豬瘟疫苗的研究進(jìn)展

李利山，劉玉香，韓斌*

（1.榆林市畜牧獸醫(yī)服務(wù)中心 陜西榆林 719000；2.佳縣畜牧服務(wù)中心 陜西榆林 719200）

豬瘟（classical swine fever，CSF）俗稱“爛腸瘟”“豬霍亂”，是目前危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的傳染性疾病之一，為我國(guó)一類動(dòng)物疫病[1]，主要表現(xiàn)為出血和發(fā)熱，任何年齡、品種、性別的豬和野豬均可發(fā)病，高死亡率，對(duì)生豬養(yǎng)殖場(chǎng)造成的損害大[2]。豬瘟首次報(bào)道于1810 年，1833 年在美國(guó)首次暴發(fā)，1935 年在我國(guó)開始流行。1912年研究表明采用高免血清和攜有豬瘟病毒的血液共同對(duì)豬免疫具有一定的保護(hù)效果，但有一定的散毒風(fēng)險(xiǎn)[3]。1936 年美國(guó)研發(fā)出了豬瘟結(jié)晶紫滅活疫苗，1943 年全世界開始推廣使用豬瘟結(jié)晶紫滅活疫苗，1951—1955 年我國(guó)開始使用結(jié)晶紫滅活疫苗對(duì)豬進(jìn)行免疫。豬瘟結(jié)晶紫滅活疫苗由于產(chǎn)生免疫能力慢、免疫保護(hù)期短、需要培養(yǎng)強(qiáng)毒株、疫苗散布豬瘟風(fēng)險(xiǎn)大和生產(chǎn)成本高等原因在1982年開始停止生產(chǎn)。20 世紀(jì)70 年代—80 年代豬瘟原代細(xì)胞疫苗、2005 年豬瘟豬睪丸傳代細(xì)胞疫苗、2018 年新型豬瘟疫苗基因工程亞單位疫苗等相繼研究獲得成功并開始推廣使用[4]。據(jù)報(bào)道2020 年我國(guó)市場(chǎng)上共有60 余家生產(chǎn)企業(yè)獲得豬瘟疫苗政府生產(chǎn)批文，批簽發(fā)總數(shù)在1,400 多批。目前人們使用和研究的豬瘟疫苗主要為弱毒疫苗和新型豬瘟疫苗。

1 弱毒疫苗

1946 年，國(guó)外研究者開始研制豬瘟病毒減弱的變異毒株。1950年，我國(guó)研究者培育出了一株免疫效果較好的豬瘟兔化弱毒株（C株或HCLV 株），它是石門系（shimen）強(qiáng)毒株通過大耳白兔傳430代，歷經(jīng)4 年多研究成功的致弱疫苗株，由于其具有很好的安全性和免疫性，1956 年開始在國(guó)內(nèi)推廣使用，是我國(guó)主要使用的豬瘟疫苗毒株。到目前為止，豬瘟弱毒疫苗可分為動(dòng)物組織源弱毒疫苗和細(xì)胞源弱毒疫苗。

1.1 動(dòng)物組織源弱毒疫苗

從1957 開始使用成年兔脾臟及淋巴結(jié)（簡(jiǎn)稱脾淋）組織弱毒疫苗，該疫苗是將豬瘟兔化弱毒株接種到兔體內(nèi)，然后采集感染豬瘟病毒兔子的脾臟和淋巴結(jié)進(jìn)行加工制備而成，據(jù)報(bào)道，每只成年兔可制成豬瘟疫苗300 頭劑左右[5,6]。1964 年開始使用3～5 日齡的乳兔組織制備弱毒疫苗，1965 年研究者們發(fā)現(xiàn)將豬瘟病毒接種到1～2 歲的易感牛體內(nèi)后，采集淋巴結(jié)和脾臟組織制成組織疫苗，免疫效果與兔的組織苗效果相似，并在部分區(qū)域開始應(yīng)用，但由于使用牛成本高，疫苗效果不穩(wěn)定，到2005 年后便逐漸減少使用。截至目前豬瘟組織疫苗主要還是成年兔和乳兔的組織弱毒疫苗。兔源組織源疫苗抗體產(chǎn)生快，免疫保護(hù)期長(zhǎng)，疫苗中含有增強(qiáng)免疫因子，能夠增強(qiáng)免疫效果，常用于緊急免疫[7]；不足之處為生產(chǎn)成本高，適宜制作疫苗的兔源減少，不同批次家兔產(chǎn)出疫苗抗原含量有變化，在儲(chǔ)運(yùn)時(shí)均需在-15℃的條件下冷凍保存，實(shí)際應(yīng)用中疫苗容易失活，造成免疫效果參差不齊，為此研究者們研發(fā)出了兔源豬瘟耐熱保護(hù)劑活疫苗，這類疫苗加有耐熱保護(hù)劑，生產(chǎn)出的豬瘟疫苗可在2～8℃環(huán)境中儲(chǔ)存，且保存時(shí)間能夠達(dá)到18 個(gè)月以上。

