浙江4個主要茶樹群體種資源表型性狀及遺傳多樣性分析

丁 一，鄭旭霞，黃海濤，毛宇驍，趙 蕓

(杭州市農業(yè)科學研究院，浙江 杭州 310024)

茶樹[Camelliasinensis(L.) O. Kuntze]為山茶科(Theaceae)、山茶屬(CamelliaLinn.)、茶組(Section Thea)多年生木本植物，因其異花授粉、種植歷史悠久等特性，而具有遺傳信息攜帶量大、群體種資源豐富的特點[1-3]。浙江是中國最大的產茶省份之一，有優(yōu)越的茶葉種植環(huán)境和悠久的種茶歷史，其茶樹品種資源含大量種植歷史悠久的有性群體種材料，其中不乏大量優(yōu)質或特異資源，鳩坑、木禾、天臺群體等為代表的一批名茶優(yōu)茶群體種享譽世界[4-5]。

在浙江豐富的群體種資源中，天臺群體，原產于天臺山主峰華頂，天臺制茶香氣濃郁持久、滋味甘醇爽口、湯色嫩綠明亮、芽葉成朵勻齊，飲后口頰留芳、清心健脾[6]；木禾群體，持嫩性強，芽葉生育力較強，制成的珠茶具有花香，為浙江省省級茶樹良種[7]；鳩坑群體，又名鳩坑大葉種，原產于杭州市淳安縣鳩坑鄉(xiāng)塘聯(lián)村，為首批國家級茶樹良種之一[8]；龍山群體，原產于浙江省上虞市覆厄山，芽葉生育力較強，持嫩性中等，具有抗寒性強、結實性強等特點。

基于茶樹自然群體長期的栽培歷史及異化雜交的特性，茶樹群體種不同于無性系品種，具有豐富的遺傳多樣性，是茶樹新品種選育的良好基礎。收集浙江范圍內主要種植的這些茶樹群體種資源，研究其遺傳多樣性是未來培育茶樹新品種，豐富茶類結構和茶產品的基礎。

表型性狀鑒定和描述是種質資源研究與利用的有效方法和途徑，通過明確不同群體材料表型性狀上的特點和多樣性，對于定向開發(fā)專用型茶樹資源是一種很好的手段；但茶樹是異花授粉植物，雜合性高，尤其是其中的群體種材料遺傳背景較為復雜，單一的表型性狀調查不能較為全面地解釋茶樹群體種的多樣性分布，目前各種分子標記已用于茶樹種質資源的鑒定篩選和分類研究，并在育種中輔助選配親本增強遺傳多樣性以提高育種效率[9-12]。

本研究以天臺、木禾、鳩坑及龍山群體為研究對象，對成熟葉、花朵等器官表型性狀進行調查和統(tǒng)計分析，同時利用SSR這一重要分子標記進行遺傳多樣性鑒定，為浙江茶樹群體種資源的保存與挖掘和利用提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

于2019年春季至2021年春季，分別于種植茶園調查4個群體茶樹資源的成葉、花朵性狀，供試材料形態(tài)特征的描述和生物學特性的調查方法參考《茶樹種質資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準》，葉相關性狀重復觀測30次，花相關性狀重復觀測10次[13]。調查共涉及16個項目，具體調查內容包括萼片數(shù)、完全開放花冠大小、花瓣數(shù)、最大花瓣質地、花柱長度、柱頭裂位、雌雄蕊相對高度、葉長、葉寬、葉正面顏色、葉正面隆起性、葉形、葉身形態(tài)、葉基形態(tài)、葉緣形態(tài)及葉片著生狀態(tài)，具體調查方法，參照文獻[13]進行。群體種鮮葉材料各100株，采集新鮮嫩葉用液氮快速冷卻，帶回實驗室放入-85 ℃冰箱備用。樣品采集茶園詳見表1。

表1 樣品采集茶園地理信息

1.2 表型性狀調查與鑒定

表型性狀鑒定方法參照《茶樹種質資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準》[13]。取單株材料，參照每份材料的質量性狀重復觀察10次，數(shù)值性狀重復觀測5次。詳細編碼處理見表2。

表2 形態(tài)性狀的選取及編碼

1.3 DNA提取與質量控制

采用柱式法植物基因組DNA提取試劑盒(TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit)提取茶樹的基因組DNA，用2%瓊脂糖電泳和分光光度計檢測所提樣本的DNA質量和濃度，以保證提取的DNA光吸收值D260/D280=1.80～2.00、樣品濃度>30 μg·μL-1、單個樣品總量>3μg。

