甜瓜果實(shí)發(fā)育相關(guān)SWEET糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的鑒定與功能初步分析

李蘋芳，姚協(xié)豐，徐錦華，朱凌麗，羊杏平

(1.浙江開放大學(xué) 教學(xué)中心農(nóng)學(xué)教研部， 浙江 杭州 310012； 2.江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所， 江蘇 南京 210014)

碳水化合物是植物光合作用的主要產(chǎn)物，也是植物生命活動(dòng)包括果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育的基礎(chǔ)物質(zhì)，其運(yùn)輸關(guān)系到光合產(chǎn)物在植物不同器官之間的分配與轉(zhuǎn)運(yùn)。在果實(shí)發(fā)育過程中，蔗糖等同化物在源葉中合成，經(jīng)韌皮部運(yùn)輸，以共質(zhì)體或質(zhì)外體途徑轉(zhuǎn)運(yùn)到果實(shí)中。與共質(zhì)體途徑不同的是，在糖的質(zhì)外體裝載及卸載過程中，需要依靠特定糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，通過膜的主動(dòng)運(yùn)輸進(jìn)出細(xì)胞，如單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(monosaccharide transporters， MST)、蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(sucrose transporters， SUT)，以及最新發(fā)現(xiàn)的糖外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(sugars will eventually be exported transporters，SWEET)等[1-3]。已有對(duì)番茄、葡萄、棗、蘋果、黃瓜和西瓜等作物的研究表明，果實(shí)發(fā)育時(shí)期部分或全程采用質(zhì)外體途徑進(jìn)行糖分卸載[4-8]，即糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在果實(shí)內(nèi)糖分卸載與積累中發(fā)揮重要作用，然而目前對(duì)于果實(shí)發(fā)育過程中糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的鑒定及如何參與其中發(fā)揮轉(zhuǎn)運(yùn)作用還知之甚少。

SWEET糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是2010年Chen等[1]運(yùn)用熒光共振能量轉(zhuǎn)移傳器技術(shù)(fluorescence resonance energy transfer， FRET sensor)從擬南芥(Arabidopsisthaliana)中鑒定出的一類新的運(yùn)輸葡萄糖和其他寡糖的蛋白。不同于蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)子這類蛋白，SWEET糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白利用細(xì)胞內(nèi)外糖濃度梯度進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，它不依賴于細(xì)胞膜上的質(zhì)子梯度，其糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性也不依賴于環(huán)境pH值； 且具有雙向轉(zhuǎn)運(yùn)糖類功能，即順濃度梯度從胞內(nèi)向胞外運(yùn)輸糖分或?qū)⑻欠謴陌膺\(yùn)輸?shù)桨麅?nèi)[1]。在結(jié)構(gòu)上，SWEET糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白屬于MtN3/saliva蛋白家族，大多數(shù)預(yù)測(cè)MtN3/saliva蛋白由7個(gè)跨膜螺旋組成，包含2個(gè)MtN3/saliva結(jié)構(gòu)域[1，9]。自Chen等[1]報(bào)道擬南芥AtSWEET11、AtSWEET12 蛋白的蔗糖輸出作用以來， 已從水稻、番茄和葡萄等多種植物中鑒定發(fā)現(xiàn)眾多SWEET蛋白具有糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能[4，10-11]。雖然SWEET發(fā)現(xiàn)并不久，但已發(fā)現(xiàn)其參與了配子體育性、植株發(fā)育、衰老、耐性脅迫、植物-病原菌互作、果實(shí)發(fā)育等多個(gè)植物生理過程[12-20]。