目前市場(chǎng)上也有售豬瘟多聯(lián)疫苗，如豬瘟三聯(lián)（豬瘟-豬丹毒-豬多殺性巴氏桿菌）弱毒疫苗（兔源+G4T10 株/GC42 株+EO630株），此疫苗是將豬瘟兔化弱毒株接種到乳兔體內(nèi)，然后摘取含有病毒的乳兔組織進(jìn)行研磨，再將豬丹毒桿菌弱毒液和豬源多殺性巴氏桿菌弱毒菌液進(jìn)行混合制備而成。此類疫苗制備工藝要求較高，需要在豬瘟乳兔組織培養(yǎng)物中不含青霉素和鏈霉素。

1.2 細(xì)胞源弱毒疫苗

主要有乳豬腎細(xì)胞苗、羊腎細(xì)胞苗、犢牛睪丸原代細(xì)胞苗、豬睪丸傳代細(xì)胞苗（swine testis cells，ST 細(xì)胞）、牛睪丸細(xì)胞傳代細(xì)胞苗（bovine testis cells，BT 細(xì)胞）。

1）豬瘟原代細(xì)胞苗。將豬瘟病毒接種到原代細(xì)胞中培養(yǎng)，然后收毒制成凍干苗。2020 年獲得政府批簽發(fā)總數(shù)500 多批。1974 年研究者通過乳豬腎原代細(xì)胞成功研究出了豬瘟細(xì)胞源疫苗，1980年通過綿羊腎原代細(xì)胞制出了豬瘟綿羊腎原代細(xì)胞源疫苗，1982年通過奶山羊腎原代細(xì)胞制出了豬瘟奶山羊腎原代細(xì)胞源疫苗，1985 年研究者使用犢牛睪丸原代細(xì)胞制成了豬瘟牛睪丸原代細(xì)胞源疫苗。

豬瘟原代細(xì)胞苗優(yōu)點(diǎn)是生產(chǎn)成本較低，生產(chǎn)量大，批間抗原含量好控制，價(jià)格便宜。不足的地方為免疫后抗體產(chǎn)生較慢，抗體量低，免疫時(shí)需要加大免疫劑量。另外如使用牛睪丸原代細(xì)胞培養(yǎng)，有牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）影響的風(fēng)險(xiǎn)，從而影響疫苗穩(wěn)定性。

2）豬瘟傳代細(xì)胞苗。傳代細(xì)胞苗是用豬瘟病毒兔化弱毒株接種到易感傳代細(xì)胞培養(yǎng)得到的。2020 年豬瘟傳代細(xì)胞疫苗獲得政府批簽發(fā)總數(shù)為500 多批。2005 年研究者使用豬睪丸傳代細(xì)胞制成了豬瘟傳代細(xì)胞源疫苗，2008 年我國(guó)有16 個(gè)省市開始推廣使用，是目前應(yīng)用最多的一種弱毒傳代細(xì)胞疫苗。使用豬睪丸傳代細(xì)胞避免了異源細(xì)胞培養(yǎng)問題，且可以傳代培養(yǎng)，抗原含量高，減少了使用牛血清帶來的BVDV 污染問題[8]。在母源抗體較高的情況下免疫豬瘟傳代細(xì)胞源疫苗，容易產(chǎn)生免疫失敗現(xiàn)象，因此在免疫前需要對(duì)仔豬的豬瘟母源抗體水平進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

目前我國(guó)豬瘟傳代細(xì)胞疫苗主要由以下單位或企業(yè)研發(fā)成功，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2012 年通過了中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所申請(qǐng)的豬瘟豬睪丸傳代細(xì)胞苗，2015 年通過了華威特（北京）生物科技有限公司使用牛睪丸（BT）傳代細(xì)胞制備的豬瘟二聯(lián)活疫苗（豬瘟+豬藍(lán)耳），2020 年通過了軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事獸醫(yī)研究所使用PK/WRL 傳代細(xì)胞制備的豬瘟傳代細(xì)胞苗[9]。