1.4 SSR引物選取及擴增條帶特異性分析

隨機在已報到的SSR引物中選擇平均分布于各染色體的標記引物，對部分樣品DNA進行PCR擴增，根據(jù)結果挑選多態(tài)性高、條帶清晰的3對SSR引物作為實驗標記引物，詳見表3。所有引物由上海百賽生物技術有限公司合成。

表3 篩選所得SSR引物[2]

PCR反應體系參照Reaction Mix 5.0 μL(含DNA Polymerase、2×PCR Buffer、MgCl2和dNTP)、模板 DNA 2.0 μL、Primer-F、Primer-R (10 ng·μL-1)各 0.2 μL，加 ddH2O 至 10 μL。PCR循環(huán)參數(shù)參照94 ℃預變性 4 min；94 ℃變性30 s，最適退火溫度退火30 s，72 ℃延伸30 s，共計35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存(根據(jù)各個引物合成信息，退火溫度有所調整)。

擴增產物加入2 μL上樣緩沖液(6×Loading Buffer)混勻，進行2%的瓊脂糖凝膠電泳，采用人工讀帶的方法，將電泳圖上的目的片段范圍內清晰的條帶，按照分子量大小，從大到小依次記錄條帶具體大小，單一條帶為純合基因型，兩條條帶為雜合基因型，建立起原始基因型數(shù)據(jù)矩陣。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2016和sigmaplot 13軟件進行基礎數(shù)據(jù)處理及表型性狀變異分析、關聯(lián)分析及全組分分析；按照供試樣本的基因型數(shù)據(jù)，將其轉換成PowerMarker v3.25 軟件要求的數(shù)據(jù)格式，按Neil[14-15]的方法進行遺傳距離和遺傳相似性分析。

2 結果與分析

2.1 茶樹群體種種質資源表型分析

2.1.1 四個群體茶樹種質資源表型性狀對來自龍山、天臺、鳩坑及木禾4個茶樹群體的共330份材料的16個主要表型性狀分析表明：品種間的差異較大，不同表型性狀在不同品種間呈現(xiàn)出不同程度的多樣性(表4)。其中與茶花相關的表型性狀中，龍山群體萼片數(shù)顯著高于其他群體，均值為5.20±0.52，且花瓣質地上天臺群體顯著薄于其他群體(1.90±0.55)，接近中厚；鳩坑群體的花冠直徑顯著低于其他3個群體，均值在(3.29±0.31)cm，且花柱長度上鳩坑群體明顯小于其他群體，為(1.09±0.14)cm；天臺群體的花瓣數(shù)最多(7.70±1.60)，其次是龍山群體(7.25±1.16)，木禾和鳩坑群體的花瓣數(shù)較少；柱頭裂位天臺>龍山>木禾>鳩坑，依次從中部到上部；雌雄蕊相對高度在4個群體中均無顯著性差異，均表現(xiàn)為雌高雄低。

表4 四個茶樹群體主要表型性狀統(tǒng)計

與葉相關的表型性狀中，葉片著生狀態(tài)在4個群體中均處于上斜至稍上斜狀態(tài)間，斜度上龍山>木禾>天臺>鳩坑群體；天臺群體的葉寬顯著大于其他3個群體，龍山和木禾群體葉長葉寬均小于其他群體；天臺群體葉正面顏色最深，鳩坑群體葉正面顏色最淺，4個群體的葉正面顏色均在深綠到黃綠的范圍內；天臺群體的葉身形態(tài)顯著高于其他群體，趨于稍背卷，其余群體都接近于平；鳩坑群體葉形最偏圓形，天臺最偏橢圓形，其余兩個群體在二者之間；木禾群體的葉基形態(tài)顯著低于其他群體，更接近楔形；龍山和木禾群體的葉緣形態(tài)的波狀程度顯著低于鳩坑和天臺群體。

調查的4個群體中表型性狀參數(shù)變異系數(shù)在4.46%～44.90%，平均為25.28%，其中葉片著生狀態(tài)變異系數(shù)最大，達41.43%，其他變異系數(shù)40.00%以上的性狀還有柱頭裂位(41.31%)。變異系數(shù)在30.00%～40.00%和20.00%～30.00%的分別有5項和1項；10.00%～20.00%的有7項，10.00%以下的只有萼片數(shù)，變異系數(shù)為6.62%，具體見圖1。