甜瓜是一種重要的夏令水果，目前甜瓜中SWEET的研究鮮有報(bào)道。為探究甜瓜果實(shí)發(fā)育過程中SWEET糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用，本研究從甜瓜基因組中鑒定獲得18個(gè)SWEETs糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，進(jìn)一步篩選在果實(shí)發(fā)育全程或某個(gè)時(shí)期表達(dá)量較高的基因。然后通過構(gòu)建攜帶GFP載體的融合基因，運(yùn)用激光共聚焦觀察，獲得這些基因的定位。并通過酵母表達(dá)研究這些基因在體外是否具有轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖和果糖的功能，以期為揭示SWEET糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在甜瓜果實(shí)發(fā)育過程的調(diào)控作用奠定基礎(chǔ)，從分子水平上探明果實(shí)糖分、風(fēng)味等甜瓜品質(zhì)形成的內(nèi)在機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物材料選用甜瓜Vedrantais品種。甜瓜生長(zhǎng)條件為白天25～28 ℃，晚上18～20 ℃。先在穴盤內(nèi)播種，10 d后移栽到體積為65 L，直徑為55 cm，高度為34 cm的盆內(nèi)，每3株種在一個(gè)盆內(nèi)?；|(zhì)為草炭∶沙∶火山巖=6∶3∶1(體積比)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 甜瓜SWEETs基因家族生物信息學(xué)分析

以擬南芥SWEETs氨基酸序列作為種子序列在甜瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索得到同源序列21條，根據(jù)擬南芥名字進(jìn)行命名。利用軟件TMHMM(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對(duì)甜瓜21條SWEETs序列進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，并在DNASTAR中進(jìn)行氨基酸、分子量、等電點(diǎn)的預(yù)測(cè)。利用Mega6.0對(duì)甜瓜、擬南芥、水稻SWEET氨基酸序列采用鄰接法(NJ， Neighbor-Jointing)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，Bootstrap設(shè)置為1 000次。

1.2.2 RNA提取和RT-PCR

選取甜瓜根、莖、葉、花、不同發(fā)育階段(0、5、10、20、30、40 d)果實(shí)進(jìn)行RNA提取，RNA的提取使用TRIZOL試劑(Invitrogen公司，Carlsbad， CA， USA)。提取后，總RNA溶解在經(jīng)焦碳酸二乙酯處理的水中。采用相同量的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄使用RevertAidTM第一鏈cDNA合成試劑盒(Fermentas， USA)進(jìn)行PCR，所用引物見表1。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量(quantitative real-time PCR，qPCR)

選取授粉0、5、10、20、30、40 d的果實(shí)維管束部位進(jìn)行總RNA提取，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用qPCR對(duì)CmSWEET3，CmSWEET7a和CmSWEET17c進(jìn)行擴(kuò)增，以3個(gè)不同果實(shí)樣品作為3次生物學(xué)重復(fù)。每個(gè)反應(yīng)(總?cè)莘e20 μL)由10 μL iQ SYBR Green Supermix、1 μL稀釋cDNA、0.1 μmol·L-1正向和反向引物組成。PCR循環(huán)條件如下：95 ℃循環(huán)3 min，40個(gè)循環(huán)，95 ℃循環(huán)10 s，58 ℃循環(huán)45 s。甜瓜Actin7(XM_008442791)作為內(nèi)參基因?；虮磉_(dá)的計(jì)算采用2-ΔΔCT[21]。

1.2.4CmSWEET3，CmSWEET7a，CmSWEET17c開放閱讀框的克隆

根據(jù)甜瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)或EST庫(kù)查找CmSWEET3、CmSWEET7a、CmSWEET17c的序列，分別使用引物TOPO-SWEET3-F/R、TOPO-SWEET7a-F/R、TOPO-SWEET17c-F/R進(jìn)行克隆入pENTRTM/D-TOPO載體(Invitrogen)(引物序列見表1)。獲得序列正確的pENTRTM/D-TOPO克隆后用Gateway?LR ClonaseTMⅡ enzyme mix(Invitrogen)克隆入終載體pMDC83和pMDC43，分別獲得GFP在C末端和N末端的蛋白。LR反應(yīng)體系為：150 ng入門克隆(entry clone)，150 ng目的載體(destination vector)，LR酶混合液0.5 μL，總體積2.5 μL。

