缺氧狀態(tài)下AH患兒通過調(diào)節(jié)DC功能加重AR免疫反應(yīng)及機(jī)制研究*

林超萍 雷旭艷 唐雋 仇穎妍 王凱

變應(yīng)性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是最常見的慢性上呼吸道過敏性疾病之一，由于機(jī)體接觸變應(yīng)原IgE 介導(dǎo)的鼻黏膜非感染性慢性炎性疾病，我國(guó)患病率為8%～21.4%，該疾病的大流行給患者和社會(huì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)，并影響其生活質(zhì)量[1]。腺樣體為咽扁桃體，位于鼻咽頂后壁的淋巴組織，參與咽淋巴環(huán)，是呼吸道的一道重要的免疫防御門戶，在嬰幼兒早期參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)，一般10 歲以后開始逐漸退化萎縮，而腺樣體肥大（adenoid hypertrophy，AH）可堵塞鼻咽部，引起鼻竇炎、中耳炎、心肺功能改變等臨床癥狀，甚至影響兒童的額面部骨骼發(fā)育、性格形成和智力發(fā)育等[2]。研究表明AR 是AH 的主要原因[2-3]，而缺氧狀態(tài)下AH是否能夠加重AR 免疫反應(yīng)及機(jī)制尚不清楚。樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）是功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用，可分為髓樣DC 和漿細(xì)胞樣DC 等不同特異性DC 亞群，參與維持氣道炎癥、調(diào)節(jié)T 細(xì)胞免疫應(yīng)答和免疫耐受等作用，誘發(fā)氣道變應(yīng)性炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)，而白細(xì)胞介素-17 受體B（human interleukin-17 receptor B，IL-17RB）、白細(xì)胞介素-33（human interleukin-33，IL-33）及其受體（ST2）、胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）的受體（TSLPR）的表達(dá)可反映DC 的功能[4-5]。目前已有研究表明低氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia inducible factor-1，HIF-1α）可激活DC 功能而加重AR 的Th2 介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，Th2 細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素-4（IL-4）、白細(xì)胞介素-5（IL-5）和白細(xì)胞介素-17（IL-17）等細(xì)胞因子，促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞反應(yīng)和IgE 分泌，并產(chǎn)生抗炎作用，可誘導(dǎo)免疫反應(yīng)[6-7]。因此，本研究擬分析AH 患兒及AH 合并AR 患兒HIF-1α 表達(dá)、DC 功能（IL-17RB、ST2 和TSLPR）、Th2 相關(guān)因子（IL-4、IL-5和IL-17）表達(dá)，并探討AH 合并AR 患兒HIF-1α與Th2 相關(guān)因子的相關(guān)性，為指導(dǎo)AR 的診斷及治療提供重要的基礎(chǔ)試驗(yàn)證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一 般資料 選擇2018 年1 月-2020 年12 月佛山市第一人民醫(yī)院鼻科診治的100 例AH 患兒進(jìn)行前瞻性研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）AH 患兒符合睡眠時(shí)出現(xiàn)響亮的鼾聲，伴有呼吸暫停、憋氣等癥狀，經(jīng)纖維鼻咽鏡檢測(cè)為AH，其中腺樣體/鼻腔比值＞0.6；（2）AR 診斷符合2 項(xiàng)及以上臨床癥狀：鼻塞、清水樣涕、噴嚏、鼻癢癥等，且每天累計(jì)1 h 以上或癥狀持續(xù)性，皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)陽(yáng)性，血清IgE＞0.35 kU/L。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）鼻腔狹窄、鼻中隔偏曲、藥物性鼻炎、感染性鼻炎；（2）患有免疫功能低下的疾病，如先天性免疫球蛋白缺陷等。根據(jù)是否伴有AR 將患兒分為AH 組40 例（單純性AH 患兒），AH 合并AR 組60 例（AH 合并AR 患兒），同期選擇對(duì)照組50 例（健康對(duì)照兒童）。所有AH 患兒均在全麻下進(jìn)行腺樣體切除術(shù)，留取鼻腔黏膜腺樣體部分標(biāo)本，抽取所有研究對(duì)象血液標(biāo)本待用。對(duì)照組兒童在鼻內(nèi)鏡下檢查時(shí)鉗取少許鼻咽淋巴組織標(biāo)本。本研究通過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 采用美國(guó)BD FACSAria Ⅲ流式細(xì)胞儀，全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自德國(guó)BMG 公司，HIF-1α 試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D 公司（貨號(hào)：RDC3272）；IL-4、IL-5 和IL-17 試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D 公司，貨號(hào)分別為D4050、D5000B 和D1700。IL-17RB、ST2 和TSLPR 抗體購(gòu)自美國(guó)R&D 公司貨號(hào)分別為AF1207、AF523 和FAB5461P。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）將鼻腔黏膜組織腺樣體標(biāo)本切碎，勻漿后，稀釋離心取上清液，提取蛋白；血液標(biāo)本離心后留取血清液待測(cè)量。采用ELISA 法檢測(cè)三組腺樣體組織勻漿后的上清標(biāo)本和血清中HIF-1α 和Th2 相關(guān)因子（IL-4、IL-5 和IL-17）表達(dá)。