圖1 四個茶樹群體表型性狀變異系數(shù)比較Fig.1 Comparison of variation coefficients of agronomic characters among the four tea populations

不同群體的變異系數(shù)表現(xiàn)出明顯的差異；鳩坑群體變異最大的是葉身形態(tài)，天臺群體和木禾群體變異系數(shù)最大的是葉片著生狀態(tài)，龍山群體變異系數(shù)最大的是柱頭裂位；除龍山群體外，其余3個群體變異系數(shù)最小的均為萼片數(shù)，龍山群體則為花冠大小。

龍山群體較之其他群體遺傳多樣性更為豐富的表型性狀為萼片數(shù)、花柱裂位和葉形；鳩坑群體比其他群體更為豐富的性狀為葉正面顏色、葉身形態(tài)和葉緣形態(tài)；天臺群體中則為花瓣數(shù)、花瓣質地和葉基形態(tài)；木禾群體中為花冠直徑、花柱長度、雌雄蕊相對高度、葉片著生狀態(tài)、葉長、葉寬和葉正面隆起性。

2.1.2 四個茶樹群體表型性狀的相關性分析

單獨分析每個群體可以發(fā)現(xiàn)，各表型性狀的相關性有較大的多樣性。對鳩坑群體中各表型性狀的相關性分析顯示(圖2)，花柱長度與雌雄蕊相對高度、花瓣質地及花冠直徑均呈顯著正相關，且花瓣質地及花冠直徑呈顯著正相關；葉寬和葉長呈顯著正相關，葉形與葉身形態(tài)和葉寬負相關，葉片著生狀態(tài)與葉長及葉寬正相關。茶花相關性狀及葉相關性狀之間相關性較小。

藍色—龍山群體；黃色—鳩坑群體；綠色—木禾群體；紅色—天臺群體；橙色—兩個群體；紫色—三個群體。Blue-Longshan； Yellow-Jiukeng； Green-Muhe； Red-Tiantai； Orange-two populations； Purple-three populations.圖2 四個茶樹群體主要表型性狀關聯(lián)分析Fig.2 Analysis of the correlation of the main agronomic characters of the four tea populations

對天臺群體中各表型性狀的相關性分析顯示(圖2)，花柱長度與雌雄蕊相對高度呈顯著正相關，花冠直徑與花瓣質地正相關；葉寬和葉長呈顯著正相關，葉正面隆起性與葉寬及葉形負相關。較之其他群體，比較特別的是天臺群體的花與葉相關表型性狀聯(lián)系更加緊密，而花相關表型性狀之間的聯(lián)系較為薄弱。對龍山群體中各表型性狀的相關性分析顯示(圖2)，花相關表型性狀相關性較之其他群體較低，其中花瓣數(shù)與萼片數(shù)負相關；葉相關表型性狀中葉寬與葉長、葉身形態(tài)與葉正面隆起性正相關，葉基形態(tài)與葉長負相關。對木禾群體中各表型性狀的相關性分析顯示(圖2)，花柱長度與雌雄蕊相對高度正相關。

單獨分析每個群體可以發(fā)現(xiàn)，各表型性狀的相關性有較大的多樣性，尤其是花相關表型性狀和葉相關表型性狀之間的關聯(lián)在4個群體中的分布完全不同。因此，針對具體的表型性狀可以選取不同的品種組合來豐富特異的性狀關聯(lián)。

對4個茶樹群體中各表型性狀的相關性分析顯示(表5、圖3)，花柱長度與雌雄蕊相對高度顯著正相關；葉長與葉寬、葉身形態(tài)及葉片著生狀態(tài)均顯著正相關，而葉寬還與葉正面隆起性、葉身形態(tài)、葉基形態(tài)及葉片著生狀態(tài)顯著正相關，與葉形負相關；葉形與葉寬、葉正面隆起性、葉身形態(tài)及葉基形態(tài)顯著負相關；總的來說，較之單獨分析單個群體可以發(fā)現(xiàn)，葉相關表型性狀及花相關表型性狀的關聯(lián)度均顯著增加，且花葉表型性狀之間的聯(lián)系也更為緊密，其中花柱長度與葉緣形態(tài)顯著正相關，柱頭裂位與葉形顯著負相關，葉長與花瓣數(shù)顯著正相關。

