不同發(fā)酵添加劑對青貯柞樹葉品質的影響

■潘敏慧 黃小乘 田怡豪 孫占微 李成云，2，3*

（1.延邊大學農(nóng)學院，吉林延吉 133002；2.延邊大學肉牛科學與產(chǎn)業(yè)技術協(xié)同創(chuàng)新中心，吉林延吉 133002；3.東北寒區(qū)肉?？萍紕?chuàng)新教育部工程研究中心，吉林延吉 133002）

柞樹（Xylosma racemosum），是殼斗科櫟屬植物的通稱，通常指的是蒙古櫟（Quercus mongolica Fisch.ex Ledeb）。蒙古櫟是我國落葉林的主要樹種組成之一，又稱蒙古柞，具有耐寒、耐干旱、抗逆性強等特點，在我國主要集中分布在東北部以及內(nèi)蒙古的東部地區(qū)[1-2]。柞樹具有節(jié)省土地、自然生長、分布廣泛、成本低的優(yōu)點。柞樹經(jīng)過1～4 年生長后，其葉子質量較好。同時，我國的柞樹葉資源豐富，價格低廉且產(chǎn)量大。柞樹葉中富含礦物質元素，以及多種以酮類、酯類化合物為主的揮發(fā)性化學成分，還含有多種不飽和脂肪酸，具有較高的營養(yǎng)價值和較強的抗氧化活性[3-4]。已有研究表明，青貯柞樹葉的粗蛋白、粗脂肪含量都高于青貯玉米稈的含量，而粗纖維的含量卻比青貯玉米低。但將柞樹葉直接作為飼料飼喂不但適口性差，還會因其抗營養(yǎng)因子的含量過高，從而阻礙或者抑制畜禽對營養(yǎng)物質消化吸收。單寧是柞樹葉中最主要、含量最高的抗營養(yǎng)因子。若控制畜禽對縮合單寧的攝入量，可以有效提高動物的生產(chǎn)性能[5]和飼料利用率[6]。有研究結果表明，在青貯原料中添加植物乳酸菌和蔗糖，可以顯著降低單寧含量[7-8]。用石灰水浸泡法對柞樹葉進行脫毒處理，脫毒效果佳，且對柞樹葉的營養(yǎng)價值無不良影響[9]。青貯是牧草經(jīng)典的保存方法，但直接單獨青貯所得到的青貯飼料發(fā)酵品質不佳，可能會出現(xiàn)pH降低緩慢、乳酸菌含量低及可溶性碳水化合物（water soluable carbohydrate，WSC）含量不足等問題，而在青貯時添加不同發(fā)酵添加劑可以有效改善其發(fā)酵品質[10]。因此，本試驗以柞樹葉作為原料，探討添加不同發(fā)酵添加劑[糖蜜、乳酸菌、EM菌（一種混合菌一般包括光合菌、酵母菌、乳酸菌等有益菌類，Effective Microorganisms，EM）、1%石灰水、乳酸菌加糖蜜及EM 菌加糖蜜]對青貯柞樹葉發(fā)酵品質和微生物的影響，以期篩選出最佳的發(fā)酵添加劑，為青貯柞樹葉在反芻動物中的合理利用提供科學依據(jù)，并為柞樹葉作為新型飼料資源在畜牧業(yè)中的應用推廣打下基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

柞樹葉于2021年9月中旬，在延邊朝鮮族自治州草原管理站采集，化學成分見表1。糖蜜由某化學試劑有限公司提供，乳酸菌和EM 菌為延邊大學農(nóng)學院動物營養(yǎng)實驗室研制，1%石灰水由無水氫氧化鈣自行配制。

表1 柞樹葉的化學成分（% DM）

1.2 試驗設計

采用單因子試驗設計，未添加發(fā)酵添加劑組為對照組，其余6 組為試驗組，每個處理設3 個重復，每千克柞樹葉中加入20 g 或1 mL 的添加劑，具體試驗設計見表2。

表2 試驗設計

1.3 青貯飼料調(diào)制

將柞樹葉切至長寬均為1～2 cm 的小塊，平均分成7組，將發(fā)酵添加劑按照比例分別均勻噴灑到各組柞樹葉上，而對照組噴灑等量純化水，均勻混合后分裝至30 cm×50 cm規(guī)格的聚乙烯真空密封袋中，密封后抽出其中氣體，按組貼好標簽，放置在陰涼避光處，室溫（20.7±2.4）℃青貯60 d。

