飼糧中添加迷迭香提取物對吉富羅非魚生長性能、血清脂質(zhì)代謝和肝臟抗氧化功能的影響

■孫大淇 徐樹德 鄭 欣 胡海波 胡 毅

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南長沙 410128；2.廣東植之源生物科技有限公司，廣東廣州 510000；3.中國海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室，教育部海水養(yǎng)殖重點實驗室，山東青島 266003；4.湖南植之源農(nóng)牧有限公司，湖南長沙 410007）

迷迭香（Rosmarinus officinalisL.）是一種多年生芳香植物，屬于雙子葉植物綱、唇形科，在曹魏時期被引種至我國，當(dāng)前已在貴州、云南、湖南和廣西等地廣泛種植。諸多研究表明：迷迭香連同其提取物包括鼠尾草酸、迷迭香酸、熊果酸、齊墩果酸等，擁有多種生物學(xué)功能，如抗腫瘤、抗炎癥及抗氧化、抑菌、改進(jìn)血脂代謝水平、保肝護(hù)肝等[1-4]，是具有廣闊市場前景的綠色、安全的替抗產(chǎn)品。

目前，已有不少關(guān)于迷迭香提取物在畜牧生產(chǎn)中應(yīng)用的研究，如提高肉雞的生長性能、改善肉品質(zhì)[5-6]和抗氧化能力[7]、提高蛋雞的產(chǎn)蛋率[8]、提高奶山羊的抗氧化和免疫能力[9]。關(guān)于迷迭香提取物在水產(chǎn)上的研究已有部分報道，如添加迷迭香提取物可以提高虹鱒（Oncorhynchus mykiss）生長，改善血脂代謝水平，增加腸道中消化酶和血清中抗氧化物酶活力，如過氧化氫酶和超氧化物歧化酶[10]、金頭鯛（Sparus aurata）飼糧中添加迷迭香提取物夠降低肝臟脂肪變性率和血清轉(zhuǎn)氨酶的水平[11]、在大西洋鮭魚（Salmo salar）飼糧中添加含迷迭香的功能性飼料能夠調(diào)控免疫相關(guān)基因的表達(dá)，提高其抗氧化狀態(tài)，增強機(jī)體的抗應(yīng)激能力[12]，然而，迷迭香提取物的添加對黑鱸（Dicentrarchus labrax）的生長無顯著性影響[13]。綜上，迷迭香提取物在水產(chǎn)上的研究主要集中在一些名貴品種上，在一些地方特色品種上的報道鮮有。吉富羅非魚（genetic improvement of farmed tilapia, GIFT,Oreochromis niloticus）可歸類于遺傳性狀改良后的尼羅羅非魚，具有諸多優(yōu)點，如高的生長速率和出肉率、穩(wěn)定的遺傳形狀等，是兩廣地區(qū)、海南等溫暖地區(qū)的特色養(yǎng)殖品類[14]。因此，本試驗以吉富羅非魚為研究對象，添加不同水平的迷迭香提取物到吉富羅非魚飼糧中，研究其對吉富羅非魚生長、血清脂質(zhì)代謝和肝臟抗氧化功能的影響，以期為迷迭香提取物在吉富羅非魚的健康養(yǎng)殖中提供應(yīng)用依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

健康的吉富羅非魚由廣東省珠海市的百容魚苗廠提供。試驗用迷迭香提取物由湖南植之源農(nóng)牧有限公司提供，其中齊墩果酸含量為0.5%、熊果酸含量為1.5%。

1.2 試驗設(shè)計

吉富羅非魚540 尾，隨機(jī)地分成6 個處理組（3 重復(fù)/組，30尾魚/重復(fù)），其中處理1組飼喂基礎(chǔ)飼糧，處理2～6 組飼喂添加了迷迭香提取物的日糧。迷迭香提取物在5 個處理組中的添加濃度分別為0.01%、0.05%、0.10%、0.15%和0.20%?；A(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平如表1。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)，%）

