雞源奇異變形桿菌的分離鑒定及生物學(xué)特性分析

閆建英，李虎，邢瀟月，劉祥杰，梁成孔，張家浩*

（1.和田地區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局 新疆和田 848000；2.塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 新疆阿拉爾 843300；3.塔里木畜牧科技兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 新疆阿拉爾 843300；4.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木動(dòng)物疫病診斷與防控工程實(shí)驗(yàn)室 新疆阿拉爾 843300）

奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）是腸桿菌科變形桿菌屬，是一種革蘭氏陰性條件致病菌[1]。該菌在自然界分布極廣，不僅可以在人和動(dòng)物體內(nèi)生存[2]，也可存在于土壤和污水等環(huán)境中。該菌可感染宿主種類多樣，能感染豬、牛和羊等常見養(yǎng)殖動(dòng)物，也有文獻(xiàn)報(bào)道在水貂、狐貍和蛇等動(dòng)物中分離到該菌[3]。近年來雞感染奇異變形桿菌的報(bào)道較多[4-7]，給雞養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

隨著抗生素的濫用，奇異變形桿菌的耐藥性逐漸增強(qiáng)，對禽類疾病的治療與預(yù)防造成了極大的困難。賈沅錚[4]等分離的52 株奇異變形桿菌對紅霉素等5 種抗生素100%耐藥；對環(huán)丙沙星等9 種抗生素耐藥性均高于50%。徐睿[5]等分離的2 株奇異變形桿菌耐藥率分別為78.6%（11/14）和71.44%（10/14）。

本試驗(yàn)無菌采集新疆阿克蘇地區(qū)某雞場病雞病料，進(jìn)行病原檢測和細(xì)菌的分離培養(yǎng)，通過形態(tài)學(xué)觀察、生化試驗(yàn)和16S rRNA序列分析進(jìn)行鑒定，同時(shí)研究其耐藥性和致病性，為防控奇異變形桿菌在雞群中的傳播提供參考。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 樣品來源

2022 年7 月，新疆阿克蘇地區(qū)某雞場雛雞出現(xiàn)腹瀉、消瘦、擠作一團(tuán)；剖檢病變主要為肝臟、脾臟等器官出現(xiàn)不同程度的腫大。為確定致雞群發(fā)病的病原，采集病死雞病料置于無菌自封袋中帶回實(shí)驗(yàn)室診斷。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

15 只3 日齡雛雞，購自塔里木大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心。

1.3 試驗(yàn)方法

1）分離和純化。用高壓滅菌棉拭子蘸取肝臟內(nèi)部細(xì)菌接種于BHI 固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12h，挑取單菌落劃線接種于SS 瓊脂固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12h 后，取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，觀察細(xì)菌形態(tài)及染色特性。

2）生化鑒定。將分離株的純培養(yǎng)物分別接種于細(xì)菌微量生化反應(yīng)管中37℃培養(yǎng)24h，觀察試驗(yàn)結(jié)果。

3）16S rRNA 基因的擴(kuò)增。參照文獻(xiàn)[4]合成細(xì)菌16S rRNA 基因通用引物，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長度約為1,465bp。用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取分離菌株的DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系：模板1μL，EasyTaq SuperMix 12.5μL，上、下游引物各0.5μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)齊至25μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃300s；94℃30s，56℃30s，72℃90s，72℃600s，35 個(gè)循環(huán)。將經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格的PCR 產(chǎn)物送至上海生工測序，對所測序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，使用DNA star 對所測的菌株做進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹構(gòu)建及相似性分析。

4）藥物敏感性試驗(yàn)。按照紙片瓊脂擴(kuò)散法，對分離菌株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)。將17 種所測藥敏片平鋪在平板表面，37℃培養(yǎng)24h，測量抑菌圈直徑，判斷分離菌的耐藥性。

5）動(dòng)物回歸試驗(yàn)。挑取培養(yǎng)單個(gè)菌落在BHI 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，直至濃度達(dá)到3×108cfu/mL。動(dòng)物分組：將15 只3 日齡雛雞隨機(jī)分為3 組，每組5 只。第1、2 組為試驗(yàn)組，第3 組為對照組。第1 組腹腔注射0.5mL 含3×108cfu/mL 的菌液，第2 組腹腔注射0.5mL 含3×107cfu/mL 的菌液，第3 組為空白對照組，不作任何處理。每日觀察、記錄試驗(yàn)雛雞情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離純化結(jié)果

37℃培養(yǎng)24～48h 后，在SS 瓊脂固體培養(yǎng)基上生長出中心黑色，周圍白色或橘色的圓形菌落；在BHI 固體培養(yǎng)基上生長出表面光滑，邊緣整齊的無色透明菌落。

2.2 革蘭染色結(jié)果

菌體呈桿狀或短桿狀、革蘭染色陰性、大小均勻、兩端鈍圓、多為散在排列（見圖1）

圖1 分離菌株革蘭染色鏡檢結(jié)果圖（10×100）

2.3 生化鑒定結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌不發(fā)酵麥芽糖、蔗糖、乳糖，甘露醇、賴氨酸脫羧酶、精氨酸脫羧酶、氧化酶試驗(yàn)顯示陰性；分離菌發(fā)酵木糖、葡萄糖、覃糖，山梨醇、尿素分解、枸櫞酸鹽試驗(yàn)為陽性。參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》(第8 版)[8]確定分離菌符合奇異變形桿菌的生化特性。

2.4 16S rRNA 擴(kuò)增結(jié)果

將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示擴(kuò)增條帶約為1,400bp 左右，與預(yù)計(jì)大小相同。將分離菌株分別命名為X001。