1.2.5 本氏煙浸潤(rùn)法表達(dá)重組蛋白

用無菌牙簽挑取含目的基因的農(nóng)桿菌克隆和沉默抑制子P19分別置入2 mL的含有抗生素的YEP液體培養(yǎng)基(25 μg·mL-1Rif，50 μg·mL-1Amp，50 μg·mL-1Strep，50 μg·mL-1Km)中，30 ℃，振蕩培養(yǎng)過夜；將過夜培養(yǎng)物加入50 mL 含有抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中(Rif 25 μg·mL-1，Amp 50 μg·mL-1，Strep50 μg·mL-1，Km 50 μg·mL-1)，30 ℃，過夜振蕩培養(yǎng)；20 ℃，4 000 r·min-1，離心15 min，收集菌體；將菌體用轉(zhuǎn)化緩沖液(10 mmol·L-1MES，10 mmol·L-1MgCl2，200 μmol·L-1乙酰丁香酮)混勻，調(diào)整D600，含目的基因的農(nóng)桿菌調(diào)至0.3～0.5，P19調(diào)至0.8～1.0，室溫靜置3 h，然后將兩種菌液按1∶1混合，用1 mL注射器注射入一個(gè)月大小的本氏煙葉片背面。72 h后采用激光共聚焦觀察GFP。

1.2.6 酵母表達(dá)實(shí)驗(yàn)

將CmSWEET3和CmSWEET7aCDS 分別利用引物NEV-SWEET7a-F/R、NEV-SWEET3-F/R(引物序列見表1)克隆到酵母表達(dá)載體NEV-N載體中，再轉(zhuǎn)化入己糖與轉(zhuǎn)化酶缺失突變酵母CSY4000菌株中。挑取包含目的基因的酵母菌落，于CAA培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)至D值為2.0，并按照8倍的濃度依次稀釋，各濃度取2 μL，點(diǎn)于以葡萄糖(glucose)、果糖(fructose)、麥芽糖(maltose)、蔗糖(sucrose)為糖原的CAA培養(yǎng)基上于29 ℃進(jìn)行培養(yǎng)，3 d后拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜瓜SWEETs家族基因的生物信息學(xué)分析

進(jìn)入http：//pfam.xfam.org/網(wǎng)站搜索SWEETs家族基因的hmmer文件，對(duì)甜瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(CucumismeloL. cv. DHL92 v3.6.1)進(jìn)行搜索，本試驗(yàn)共得到21條蛋白序列。經(jīng)過SMART和NCBI-CD 人工篩選刪除了3條過短的蛋白序列，得到18條符合條件的序列。以擬南芥同源序列名字進(jìn)行命名為CmSWEET1～CmSWEET17(表2)，并用ExPASy (http：//web.expasy.org/protparam/) 進(jìn)行蛋白分子量分析，以及用SMART(http：//smart.embl.de/)進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和跨膜區(qū)域預(yù)測(cè)。如表2所示，18條基因所表達(dá)的蛋白序列長(zhǎng)度在151～297個(gè)氨基酸，分子量在19.5～33.3 ku，等電點(diǎn)在6.44～9.66。經(jīng)軟件預(yù)測(cè)，絕大部分甜瓜SWEET家族成員N端包含5～7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，個(gè)別可能由于拼接問題，序列不完整，含有2個(gè)或4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，如CmSWEET17d。

2.2 甜瓜SWEETs家族基因的進(jìn)化樹分析

為研究甜瓜SWEETs家族基因與水稻、黃瓜、番茄之間的進(jìn)化關(guān)系，用ClustalW對(duì)甜瓜、水稻、黃瓜、番茄5個(gè)作物的SWEETs家族基因蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多序列比對(duì)，并使用Neighbor-Joining方法建樹(圖1)。根據(jù)Anjali等[22]最新綜述，將SWEETs分為3個(gè)類型，甜瓜SWEETs序列中屬于類型Ⅰ有2個(gè)，包括CmSWEET1、CmSWEET3；類型Ⅱ有6個(gè)，包括CmSWEET5a、CmSWEET5b、CmSWEET5c、CmSWEET7a、CmSWEET7b、CmSWEET17d；類型Ⅲ有10個(gè)，包括CmSWEET9a、CmSWEET9b、CmSWEET10、CmSWEET12a、CmSWEET12b、CmSWEET12c、CmSWEET15、CmSWEET17a、CmSWEET17b、CmSWEET17c。