1.2.3 流式分析術(shù) 采用密度梯度離心法分離出外周血單核細(xì)胞（PBMCs），采用CD14 免疫磁珠篩選單核細(xì)胞，將其置于含有重組人單核細(xì)胞集落刺激因子和IL-4 的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取細(xì)胞置于懸液中，PE 標(biāo)記的IL-17RB、APC 標(biāo)記的ST2 和Alexa Fluor 700 標(biāo)記TSLPR 抗體孵育30 min，PBS 漂洗后加入相應(yīng)二抗孵育，加入流式懸液，于流式細(xì)胞儀檢測(cè)髓系DC 中IL-17RB、ST2 和TSLPR 的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用Bonferroni 法；采用Pearson 分析HIF-1α 與Th2 相關(guān)因子的相關(guān)性。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AH 合并AR 組、AH 組和對(duì)照組一般資料比 較 AH 合并AR 組男35 例，女25 例；年齡5～9 歲，平均（7.48±1.37）歲。AH 組男20 例，女20 例，年齡6～9 歲，平均（7.27±1.53）歲。對(duì)照組男27 例，女23 例；年齡6～11 歲，平均（7.87±2.72）歲。三組一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 三組HIF-1α 表達(dá)水平比較 AH 合并AR 組、AH 組血液和鼻黏膜中的HIF-1α 水平均高于對(duì)照組，且AH 合 并AR 組均高 于AH 組（P＜0.001），見表1。

表1 三組HIF-1α表達(dá)水平比較[pg/mL，（）]

表1 三組HIF-1α表達(dá)水平比較[pg/mL，（）]

*與對(duì)照組比較，P＜0.05；#與AH 組比較，P＜0.05。

2.3 三組IL-17RB、ST2 和TSLPR 比較 與對(duì)照組比較，AH 合并AR 組、AH 組DC 中IL-17RB、ST2和TSLPR 的表達(dá)均明顯升高，且AH 合并AR 組均高于AH 組（P＜0.05），見表2。

表2 三組IL-17RB、ST2和TSLPR比較[%，（）]

表2 三組IL-17RB、ST2和TSLPR比較[%，（）]

*與對(duì)照組比較，P＜0.05；#與AH 組比較，P＜0.05。

2.4 三組Th2 相關(guān)因子比較 與對(duì)照組比較，AH 合并AR 組、AH 組血液和鼻黏膜Th2 相關(guān)因子（IL-4、IL-5 和IL-17）的表達(dá)均明顯升高，與AH 組比較，AH 合并AR 組均較高（P＜0.001），見表3。

表3 三組Th2相關(guān)因子比較[pg/mL，（）]

表3 三組Th2相關(guān)因子比較[pg/mL，（）]

*與對(duì)照組比較，P＜0.05；#與AH 組比較，P＜0.05。

2.5 AH合并AR患兒HIF-1α 的表達(dá)水平與Th2 相關(guān)因子的相關(guān)性分析 血清和鼻黏膜的HIF-1α 與IL-4、IL-5 和IL-17 均呈正相關(guān)（P＜0.05），見表4。

表4 AH合并AR患兒HIF-1α的表達(dá)水平與Th2相關(guān)因子的相關(guān)性分析

3 討論

AR 是特應(yīng)性個(gè)體接觸變應(yīng)原后，由免疫球蛋白IgE 介導(dǎo)，多種免疫活性細(xì)胞參與的鼻黏膜非感染性慢性炎癥性疾病。AH 可阻塞呼吸道，表現(xiàn)為口呼吸、流鼻涕、打鼾、睡眠呼吸暫停和低鼻音等癥狀，手術(shù)切除是治療該病的重要方式。AH 和AR是兒童常見病和多發(fā)病，兩者可能同時(shí)存在，并可能引起相似的臨床癥狀[8-10]。研究表明AR 是AH增生的主要因素，而在缺氧狀態(tài)下AH 能否加重AR 的免疫反應(yīng)尚缺乏充足的證據(jù)。闡明AH 缺氧狀態(tài)對(duì)DC 功能的影響及其在AR 發(fā)病中的變應(yīng)性炎癥機(jī)制的作用，研究針對(duì)靶向DC 亞群細(xì)胞的治療新策略是具有重要意義的。