1.4 測定指標及方法

青貯結束統(tǒng)一開袋取樣，每組每個重復分別稱取樣品150 g，密封后包裝帶回，放在-20 ℃下儲存，用于青貯品質及相關指標的測定。

1.4.1 感官評定、營養(yǎng)價值和發(fā)酵品質指標

每袋重復稱取樣品50 g，按照德國農(nóng)業(yè)協(xié)會（DLG）的評分標準[11]，見表3，對青貯柞樹葉的氣味、色澤和枝葉結構進行打分。

表3 青貯飼料感官評定標準

重復取1 g青貯柞樹葉，制成風干樣，采用烘干法測定干物質（DM）含量，用全自動凱氏定氮儀（北京海鑫瑞科技有限公司）測定粗蛋白（CP）含量，采用索氏脂肪提取法測定粗脂肪（EE）含量，灰化法測定粗灰分（ASH）含量，Ca含量和P含量分別采用乙二胺四乙酸二鈉絡合滴定法以及鉬黃分光光度法測定[12]。按照Van Soest[13]的方法進行中性洗滌纖維含量（NDF）和酸性洗滌纖維含量（ADF）的測定。

稱取20 g青貯柞樹葉，加入180 mL純化水，常溫浸提24 h，用紗布過濾一遍后，用定性濾紙再次過濾，獲得青貯浸提液，用于可溶性碳水化合物（WSC）和縮合單寧（CT）以及后續(xù)發(fā)酵品質的測定?？扇苄蕴妓衔锊捎幂焱?硫酸比色法測定，縮合單寧采用香蘭素鹽酸法測定。

即時用賽多利斯PB-10酸度計（濟南愛來寶儀器設備有限公司）測定pH。氨態(tài)氮（NH3-N）含量采用苯酚-次氯酸鈉比色法進行測定[14]，用安捷倫GC-7890A 型色譜儀（杭州瑞析科技有限公司）測定有機酸中乳酸、乙酸、丙酸和丁酸含量[15]，用Flieg 評分法對青貯柞樹葉發(fā)酵品質進行整體評分[16]。

1.4.2 微生物測定

取出5 g 青貯樣品，加入45 mL 純化水稀釋，做10～109的濃度梯度。參照司丙文等[17]的方法，用稀釋平板涂布法測定菌落數(shù)量，好氧細菌、酵母菌與霉菌在37 ℃的有氧條件下進行培養(yǎng)，前者采用NA 培養(yǎng)基、后兩者采用PDA 培養(yǎng)基。乳酸菌在厭氧條件下，用MRS 瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h 后，用平板菌落計數(shù)法進行微生物含量的測定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用EXCEL 2010記錄試驗數(shù)據(jù)，使用SPSS 26.0進行單因素方差分析，并采用LSD法對均值進行多重比較，P＜0.05表示差異顯著。數(shù)據(jù)結果用“平均數(shù)±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 不同發(fā)酵添加劑對青貯柞樹葉感官評定和Flieg評分的影響

由表4可知，在氣味得分上各試驗組均顯著高于CK 組（P＜0.05），且LW 組在各試驗組中最低，試驗組中僅LAB組和LAB-M組的質地及得分與對照組有顯著差異（P＜0.05），且LAB 組與其他組別也存在顯著差異（P＜0.05）。與對照組相比，各試驗組的總分均顯著高于對照組（P＜0.05），且等級均為優(yōu)良，說明了試驗組的青貯效果均優(yōu)于對照組。感官評定總分從高到低的排序為：EM-M 組＞LAB-M 組=EM 組＞LAB 組＞M組＞LW組＞CK組。

表4 不同發(fā)酵添加劑對青貯柞樹葉感官評定的影響

由表5可知，與對照組相比，各試驗組中除LW組外的乳酸評分均顯著高于對照組（P＜0.05），且EM-M組最高，并與其他組差異顯著（P＜0.05）。在乙酸評分中，除LW 組外其余試驗組均顯著高于對照組（P＜0.05），EM-M 組顯著高于除LAB-M 組外的其余各組（P＜0.05）。各組均未檢測出丁酸，丁酸評分全為滿分。與對照組相比，各試驗組中除LW組外的總分均顯著高于對照組（P＜0.05），且EM-M 組最高，并與其他組差異顯著（P＜0.05）。Flieg評分總分從高到低的排序為：EM-M 組＞LAB-M 組＞M 組＞EM 組＞LAB 組＞LW組＞CK 組。除LW 組和CK 組等級為尚可外其余各組為優(yōu)。