1.3 飼養(yǎng)管理

廣東溢多利生物科技股份有限公司為本研究提供了試驗魚的養(yǎng)殖場所。吉富羅非魚從百容魚苗場購買，運回養(yǎng)殖基地后，用基礎(chǔ)飼料暫養(yǎng)馴化2周，之后，按照試驗設(shè)計進(jìn)行分組投喂。養(yǎng)殖試驗持續(xù)60 d，飼養(yǎng)期間，每天定點（09：00和15：00）定量投喂。根據(jù)吉富羅非魚重量的2%～4%確定投喂量，并根據(jù)養(yǎng)殖期間吉富羅非魚的飼料消耗、生長速度以及水溫情況等適當(dāng)調(diào)整。養(yǎng)殖期間，水溫25.2～29.8 ℃，pH 7.2～7.8，亞硝酸鹽濃度＜0.1 mg/L，氨氮濃度＜0.3 mg/L，溶解氧＞6.0 mg/L。試驗期間，每天觀察吉富羅非魚的游動情況和健康狀況，按期排污和換水，并對管理進(jìn)行記錄。

1.4 樣品采集

持續(xù)60 d 的養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，所有試驗魚饑餓24 h后進(jìn)行采樣。首先，對每個處理組的試驗魚進(jìn)行計數(shù)和稱重。隨后，每個處理組隨機(jī)選擇6 尾體重均勻的魚，用麻醉劑說明書上的推薦劑量進(jìn)行麻醉，尾靜脈取血，采集后立即在冷凍離心機(jī)下離心10 min（4 000 r/min），收集的上清液儲存于超低溫冰箱中（-80 ℃），后續(xù)用于測定血清相關(guān)指標(biāo)。最后，解剖取完血的試驗魚，取出肝臟，液氮速凍后保存于超低溫冰箱中（-80 ℃），后續(xù)用于測定肝臟抗氧化相關(guān)指標(biāo)。

1.5 測定指標(biāo)和方法

1.5.1 生長性能相關(guān)指標(biāo)的計算公式增重率（WGR，%）=增重（g/尾）/初重（g/尾）×100特定生長率（SGR，%/d）=（lnWt-lnWo）×100/t

式中：Wt、Wo——分別代表試驗魚末重和初重（g/尾）；

t——試驗天數(shù)（60 d）。

飼料系數(shù)（FC，%）=采食量（g/尾）/增重（g/尾）

肥滿度（CF，g/cm3）=魚體重（g/尾）/[體長（cm）]3×100

臟體比（VSI，%）=魚內(nèi)臟重（g/尾）/魚體重（g/尾）×100

肝體比（HSI，%）=魚肝臟重（g/尾）/魚體重（g/尾）×100

1.5.2 血清相關(guān)指標(biāo)測定方法

南京建成生物工程研究所有限公司提供相關(guān)試劑盒，分別采用COD-PAP法和GPO-PAP法在510 nm波長下檢測總膽固醇（total cholesterol, TC）與三酰甘油（triglyceride, TG）水平，采用賴氏法在505 nm 波長下檢測谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase,AST）與谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase, ALT）水平，采用雙試劑法檢測低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C）與高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C）水平。

1.5.3 肝臟抗氧化指標(biāo)的測定方法

南京建成生物工程研究所有限公司公司提供相關(guān)試劑盒，采用紫外比色法在340 nm 波長下檢測谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase，GR），采用羥胺法在550 nm 波長下檢測超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD），采用比色法在412 nm波長下檢測谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase, GPx）與谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（glutathione-S-transferase，GST），采用鉬酸銨法在405 nm 波長下檢測過氧化氫酶（catalase, CAT），采用硫代巴比妥酸法在532 nm波長下檢測丙二醛（malondialdehyde, MDA）。

1.6 統(tǒng)計與分析

所有試驗結(jié)果采用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（measns ±SD）”表示，SPSS 20.0軟件，用于對結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），并結(jié)合Duncan’s 法對數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較，以P＜0.05作為差異顯著水平。

2 結(jié)果與分析

由表2可知，各處理組間肥滿度的數(shù)值結(jié)果未有顯著性差異（P＞0.05）。吉富羅非魚的末重、特定生長率和增重率的值，隨飼糧中添加的迷迭香提取物的水平的上升而增加，當(dāng)迷迭香提取物的添加水平達(dá)到0.05%時，這些參數(shù)的值與對照組有顯著性差異（P＜0.05），且添加水平達(dá)到0.20%時達(dá)到最大值。吉富羅非魚的飼料系數(shù)、肝體比和臟體比隨著飼糧中迷迭香提取物添加水平的增加而下降，當(dāng)迷迭香提取物添加水平分別達(dá)到0.10%、0.10%和0.15%時，這些參數(shù)的值達(dá)到最小。