豬瘟傳代細(xì)胞苗多聯(lián)苗有豬瘟二聯(lián)弱毒疫苗（豬瘟-高致病性豬繁殖與呼吸綜合征），該疫苗是將豬瘟兔化弱毒C 株接種到牛睪丸傳代細(xì)胞培養(yǎng)后制成的疫苗，目前已上市。使用該種疫苗進(jìn)行免疫能夠減少免疫次數(shù)，減少豬只的應(yīng)激反應(yīng)和工人勞動(dòng)成本，但對(duì)于已經(jīng)感染豬瘟病毒的豬只或已經(jīng)免疫過豬瘟病毒疫苗的豬只來說并不能夠產(chǎn)生很好的保護(hù)效果。

2 新型豬瘟疫苗

新型豬瘟疫苗主要有亞單位疫苗、活載體疫苗、核酸疫苗、合成肽疫苗、基因缺失苗和反式互補(bǔ)缺失突變疫苗[10]。

2.1 亞單位疫苗

豬瘟亞單位疫苗是指將豬瘟囊膜蛋白基因通過原核表達(dá)系統(tǒng)或真核系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)成為蛋白對(duì)豬進(jìn)行免疫。豬瘟病毒有3 種囊膜蛋白，分別為Erns（E0）、E1 和E2，結(jié)構(gòu)糖蛋白-E2 蛋白，是豬瘟病毒侵入機(jī)體細(xì)胞的重要蛋白[11]，具有很好的免疫原性，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)抵抗病毒抗體，因而為許多研究團(tuán)隊(duì)所重視。研究者們使用畢赤酵母、腺病毒、轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物細(xì)胞、桿狀病毒和基因工程乳桿菌等表達(dá)E2 亞單位疫苗。有研究者通過使用HEK293T重組細(xì)胞表達(dá)出了免疫原性較E2 蛋白更好的E2-GM-CSF 融合蛋白為豬瘟疫病的防控提供了新型E2 亞單位疫苗[12]。顏仁和等[13]通過細(xì)胞系HEK-293T-E2 制備出豬瘟E2 亞單位疫苗，該疫苗能夠誘導(dǎo)兔和仔豬產(chǎn)生豬瘟病毒抗體，能夠抵抗豬瘟病毒石門株的攻擊，仔豬阻斷率在80%以上。高瑩等[14]以豬瘟病毒E2 基因序列為基礎(chǔ)，構(gòu)建出了重組桿狀病毒rAc-HE2oKm，對(duì)仔豬進(jìn)行免疫后能夠產(chǎn)生高水平的抗體，免疫效果與豬瘟活疫苗相當(dāng)。王遵寶等[15]通過桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞后表達(dá)出E2 蛋白（Bac-E2），使用該亞單位疫苗對(duì)豬進(jìn)行免疫發(fā)現(xiàn)Bac-E2 能夠誘導(dǎo)豬產(chǎn)生較高的豬瘟中和抗體，免疫組在豬瘟病毒的攻擊下保護(hù)率達(dá)到100%。

德國(guó)拜耳公司和荷蘭英特威公司已通過兩種桿狀病毒表達(dá)出E2 蛋白亞單位疫苗，具有安全性，免疫原性好的特點(diǎn)，目前已經(jīng)上市。我國(guó)天康生物股份有限公司在桿狀病毒上重組豬瘟病毒E2 基因，然后在昆蟲細(xì)胞上進(jìn)行表達(dá)的亞單位疫苗（Rb-03 株）[16]。該疫苗在我國(guó)2017 年注冊(cè)完成，2018 年開始生產(chǎn)使用。免疫實(shí)驗(yàn)表明經(jīng)過兩次免疫后，能夠有效避免豬瘟病毒的傷害[17]。2020 年華中農(nóng)業(yè)大學(xué)和一些企業(yè)合作研發(fā)出了豬瘟病毒E2 蛋白重組桿狀病毒亞單位疫苗（WH-09 株），完成官方疫苗注冊(cè)時(shí)間為2020 年，政府批簽發(fā)數(shù)量12 批。該疫苗利用昆蟲細(xì)胞-重組桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)豬瘟E2 蛋白的基因工程亞單位疫苗，具有安全性好、穩(wěn)定性強(qiáng)的特點(diǎn)。

