白/蛋白相互作用。AnkB 和EHD3 功能喪失可導(dǎo)致心臟功能嚴(yán)重受損，最終導(dǎo)致患者出現(xiàn)心室顫動、心房顫動、竇房結(jié)疾病、房室傳導(dǎo)阻滯、心源性猝死等［17］。EE 的其他標(biāo)志物也參與離子通道的轉(zhuǎn)運。如Rab5 是快速內(nèi)吞電壓門控K+通道（Kv通道）的主要效應(yīng)體，這對心肌細(xì)胞的動作電位復(fù)極至關(guān)重要。Rab4 參與Kv1.5通道的內(nèi)化后轉(zhuǎn)運［18］。此外，在心臟興奮收縮耦聯(lián)過程中，心室肌的動作電位觸發(fā)單個肌細(xì)胞中電壓依 賴 性 的L 型Ca2+（CaV1.2）通 道 短 暫 打 開［23］。CaV1.2 通道的三種內(nèi)涵體宿主分別位于Rab4 陽性的EE、Rab11 陽性的循環(huán)內(nèi)涵體和Rab7 陽性的LE/溶酶體［19］。CaV1.2 通道在心肌細(xì)胞肌膜上的表達受EE 及其蛋白標(biāo)志物特別是Rab 蛋白的嚴(yán)格控制和調(diào)控，并不斷被EE 內(nèi)化、分類、循環(huán)。而且，在應(yīng)對急性缺氧和缺血時，心臟NaV1.5 通道中有促心律失常的晚期鈉電流通過，被稱為缺氧誘導(dǎo)晚期電流。心肌缺氧可引起Na+內(nèi)流增加、細(xì)胞內(nèi)Na+濃度升高以及膜電位去極化，這是導(dǎo)致致命性心律失常的常見機制［20］。因此認(rèn)為EE 是調(diào)節(jié)離子通道交換的關(guān)鍵細(xì)胞器。探索EE 在離子通道轉(zhuǎn)運中的作用及其調(diào)控機制對維持正常心臟功能、深入了解心臟疾病的發(fā)病機制具有重要意義。

3.2 EE 在心臟疾病診斷中的作用 EE 起源于外泌體，而外泌體在急性心肌梗死（AMI）中具有很強的信息傳遞潛能［21］，并且已被用作診斷癌癥的生物標(biāo)志物。EE 通過內(nèi)涵體膜向內(nèi)出芽形成腔內(nèi)囊泡（ILV），也稱為外泌體前體。ILV 與質(zhì)膜融合，釋放ILV 到細(xì)胞外空間（外泌體）［22］，這一過程以依賴于運輸所需的內(nèi)涵體分選復(fù)合體（ESCRT）或不依賴于ESCRT 的方式進行。外泌體也可將具有生物活性的RNA 分子轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞。在AMI中，與心肌肌鈣蛋白相比，可以更早在血液中檢測到心肌特異性miRNA（心肌梗死后＜4 h），外泌體可為診斷或預(yù)測缺氧缺血性疾病的潛在生物標(biāo)志物［23］。由于來自EE 的外泌體在心臟疾病中有重要作用，因此EE 可能成為心臟疾病診斷的標(biāo)志物之一。但目前該結(jié)論仍不完全明確，有待進一步探索。

3.3 EE在心臟相關(guān)受體的內(nèi)化、表達、調(diào)節(jié)和細(xì)胞致敏中的作用 EE還參與許多受體的內(nèi)吞過程，這些受體在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。蛋白酶活化受體（PAR）是G 蛋白偶聯(lián)受體［24］，能引起細(xì)胞對凝血和抗凝血蛋白酶的反應(yīng)。與β2-腎上腺素受體一樣，激活后的PAR 迅速磷酸化并與信號通路解耦，然后立即內(nèi)化到EE 中，并被分選到溶酶體進行降解。而未激活的PAR 在細(xì)胞表面和EE 之間不斷循環(huán)，并產(chǎn)生內(nèi)部受體池，這對補充細(xì)胞表面未激活的受體起重要作用，從而促進細(xì)胞的再敏化。除此之外，心肌對凝血酶有特異性反應(yīng)，這說明心肌細(xì)胞中存在一種新的凝血酶受體，這種受體可能在心律失常發(fā)生中發(fā)揮作用，或具有繼發(fā)于復(fù)極延長的抗心律失常作用，其與PAR 以同樣的方式內(nèi)化到EE 中。EE 在血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的內(nèi)吞和膜轉(zhuǎn)運中具有相似的分選功能，VEGF 是血管生成的關(guān)鍵因素，在冠狀動脈旁路形成中發(fā)揮核心作用［25］。

3.4 EE 在心力衰竭中的作用 心肌是一種高度氧化性組織。線粒體融合、裂變、起源和線粒體吞噬不僅與心血管疾病有關(guān)，而且對于維持最佳心臟功能至關(guān)重要。線粒體功能受損、線粒體吞噬減少及衰老過程與心力衰竭的發(fā)生和進展有關(guān)［26］。如前文所述，在哺乳動物細(xì)胞中，EE 在內(nèi)涵體和自噬通路中都是必需的，它還可以通過包括選擇性自噬、微自噬和內(nèi)涵體-溶酶體降解等途徑清除受損的線粒體［27］。Rab5 依賴的內(nèi)涵體途徑可以清除E3 泛素連接酶Parkin 標(biāo)記降解的去極化線粒體。此外，Rab5陽性的EE 通過ESCRT 機制將線粒體內(nèi)化，然后將其傳遞到溶酶體降解［28］。EE 在線粒體清除中發(fā)揮重要作用，有望成為治療或預(yù)防心臟疾病的靶點。

3.5 EE 在病毒侵入心肌細(xì)胞中的作用 很多病毒依靠低pH激活融合蛋白，融合蛋白能夠?qū)⒉《景づc內(nèi)涵體膜結(jié)合［29］。EE 表面的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)與病毒融合的完成與將病毒核衣殼釋放到細(xì)胞質(zhì)有關(guān)［30-31］。EE 酸化不足延遲了禽肉瘤與白血病病毒融合［32］。病毒融合需要酸性的EE 環(huán)境，而EE 的成熟必須經(jīng)過酸化才得以實現(xiàn)，這意味著抑制早期向LE 轉(zhuǎn)化的過程可能會干擾病毒的融合，從而抑制病毒侵入細(xì)胞。病毒性心肌炎的發(fā)生可能與病毒和宿主細(xì)胞膜融合過程緊密相關(guān)。如果干擾EE 成熟的過程，可切斷病毒侵犯心肌細(xì)胞的途徑，從而進一步控制病毒性心肌炎的進展。因此，EE有望成為病毒性心肌炎干預(yù)治療的新靶點。

EE能從細(xì)胞外環(huán)境中接收大分子物質(zhì)和溶質(zhì)，通過分選機制決定內(nèi)吞物質(zhì)的去向。EE 表面標(biāo)志物具有特定的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)成分都在細(xì)胞內(nèi)吞過程中發(fā)揮重要的作用。EE因其結(jié)構(gòu)和功能的多樣性，在維持心肌細(xì)胞正常功能，心臟疾病發(fā)生、發(fā)展及治療中具有重要意義，通過對EE的研究也為從分子生物學(xué)角度了解心臟疾病的發(fā)生機制奠定基礎(chǔ)，同時為心臟疾病的藥物靶向治療、分子干預(yù)治療等提供理論依據(jù)。