表2 迷迭香提取物對吉富羅非魚生長性能的影響

由表3 可知，血清中，各組間高密度脂蛋白膽固醇的值無顯著性改變（P＞0.05），而三酰甘油、總膽固醇、谷草轉(zhuǎn)氨酶、低密度脂蛋白膽固醇、谷丙轉(zhuǎn)氨酶的值，隨飼糧中迷迭香提取物添加水平的增加呈下降趨勢，當(dāng)添加水平為0.01%時，均達(dá)到與對照組差異顯著（P＜0.05）；當(dāng)添加量水平分別為0.20%、0.10%、0.20%、0.15%、0.20%，這些參數(shù)的值達(dá)到最小。

表3 迷迭香提取物對吉富羅非魚血清生化指標(biāo)的影響

由表4可知，各組間谷胱甘肽還原酶的值無顯著性變化（P＞0.05）。肝臟中，丙二醛含量，隨著飼糧中迷迭香提取物添加水平的上升而減少，當(dāng)添加水平達(dá)到0.15%時，達(dá)到最?。≒＜0.05），隨后趨于穩(wěn)定。肝臟中，其他抗氧化指標(biāo)，如過氧化氫酶、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶，這些參數(shù)的值，隨著飼糧中迷迭香提取物添加水平的上升而增高，當(dāng)迷迭香提取物添加水平為0.01%時，均與對照組差異顯著（P＞0.05），隨后趨于穩(wěn)定；當(dāng)添加量分別達(dá)到0.20%、0.20%、0.05%、0.20%達(dá)到最大值。

表4 迷迭香提取物對吉富羅非魚肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

3 討論

3.1 迷迭香提取物對吉富羅非魚生長性能的影響

植物提取物中的主要活性成分有：揮發(fā)油、黃酮、多糖、多酚、皂苷、生物堿、三萜類化合物、有機(jī)酸等，這些成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)常包含酚、醚、酮、萜等功能性基團(tuán)[15]。迷迭香是一種芳香植物，而熊果酸和齊墩果酸是采用醇提技術(shù)，從迷迭香中提取的五環(huán)三萜類化合物，兩者屬于同分異構(gòu)體，具有相似的生理功能[16]?？鼓[瘤、抗炎及抗氧化、抑菌、改進(jìn)血脂代謝水平、保肝護(hù)肝等這些有益作用均可在迷迭香及其提取物中發(fā)現(xiàn)[1-4]。Yagoubi等[17]在羔羊上的試驗顯示，迷迭香蒸餾渣的添加可以提高羔羊的平均日增重和功能性器官（皮膚、肝臟、腎臟和睪丸）的重量。在肉雞上的研究顯示，迷迭香精油的添加可以上調(diào)肉仔雞的日增重、下調(diào)料重比[5]。但在金頭鯛[11]和黑鱸[13]上的研究顯示，飼糧中迷迭香提取物的添加對其生長性能、體組成等無顯著影響。本試驗結(jié)果顯示，迷迭香提取物的添加，上調(diào)了吉富羅非魚的特定生長率、增重率，下調(diào)了飼料效率、臟體比和肝體比，表明飼糧中迷迭香提取物的添加能夠提高吉富羅非魚的生長性能、改善形體指標(biāo)。本試驗的結(jié)果與如上部分研究的結(jié)果不一致，可能是因為植物提取工藝的差異會導(dǎo)致活性產(chǎn)物的成分和濃度不一致；不同動物品種、不同的飼糧配方組成、不同的飼養(yǎng)環(huán)境均會對試驗結(jié)果有一定影響。