HIF-1α 是一種反映機(jī)體缺氧狀態(tài)的敏感性因子，在缺氧狀態(tài)下，HIF-1α 的表達(dá)升高[11-12]。另有研究探討AR 患兒存在細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與Ras激活MAPK-HIF-1α 通路有關(guān)，但目前尚無(wú)系統(tǒng)性研究探討AH 合并AR 患兒的HIF-1α 與Th2 相關(guān)因子的相關(guān)性[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，AH 組和AH 合并AR 組的HIF-1α 水平均明顯升高，且AH 合并AR 組升高更為明顯，表明AH 為慢性狀態(tài)，可持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間，常伴有部分或完全的鼻功能損害，導(dǎo)致口腔呼吸繞過鼻咽部有限的空氣通道，造成慢性間歇性缺氧，同時(shí)AH 伴隨AR 患兒缺氧更為明顯。

白細(xì)胞介素-25（IL-25）、IL-33 和TSLP 是Th2 免疫反應(yīng)發(fā)展過程中上皮細(xì)胞和DC 之間聯(lián)系的基礎(chǔ)，通過激活DC 成熟分化，刺激Th2 細(xì)胞活化，從而增強(qiáng)Th2 免疫應(yīng)答[5，14-15]。另外，既往研究提示AR 患者骨髓DC 表達(dá)較高水平的IL-17RB、ST2 和TSLPR，與其介導(dǎo)的嗜酸性粒細(xì)胞性炎癥反應(yīng)有關(guān)[4-5]，并與AR 疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，與Th2 水平呈正相關(guān)[4]，但上述研究尚未分析AH 患兒的缺氧指標(biāo)變化及其合并AR 患者DC 功能指標(biāo)變化。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，AH 患兒和AH 合并AR 患兒的IL-17RB、ST2 和TSLPR 水平明顯升高，且AH 合并AR 患兒升高更為明顯，表明AH 患兒或AH 合并AR 患兒觸發(fā)IL-17RB、ST2 和TSLPR信號(hào)通路從而激活DC 的功能在免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的作用。

Th2 免疫反應(yīng)在AH 合并AR 患兒中發(fā)揮著重要作用，其可能通過釋放IL-4、IL-5 和IL-17 等細(xì)胞因子觸發(fā)免疫反應(yīng)[16-18]。本研究中，與對(duì)照組比較，AH 組和AH 合并AR 組的IL-4、IL-5 和IL-17水平明顯升高，且AH 合并AR 組升高更為明顯；相關(guān)性分析提示，AH 合并AR 患兒HIF-1α 水平與IL-4、IL-5 和IL-17 均呈正相關(guān)?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，筆者推測(cè)AH 患兒導(dǎo)致慢性缺氧癥狀，其鼻黏膜組織中HIF-1α 升高，誘發(fā)AR 的Th2 介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，主要機(jī)制是變應(yīng)原刺激上皮細(xì)胞激活DC，釋放趨化因子，募集血管內(nèi)單核細(xì)胞進(jìn)入氣道上皮，從而分化為炎癥性DC，同時(shí)DC 可調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化，向Th2 和Th17 分化，促進(jìn)B 細(xì)胞分化及合成IgE，可產(chǎn)生Th2 細(xì)胞因子（IL-4、IL-5 和IL-17）和趨化因子，導(dǎo)致氣道嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和Th2 細(xì)胞浸潤(rùn)。研究提示，AH 合并AR患兒的病理機(jī)制可能與優(yōu)勢(shì)組織嗜酸性粒細(xì)胞增多和Th2 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有關(guān)，但尚未探討其與DC 功能的相關(guān)性[19-20]，而本研究考慮其可能機(jī)制為DC 介導(dǎo)T 細(xì)胞活化，為該病的機(jī)制研究提供了更為全面的證據(jù)。本研究為單中心小樣本量的研究，且本研究?jī)H為AH 及AH 合并AR 患兒缺氧指標(biāo)、免疫相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)及相關(guān)性分析，尚未進(jìn)行功能性試驗(yàn)驗(yàn)證其具體機(jī)制，今后需進(jìn)一步多中心、擴(kuò)大樣本量的研究，且在相應(yīng)的細(xì)胞模型進(jìn)行功能性實(shí)驗(yàn)。

綜上，AH 患兒和AH 合并AR 患兒，存在HIF-1α、IL-17RB、ST2、TSLPR、IL-4、IL-5 和IL-17 的升高，且AH 合并AR 患兒HIF-1α 水平與IL-4、IL-5 和IL-17 均呈正相關(guān)，提示AH 患兒存在缺氧狀態(tài)，可能引起DC 功能激活，觸發(fā)Th2介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。在臨床上，對(duì)AH 患兒，應(yīng)積極治療腺樣體的肥大和增生，改善其缺氧狀態(tài)，從而減輕AR 的Th2 免疫應(yīng)答反應(yīng)，可達(dá)到改善AR 的過敏免疫反應(yīng)。