2.2 活載體疫苗

活載體重組疫苗被許多研究者認(rèn)為是潛力較大的一類豬瘟疫苗，主要使用的載體病毒有牛病毒性腹瀉病毒、痘病毒、偽狂犬病病毒和豬腺病毒[18]。

2014 年歐洲藥品管理局批準(zhǔn)上市了牛病毒性腹瀉病毒載體疫苗CP_E2alf 疫苗，CP7-E2alf 疫苗與弱毒活疫苗一樣安全有效，防止了豬瘟病毒的垂直傳播[19]。Voigt 等[20]使用重組口瘡病毒ORFV VrV-E2 對(duì)豬進(jìn)行免疫，結(jié)果表明具有很好的保護(hù)效果。李譜華等[21]將豬瘟病毒抗原較好的E2 基因構(gòu)建到雞痘病毒表達(dá)載體FPVP11 上，然后重組出雞痘病毒FV282-CSFV-E2.對(duì)小鼠和豬分別進(jìn)行了免疫，采用豬瘟病毒強(qiáng)毒株進(jìn)行攻擊，結(jié)果表明疫苗保護(hù)率在75%左右。楊玉艾等[22]利用腺病毒轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒PAdEasy-E0-E2構(gòu)建出重組腺病毒rAd-E0-E2，對(duì)45 周齡的豬進(jìn)行2 次免疫，使用豬瘟毒株進(jìn)行攻毒，研究表明疫苗免疫保護(hù)率達(dá)到86%。梁易曉等[23]研究表明重組豬瘟腺病毒rAd-E0-E2 株活載體疫苗，能在短時(shí)間內(nèi)通過細(xì)胞免疫或黏膜免疫等途徑保護(hù)豬，免疫保護(hù)期至少為7 個(gè)月。韓爽等[24]重組出含有豬瘟E2 基因的重組偽狂犬病病毒PRV-CSFV PE2SC，該重組載體具有穩(wěn)定遺傳的能力，對(duì)豬瘟和豬偽狂犬病能夠同時(shí)預(yù)防。

2.3 核酸疫苗

將豬瘟病毒基因構(gòu)建到真核表達(dá)載體中然后使用該疫苗對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫。郭抗抗等[25]構(gòu)建出了含有豬瘟E2 基因的表達(dá)載體pSCA1-E2 質(zhì)粒，使用核酸疫苗對(duì)小鼠和豬進(jìn)行免疫，表明小鼠淋巴細(xì)胞增高，免疫豬能夠產(chǎn)生豬瘟特異性抗體。有研究者使用DNA疫苗pSFV1SC-E2 對(duì)豬進(jìn)行免疫后能夠有較好的細(xì)胞免疫保護(hù)效果[26]。Andrew[27]將豬瘟病毒E2 基因組裝到質(zhì)粒上對(duì)豬進(jìn)行免疫后能夠產(chǎn)生一定的免疫效果。

2.4 合成肽疫苗

根據(jù)病原體基因組核苷酸序列推導(dǎo)出該病原體基因所要表達(dá)出的寡肽，然后制備成為疫苗對(duì)豬進(jìn)行免疫。Zhou 等[28]合成了豬瘟E2基因所表達(dá)蛋白的B 細(xì)胞線性表位RE2-A 和RE2-B，使用該疫苗兩次免疫后，動(dòng)物機(jī)體能夠產(chǎn)生相應(yīng)抗體。Tian 等[29]構(gòu)建了多個(gè)E2蛋白抗原表位的多肽苗，使用該疫苗能夠很好的保護(hù)豬只。

2.5 基因缺失苗

有研究者將E2 蛋白抗原表位WH303 上的氨基酸進(jìn)行突變，作為候選標(biāo)記疫苗，能夠區(qū)別疫苗免疫與非免疫。也有研究者構(gòu)建了疫苗安全性好E0 缺失突變株，缺少66 個(gè)氨基酸的FL22 株和缺少215 個(gè)氨基酸的FL23 株[30]。

2.6 反式互補(bǔ)缺失突變疫苗

這類疫苗主要是在CSFV 的Erns 或E2 的反式互補(bǔ)缺失突變體，結(jié)構(gòu)基因被外源基因代替。中國(guó)農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所研發(fā)的腺病毒甲病毒復(fù)制嵌合載體疫苗rAdV-SFV-E2 最具潛力，能夠抵抗豬瘟病毒強(qiáng)毒的感染[18]。仔豬免疫后也具有很好的保護(hù)效果，能夠不受母源抗體影響，具有很好的保護(hù)效果，該疫苗和豬偽狂犬疫苗聯(lián)合免疫時(shí)免疫效果能夠不被干擾影響。

3 展望

目前最有效預(yù)防豬瘟的方法為疫苗免疫。弱毒疫苗免疫豬只后無法區(qū)分豬瘟毒株是來自疫苗免疫還是外界感染，免疫失敗也時(shí)有發(fā)生，相比較之下，新型豬瘟疫苗具有安全性、穩(wěn)定性、可識(shí)別性和疫苗生產(chǎn)、儲(chǔ)存和運(yùn)輸成本低等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)伴隨著生物技術(shù)的發(fā)展和研究者們對(duì)豬瘟病毒的不斷了解，新型豬瘟病毒疫苗終將會(huì)在豬瘟凈化上發(fā)揮巨大的作用。■