表2 甜瓜SWEETs家族基因的生物信息學(xué)分析

圖1 甜瓜SWEETs家族基因氨基酸序列與其他物種的進(jìn)化樹分析Fig.1 Phylogenetic analysis of melon SWEETs family amino acid sequences with other plant species

2.3 甜瓜SWEETs家族基因的染色體定位分析

根據(jù)甜瓜DHL92基因組的注釋信息將甜瓜18個(gè)SWEETs家族基因進(jìn)行染色體定位(圖2)，其中16條成功定位于1～12號(hào)染色體，而CmSWEET17a、CmSWEET17c定位于chr00， 該版本基因組未能將正確拼接的碎片一并歸為chr00。16個(gè)甜瓜SWEETs基因在12條染色體的分布不均勻，1、8、10號(hào)染色體上無SWEETs基因，3、6、7、11號(hào)染色體上分別有1個(gè)SWEETs基因，2、4、9號(hào)染色體有2個(gè)SWEETs基因，5、10號(hào)染色體分布有3個(gè)SWEETs基因。

圖2 甜瓜SWEETs家族基因染色體定位Fig.2 Chromosome mapping of melon SWEETs family genes

2.4 半定量RT-PCR檢測(cè)甜瓜SWEETs家族基因的表達(dá)模式

為明確甜瓜SWEETs基因的表達(dá)模式，分別以根、莖、成熟葉、幼葉、雄花、雌花，以及開花當(dāng)天未授粉子房及不同發(fā)育階段果實(shí)為模板，進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)12條SWEETs基因的表達(dá)(另6條基因引物特異性不佳，未檢測(cè))，以甜瓜Actin7作為內(nèi)參。如圖3-A所示，在不同營(yíng)養(yǎng)器官內(nèi)，CmSWEETs呈現(xiàn)不同表達(dá)模式，如CmSWEET1、CmSWEET2和CmSWEET17c在各器官內(nèi)均有表達(dá)，CmSWEET3和CmSWEET7a則未出現(xiàn)在幼葉中，CmSWEET5a、CmSWEET7c、CmSWEET10、CmSWEET12a、CmSWEET12c則主要在根和花器官中有表達(dá)。為明確甜瓜SWEETs基因與果實(shí)發(fā)育的關(guān)系，以不同發(fā)育階段的果實(shí)作為模板，進(jìn)行RT-PCR。如圖3-B所示，在不同發(fā)育階段的果實(shí)中，CmSWEET3、CmSWEET7a和CmSWEET17c在授粉后5～30 d表達(dá)量都很高。結(jié)果表明CmSWEET3、CmSWEET7a和CmSWEET17c可能與果實(shí)發(fā)育相關(guān)。

圖3 甜瓜SWEETs家族基因在不同營(yíng)養(yǎng)器官(A)與不同果實(shí)發(fā)育階段(B)的表達(dá)Fig.3 Expression pattern of SWEETs family genes in different vegetative organs (A) and fruits in different developmental stages(B) of melon