表5 四個茶樹群體主要表型性狀關聯(lián)分析

各特征值關聯(lián)性分析以表示不同參數(shù)之間的相關性，相同方向的變量表示正向關系，相反表示負向關系。Correlation analysis of various eigenvalues indicated the correlation between different parameters. Variables in the same direction showed a positive relationship and the opposite showed a negative relationship.圖3 四個茶樹群體所有表型性狀特征數(shù)據(jù)的主成分分析Fig.3 Principal component analysis of all agronomic characters data of four tea populations

2.2 茶樹種質資源基因型變異分析

篩選了在4個群體中具有差異性的3對SSR引物進行群體擴增，結果表明，3對SSR引物均能在供試材料中檢測到多態(tài)性，其中引物1在天臺群體中檢測到較強的多態(tài)性，而在鳩坑及木禾群體中較為穩(wěn)定；引物4在天臺、龍山及木禾群體中均檢測到較強的多態(tài)性，引物6在鳩坑和天臺群體中檢測到較強的多態(tài)性；總的來說天臺群體展現(xiàn)出的遺傳多樣性明顯高于其他群體(表6)。

表6 四個茶樹群體SSR分子標記多態(tài)性

3 討論

豐富優(yōu)質的遺傳多樣性種質資源是定向育種的基礎，掌握不同親本的差異性有利于提高育種效率，明確育種方向。本研究中茶樹群體種種質資源的主要表型性狀差異較大，遺傳變異性豐富，但不同性狀的遺傳穩(wěn)定性有所差異，龍山群體中相比其他群體遺傳多樣性更為豐富的表型性狀為萼片數(shù)、花柱裂位和葉形；鳩坑群體中比之其他群體遺傳多樣性更為豐富的為葉正面顏色、葉身形態(tài)和葉緣形態(tài)；天臺群體中則為花瓣數(shù)、花瓣質地和葉基形態(tài)；木禾群體中為花冠直徑、花柱長度、雌雄蕊相對高度、葉片著生狀態(tài)、葉長、葉寬和葉正面隆起性。群體種材料因其豐富的遺傳多樣性常被作為選種繁育的親本材料，以上結果在以不同性狀為育種目標的材料選擇上可以有一定的參考價值。

以茶花為研究對象，表型性狀遺傳多樣性較為豐富的群體為天臺群體，以葉為研究對象，鳩坑群體是更為理想的材料，開發(fā)花葉兩用材料可選擇總表型性狀遺傳豐富度最高的木禾群體。結合該結果，分別開發(fā)可用于優(yōu)化葉性狀或花性狀的茶樹新資源時可選擇性地選取不同親本。

對4個群體的茶樹種質資源基因型變異分析結果表明，4個群體都具有分子水平上的遺傳多樣性，且在大多數(shù)引物水平下，天臺群體展現(xiàn)出的遺傳多樣性明顯高于其他群體。由于4個群體分別各采樣于兩個茶園，地理環(huán)境有差異，分別對4個群體共8個地點的數(shù)據(jù)進行全組分分析發(fā)現(xiàn)(圖4)，龍山群體在各特征值下分布較為松散，其他群體都保持有一定的聚合性，說明地理環(huán)境對茶樹群體種的影響在不同品種間有所差異，龍山群體顯著受到地理環(huán)境的影響，其他群體則相對穩(wěn)定。

圖4 不同茶園的4個茶樹群體材料的相關性分析Fig.4 Correlation analysis of the four tea populations in different gardens

綜上所述，茶樹群體種資源在長期的自然選擇和人工栽培條件下，從分子水平到表型性狀都展現(xiàn)出較強的多樣性、穩(wěn)定性和變異性，龍山群體受到地理環(huán)境影響較大，作為育種材料穩(wěn)定性較弱；以茶花為研究對象，表型性狀遺傳多樣性較為豐富的群體為天臺群體，且其分子水平上展現(xiàn)出較為豐富的遺傳多樣性；以葉為研究對象，鳩坑群體是更為理想的材料；花葉兼用則木禾群體是較優(yōu)的材料。利用不同茶樹群體種的表型性狀特異豐富度及遺傳信息多樣性，作為專用研究對象用于浙江茶樹群體種資源的保存與挖掘，有望選育出具有優(yōu)異品質的茶樹新品種。