3.2 迷迭香提取物對吉富羅非魚脂質(zhì)代謝的影響

付志歡等[18]的研究報道：血清中三酰甘油、總膽固醇、低/高密度脂蛋白膽固醇水平的變化反映了機(jī)體脂質(zhì)的水平。血清中較低的三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇濃度反映出肝臟中脂肪的分解代謝較高[19]。本試驗結(jié)果顯示，飼糧中添加迷迭香提取物能夠降低吉富羅非魚血清三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇和總膽固醇的含量。表明迷迭香提取物的添加能夠促進(jìn)吉富羅非魚體內(nèi)脂質(zhì)的分解代謝。這與Hernandez 等[11]在金頭鯛上的結(jié)果一致，飼糧中迷迭香提取物的添加能夠降低血清中三酰甘油和總膽固醇的含量。谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶屬于轉(zhuǎn)氨酶類，在動物機(jī)體代謝氨基酸的過程中發(fā)揮緊要作用[20]。正常情況下，谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶，兩者主要存在于肝臟中，當(dāng)檢測到血液中有較高的濃度時，表明肝細(xì)胞已經(jīng)受損[21]。研究報道，齊墩果酸和熊果酸是迷迭香提取物中活性成分，兩者均具有保肝護(hù)肝的功效，其中，齊墩果酸在四氯化碳引起的肝細(xì)胞壞死、脂肪疏松及變性、線粒體腫脹、間質(zhì)炎癥反應(yīng)及肝糖原減少等過程中有明顯的緩解作用[22-23]，熊果酸在乙醇誘導(dǎo)離體的大鼠肝細(xì)胞受損、釋放轉(zhuǎn)氨酶等過程中具有明顯的保護(hù)作用[24]。本研究中得到的數(shù)據(jù)顯示：與對照組比，迷迭香提取物的添加可以下調(diào)吉富羅非魚血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶的含量。表明迷迭香提取物的添加能夠提高吉富羅非魚的脂質(zhì)代謝水平，進(jìn)而起到保肝護(hù)肝的效果，最終達(dá)到促進(jìn)健康生長的作用。這些有益作用的實現(xiàn)可能與熊果酸和齊墩果酸抗脂質(zhì)氧化和清除氧自由基的作用有關(guān)，具體的作用機(jī)制需深入研究。

3.3 迷迭香提取物對吉富羅非魚肝臟抗氧化功能的影響

機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)類物質(zhì)易發(fā)生氧化，繼而受損，產(chǎn)生丙二醛，其含量的升降可用來衡量受損程度[25]。動物為了抵抗氧化損傷，其機(jī)體自身有一套抗氧化系統(tǒng)，主要是一些抗氧化酶和非酶性物質(zhì)，前者主要包含超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽還原酶、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶、谷胱甘肽過氧化物酶等[26]。在大鼠上的研究發(fā)現(xiàn)：灌服熊果酸可以改善慢性乙醇性肝臟組織病理學(xué)損傷、提高谷胱甘肽、VC和VE的水平，降低血清過氧化脂質(zhì)水平[27]。在小鼠上的研究發(fā)現(xiàn)：灌服齊墩果酸可降低乙醇引起的肝組織中丙二醛的含量和提高過氧化氫酶活性[28]。任駿等[29]的研究報道：熊果酸和齊墩果酸，可以緩解四氯化碳、阿霉素等外源刺激引起的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。沈根明等[30]的研究報道，迷迭香提取物的添加，可以降低蛋雞血清中丙二醛含量、增加超氧化物歧化酶活力。同樣，在水產(chǎn)動物上的研究發(fā)現(xiàn)：添加迷迭香提取物至飼料中，可以上調(diào)鯉魚血清抗氧化酶活力（如過氧化氫酶和超氧化物歧化）[31]、提高虹鱒血清中抗氧化酶活力（如超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶，不包括過氧化氫酶）[32]。本試驗結(jié)果顯示：添加迷迭香提取物至吉富羅非魚飼料中，可以增加血清中抗氧化酶活力（包括谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶），下調(diào)丙二醛的含量。如上結(jié)果說明，迷迭香提取物的添加可以提升吉富羅非魚的抗氧化能力。其原因可能是：①齊墩果酸和熊果酸的分子結(jié)構(gòu)含有羥基且支鏈包含碳碳雙鏈，具有明顯的還原性，可以有效分解動物機(jī)體因氧化應(yīng)激產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物，并提高抗氧化酶活力[33]；②熊果酸和齊墩果酸可以直接清除超氧陰離子，并抑制黃嘌呤氧化酶的活力[34]，清除DPPH自由基[35]，降低自由基對機(jī)體的損傷；③熊果酸可以通過激活細(xì)胞中的核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB），進(jìn)而增強細(xì)胞的屏障功能和抵御應(yīng)激的能力[36]。

4 結(jié)論

迷迭香提取物添加至吉富羅非魚飼糧中，可以增加其體增重，降低飼料系數(shù)、肝體比和臟體比。同時，迷迭提取物能夠改善吉富羅非魚脂質(zhì)代謝狀況，增強肝臟抗氧化能力，最終促進(jìn)吉富羅非魚的健康生長。綜合性價比建議，吉富羅非魚飼料中適宜的迷迭香提取物添加水平為0.05%。