2.5 CmSWEET3、CmSWEET7a，CmSWEET17c在果實(shí)發(fā)育各個(gè)階段的表達(dá)量分析

為進(jìn)一步明確CmSWEET3、CmSWEET7a和CmSWEET17c與甜瓜果實(shí)發(fā)育的關(guān)系，我們進(jìn)行了qPCR檢測(cè)。如圖4所示，CmSWEET3在果實(shí)發(fā)育中期，即20 d時(shí)表達(dá)最高。CmSWEET7a隨著果實(shí)發(fā)育逐漸上升，表達(dá)量在40 d時(shí)最高。而CmSWEET17c在前期各個(gè)時(shí)期的表達(dá)量差異不大，在成熟時(shí)40 d的表達(dá)量最低。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了普通RT-PCR結(jié)果，CmSWEET3、CmSWEET7a作為候選基因進(jìn)行后續(xù)研究。

每個(gè)果實(shí)作為一個(gè)重復(fù)，數(shù)據(jù)來自3個(gè)獨(dú)立的重復(fù)，圖中的每個(gè)值表示均值±SD。qPCR產(chǎn)生的表達(dá)量與對(duì)照的比值為1.0。Each fruit was set as one replicate， the data were obtained from three separate replicates， each value in the graph showed means ± SD. Expression levels produced by qPCR were expressed as a ratio to the control. which was set at 1.0.圖4 三個(gè)CmSWEETs基因在不同果實(shí)發(fā)育期的qPCR表達(dá)分析Fig.4 qPCR analysis of 3 CmSWEETs genes during different fruit developmental stages in melon plants

2.6 CmSWEET3、CmSWEET7a的亞細(xì)胞定位

為進(jìn)一步明確CmSWEET3、CmSWEET7a是否為膜蛋白，我們采用本氏煙進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)CmSWEET3、CmSWEET7a以此明確其亞細(xì)胞定位。如圖5所示，激光共聚焦定位觀察發(fā)現(xiàn)，CmSWEET3、CmSWEET7a定位于細(xì)胞膜上。因此，通過亞細(xì)胞定位我們初步判斷CmSWEET3、CmSWEET7a為膜蛋白。

圖5 CmSWEET3 和CmSWEET7a 基因在煙草表皮細(xì)胞的亞細(xì)胞定位Fig.5 Subcellular localization of CmSWEET3 and CmSWEET7a genes expressed in Nicotiana tabacum

2.7 CmSWEET3、CmSWEET7a酵母表達(dá)試驗(yàn)

為進(jìn)一步明確甜瓜SWEETs基因轉(zhuǎn)運(yùn)糖的功能，將CmSWEET3、CmSWEET7a正義鏈與反義鏈分別克隆入酵母表達(dá)載體NEV-N，并轉(zhuǎn)入己糖與轉(zhuǎn)化酶缺失突變酵母CSY4000菌株中。在以葡萄糖、果糖(麥芽糖為陽(yáng)性對(duì)照，蔗糖為陰性對(duì)照)分別作為碳源的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化CmSWEET7a正義鏈的酵母可以在以葡萄糖和果糖的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，如圖6所示，表明CmSWEET7a具有轉(zhuǎn)化葡萄糖和果糖這兩類己糖的功能，CmSWEET3轉(zhuǎn)化效果不佳(數(shù)據(jù)未呈現(xiàn))。