2.5 16S rRNA 序列比對結(jié)果與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

由圖1 可知，分離菌株S001 與登錄號(hào)為KC456549、OL629184、OL629187、OL629213、OL629209、OL629230、ON460264、ON329112 等的奇異變形桿菌處于同一分支，將登錄號(hào)為ON000821 的枯草芽孢桿菌作為外圍支（見圖2）。

由圖2 同源性分析表可知，菌株X001 與8 株奇異變形桿菌參考株同源性均高于99.9%，與登錄號(hào)為ON000821 的枯草芽孢桿菌同源性為78.2%。結(jié)合分離菌的形態(tài)、生理生化特征和序列比對結(jié)果，將菌株X001 鑒定為奇異變形桿菌。同源性分析（見圖3）。

圖2 系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖3 同源性分析

2.6 藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

藥敏結(jié)果顯示：分離菌對復(fù)方磺胺甲噁唑表現(xiàn)為中介、對慶大霉素和丁胺卡那表現(xiàn)為敏感，對其他5 種抗生素表現(xiàn)為耐藥。試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 分離菌株的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.7 動(dòng)物回歸試驗(yàn)

攻毒后12h，第1 組雛雞死亡2 只，試驗(yàn)組其他雛雞出現(xiàn)臨床癥狀，表現(xiàn)為精神萎靡、食欲減退、縮頸閉目、畏冷、擠作一團(tuán)、排白色糞便；接種24h 后，第1 組雛雞全部死亡。對死亡雛雞剖檢可見肝臟輕微腫大、表面淤血，脾臟、腎臟有不同程度的腫大。第2 組雛雞至試驗(yàn)結(jié)束未發(fā)生死亡。第3 組雛雞至試驗(yàn)結(jié)束較接種前無變化，各組織器官均未分離出細(xì)菌。將試驗(yàn)組死亡雛雞肝臟等組織進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，菌落形態(tài)、革蘭染色和生化試驗(yàn)結(jié)果與原分離菌一致，16S rRNA 檢測結(jié)果也顯示分離出的細(xì)菌為奇異變形桿菌。

3 討論

在科學(xué)技術(shù)和經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展的時(shí)代下，抗生素被廣泛用于動(dòng)物的感染性疾病和保健品，導(dǎo)致奇異變形桿菌的耐藥性逐漸增強(qiáng)，甚至出現(xiàn)了多重耐藥，使本病的防治十分棘手。本研究中，分離菌X001 表現(xiàn)多重耐藥，以往的研究中也有類似結(jié)果[4-7]。藥敏試驗(yàn)表明，分離菌X001 對復(fù)方磺胺甲噁唑表現(xiàn)為中介、對慶大霉素和丁胺卡那表現(xiàn)為敏感，對其他幾種抗生素表現(xiàn)為耐藥。結(jié)合以往研究可知，國內(nèi)禽源奇異變形桿菌對常用抗生素的耐藥情況較為嚴(yán)重，對藥物的敏感性越來越低，耐藥譜不斷擴(kuò)大。因此臨床用藥時(shí)，一定要先做藥物敏感性試驗(yàn)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果來選擇治療藥物。此外，在養(yǎng)殖過程中要對奇異變形桿菌感染引起足夠的重視，在平時(shí)的飼養(yǎng)中要注意加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，提高養(yǎng)殖動(dòng)物的免疫力，堅(jiān)持防大于治的原則，在治療中要合理用藥。

雛雞回歸試驗(yàn)表明該分離菌可引起雛雞精神萎靡、食欲減退并造成死亡，有較強(qiáng)的致病性，由于該菌是人畜共患病原菌，因此相關(guān)的蛋肉產(chǎn)品可能會(huì)對食品安全構(gòu)成威脅。試驗(yàn)雛雞癥狀和剖檢病變與雞場發(fā)病雞相同，表明奇異變形桿菌是該雞場雛雞發(fā)病、死亡的致病菌。在本病例中，筆者根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果使用慶大霉素進(jìn)行治療，用藥后雞場病雞臨床癥狀消失，死亡率下降。

我國社會(huì)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展雖然推動(dòng)著家禽養(yǎng)殖行業(yè)的向前邁進(jìn)，但因?yàn)榫薮蟮氖袌龈偁幜惋曫B(yǎng)周期的縮短使雞群的免疫力逐漸地降低，尤其是雛雞的奇異變形桿感染率增加，這對于食用性動(dòng)物源產(chǎn)品是一種潛在的巨大的危害。因此，需要對該地區(qū)雞場提供可行性的建議，首先要合理規(guī)范的使用抗菌藥，以降低耐藥性、減少多重耐藥菌株的出現(xiàn)。與此同時(shí)，需要提高動(dòng)物的飼養(yǎng)技術(shù)和管理模式，對圈舍以及養(yǎng)殖環(huán)境制定一個(gè)合理規(guī)范的清潔消毒計(jì)劃，堅(jiān)持自繁自養(yǎng)，全進(jìn)全出，防患于未然。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)從新疆阿克蘇地區(qū)某雞場病雞體內(nèi)分離到1 株細(xì)菌，經(jīng)細(xì)菌分離培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察、生化鑒定和16S rRNA 序列鑒定，確定分離菌為奇異變形桿菌。確診引起該雞場雛雞發(fā)病、死亡數(shù)量增加的病因?yàn)槠娈愖冃螚U菌感染，表明新疆阿克蘇地區(qū)雞群中存在奇異變形桿菌感染，應(yīng)進(jìn)一步改善雞場飼養(yǎng)管理模式并加強(qiáng)禽類食品的安全衛(wèi)生檢測工作。藥敏試驗(yàn)表明分離菌具有多重耐藥性，應(yīng)加強(qiáng)對奇異變形桿菌耐藥性的檢測。本研究為該病的防治和臨床合理用藥提供了科學(xué)依據(jù)?！?/p>