圖6 CmSWEET7a在酵母中的表達(dá)Fig.6 The expression of CmSWEET7a in yeast

3 結(jié)論與討論

SWEET糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是近年發(fā)現(xiàn)的一類具有運(yùn)輸葡萄糖和其他寡糖的蛋白。SWEET介導(dǎo)了很多重要的生理或生化過程，最近研究表明，SWEET糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在果實(shí)發(fā)育中起調(diào)控作用。在蘋果中3個(gè)SWEETs在幼果中表達(dá)量較高，而一個(gè)在大果中表達(dá)量較為豐富[23]。Zhen等[24]在蘋果果實(shí)發(fā)育中鑒定得到多個(gè)在果實(shí)發(fā)育期高表達(dá)的SWEETs基因，通過開發(fā)標(biāo)記基因，鑒定其在群體中與果實(shí)可溶性糖含量的關(guān)系，最后發(fā)現(xiàn)MdSWEET15a和MdSWEET9b作為候選基因可能與蘋果中糖積累關(guān)聯(lián)。栽培番茄中SWEET1b、SWEET1c、SWEET2a、SWEET7a、SWEET14在1～3 cm的幼果中具有較高的表達(dá)量，隨著果實(shí)成熟其表達(dá)量逐漸降低，SlSWEET12c在1～3 cm的幼果中表達(dá)量較低，在果實(shí)綠熟期表達(dá)量急劇增加達(dá)到最大值[25]。最近，Ko等[10]通過構(gòu)建SlSWEET15的CRISPR功能突變體揭示番茄中SlSWEET15參與果實(shí)中糖分卸載。Zhang等[26]在葡萄中用轉(zhuǎn)基因手段證實(shí)SWEET10在其果實(shí)成熟時(shí)負(fù)責(zé)糖分積累。這些研究提供了SWEETs調(diào)控參與果實(shí)糖分積累的證據(jù)，然而目前關(guān)于SWEETs基因在甜瓜果實(shí)發(fā)育過程中的研究還未被報(bào)道。

本研究從甜瓜基因組系統(tǒng)鑒定得到18個(gè)SWEETs基因(表2)。根據(jù)甜瓜DHL92基因組的注釋信息，16個(gè)SWEETs基因定位于甜瓜1-12號(hào)染色體上，有兩條被定位于chr00(未能拼接的片段被歸為0號(hào)染色體)(圖2)。2017年Hu等[27]對(duì)黃瓜基因組SWEETs家族基因進(jìn)行了系統(tǒng)鑒定，獲得了17個(gè)黃瓜SWEETs基因，該17條基因的表達(dá)有70%在繁殖器官中。比較甜瓜與黃瓜中鑒定到的SWEETs基因，發(fā)現(xiàn)具有非常高的同源性，本研究中也將18個(gè)SWEETs基因，與水稻、黃瓜、番茄作物的SWEETs家族基因氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，同源性最高的是黃瓜。黃瓜與甜瓜同屬葫蘆科甜瓜屬，甜瓜有12條染色體，但黃瓜只有7條染色體，Huang等[28]對(duì)黃瓜、甜瓜染色體相關(guān)性的研究已揭示葫蘆科作物在進(jìn)化過程中存在著復(fù)雜的進(jìn)化與重排。2021年申長(zhǎng)衛(wèi)等[29]系統(tǒng)鑒定了南瓜中SWEETs基因，共得到21個(gè)南瓜SWEETs基因，其研究也證實(shí)葫蘆科作物中SWEETs存在高度同源性。本研究篩選到3個(gè)SWEETs基因在果實(shí)發(fā)育全程或某個(gè)時(shí)期表達(dá)量較高，預(yù)示其可能在果實(shí)發(fā)育中發(fā)揮重要作用(圖4)。

糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的亞細(xì)胞定位與其代表的功能密切相關(guān)，目前研究結(jié)果表明，其主要定位于液泡膜和質(zhì)膜。通常情況下液泡膜定位的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與胞內(nèi)糖類儲(chǔ)存或者抗逆境脅迫有關(guān)，質(zhì)膜定位的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和細(xì)胞內(nèi)糖類的外排或輸入有關(guān)。如蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 SUT1、SUT2 亞族的成員均定位在細(xì)胞質(zhì)膜上，酵母蔗糖吸收功能互補(bǔ)試驗(yàn)也證明其定位于細(xì)胞質(zhì)膜[30]。對(duì)SWEET 蛋白的研究顯示，其主要定位于韌皮部薄壁組織的細(xì)胞膜上，行使將胞內(nèi)蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)至質(zhì)外體中的功能。如擬南芥中 AtSWEET1、AtSWEET8、AtSWEET11、AtSWEET12 和 AtSWEET15 定位于質(zhì)膜上，負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)糖類的進(jìn)出[1，31]；AtSWEET16 和 AtSWEET17 定位于液泡膜上，介導(dǎo)液泡中糖類的儲(chǔ)存[32-33]。研究發(fā)現(xiàn)，蘋果MdSWEET17定位于液泡膜上，參與細(xì)胞內(nèi)果糖運(yùn)輸[34]。梨 PbSWEET4 定位于質(zhì)膜，且在成熟葉中高表達(dá)，過表達(dá) PbSWEET4 可以顯著降低葉片中的蔗糖與葉綠素的含量，推測(cè)其參與了葉片光合產(chǎn)物輸出，能量物質(zhì)的過度流失導(dǎo)致 PbSWEET4 轉(zhuǎn)基因植株葉片早衰[35]。在黃瓜中，CsSWEET7a被發(fā)現(xiàn)定位于韌皮部伴胞細(xì)胞的細(xì)胞膜上，通過RNAi干擾實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)其與黃瓜果實(shí)中糖分卸載有關(guān)[36]。本研究中為明確甜瓜果實(shí)發(fā)育相關(guān)候選基因CmSWEET3、CmSWEET7a的亞細(xì)胞定位，采用本氏煙對(duì)其進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)，激光共聚焦定位觀察發(fā)現(xiàn)，CmSWEET3、CmSWEET7a定位在細(xì)胞膜上(圖5)，這為后期揭示其功能奠定了基礎(chǔ)。

如前所述，SWEET 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的特點(diǎn)是除了可以作為低親和力的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)節(jié)葡萄糖跨膜吸收外，還能夠運(yùn)輸蔗糖、果糖和半乳糖，因此，知道其底物對(duì)于揭示其功能具有重要意義。擬南芥 SWEET 可分為 4 個(gè)不同的亞類，屬于不同亞類的各種糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白優(yōu)先轉(zhuǎn)運(yùn)不同的糖組分，如屬于分支1的成員AtSWEET1優(yōu)先運(yùn)輸葡萄糖[37]，屬于分支2的AtSWEET5 編碼半乳糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要運(yùn)輸 2-脫氧葡萄糖，屬于分支3 的AtSWEET11 和 AtSWEET12 主要負(fù)責(zé)韌皮薄壁組織細(xì)胞中蔗糖的運(yùn)出[38]；而分支 4(SWEET16～17)成員既可轉(zhuǎn)運(yùn)單糖又可轉(zhuǎn)運(yùn)多糖。最近Anjali等[22]將多個(gè)單子葉植物與雙子葉植物放在一起聚類分析將SWEETs家族基因分為3個(gè)不同的類型(type)，類型Ⅰ包含擬南芥中的分支1，優(yōu)先運(yùn)輸葡萄糖；類型Ⅱ包括擬南芥的分支2和分支4，運(yùn)輸 2-脫氧葡萄糖，既可轉(zhuǎn)運(yùn)單糖又可轉(zhuǎn)運(yùn)多糖；類型Ⅲ即對(duì)應(yīng)擬南芥的分支3，運(yùn)輸二元糖，如蔗糖作為底物。本研究通過基因組系統(tǒng)鑒定從甜瓜中獲得18個(gè)SWEETs基因，通過甜瓜、水稻、黃瓜、番茄4個(gè)作物的SWEETs氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，參考Anjali等[22]的分類，甜瓜SWEETs序列中屬于類型Ⅰ有2個(gè)，類型Ⅱ有6個(gè)，類型Ⅲ有10個(gè)，其中候選基因CmSWEET7a屬于第Ⅱ類，酵母功能缺失實(shí)驗(yàn)也證實(shí)SWEET7a具有轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖或果糖能力。體外酵母功能缺失實(shí)驗(yàn)為更深入揭示CmSWEET7a是否參與了甜瓜果實(shí)發(fā)育過程中糖分從篩管卸載到達(dá)薄壁細(xì)胞這一重要過程奠定了基礎(chǔ)。今后的研究方向?qū)⒃谔鸸现仓陜?nèi)進(jìn)行過表達(dá)或敲除表達(dá)從而進(jìn)行功能驗(yàn)證。