表5 不同發(fā)酵添加劑對青貯柞樹葉Flieg評分的影響

2.2 不同發(fā)酵添加劑對青貯柞樹葉品質的影響

由表6可知，各組均未檢測出丁酸。各試驗組與CK組的pH差異顯著（P＜0.05），其中EM-M組的pH顯著低于其他組（P＜0.05）。EM-M 組的乳酸量最高，顯著高于其他組（P＜0.05）。各試驗組之間丙酸含量差異不顯著（P＞0.05）。EM-M組的乳酸/乙酸值最高，且顯著高于其他組（P＜0.05）。除M組和LW組以外的其余試驗組的NH3-N/TN值都顯著低于CK組（P＜0.05）。

表6 不同發(fā)酵添加劑對青貯柞樹葉pH、VFA和NH3-N/TN的影響

2.3 不同發(fā)酵添加劑對青貯柞樹葉營養(yǎng)成分的影響

由表7 可知，與CK 組相比，M 組DM 含量較其他各組顯著降低（P＜0.05）；除LAB-M 組和LW 組外，其余各組間EE 含量無顯著差異（P＞0.05）；各組之間的Ash、NDF 和ADF 含量差異不顯著（P＞0.05）；CK 組的可溶性碳水化合物僅和M 組的存在顯著差異（P＜0.05）；不同青貯添加劑顯著降低了柞樹葉青貯飼料的CT含量（P＜0.05）。

表7 不同發(fā)酵添加劑對青貯柞樹葉各成分的影響（%）

2.4 不同發(fā)酵添加劑對青貯柞樹葉微生物數(shù)量的影響

由表8可知，不同青貯添加劑顯著提高了柞樹葉青貯飼料的乳酸菌數(shù)量（P＜0.05），CK 組乳酸菌數(shù)量最低，除LAB 組和LAB-M 組外其余各組間乳酸菌數(shù)量差異顯著（P＜0.05）。除LAB 組和LW 組外其余試驗組的酵母菌數(shù)量均顯著低于CK 組（P＜0.05），其中EM-M組的酵母菌數(shù)量最低。與CK組相比，除LW組外的其余試驗組都顯著降低了霉菌數(shù)量（P＜0.05）。CK組和LW組好氧細菌數(shù)量最高。

表8 不同發(fā)酵添加劑對青貯柞樹葉微生物數(shù)量的影響(lg CFU/g)

3 討論

3.1 不同發(fā)酵添加劑對青貯柞樹葉品質的影響

感官評定是青貯品質鑒定中最直接的方法，本試驗中發(fā)酵添加劑試驗組的青貯感官評定等級均優(yōu)于CK 組，這與邵新慶等[18]的試驗結果一致。青貯品質的好壞也可以通過pH、有機酸含量和NH3-N/TN這些重要指標來衡量。一般認為優(yōu)質青貯飼料的pH應小于4.2，會抑制大部分微生物的生長[19-20]。本試驗中各組青貯柞樹葉的pH都低于4.1，達到了優(yōu)質級別。同時LW組的青貯發(fā)酵pH最高，這與王馨等[21]的結論相反，這是因為石灰水呈強堿性，但其是否對青貯pH造成影響可能與其添加量有關。乳酸菌能夠直接利用的發(fā)酵底物是WSC，乳酸和乙酸的含量與WSC有關，WSC 含量越多產(chǎn)生的乳酸越多、乙酸越低，青貯發(fā)酵品質越好[22]。適量的乙酸在青貯發(fā)酵初期可以起到抑制有害微生物繁殖的作用，過量的乙酸則會降低飼料適口性，影響采食量[23]。本試驗中LAB-M組、LW組和EM-M組的乙酸含量均顯著低于CK組。丙酸酸性弱但具有強大的抗真菌活性，可以有效抑制霉菌生長[24]。各試驗組的丙酸含量較對照組有所升高，這與牟林林[25]的試驗結果一致。

本試驗中，各組青貯柞樹葉均未檢測出丁酸，這與王隆等[26]的研究結果一致。NH3-N/TN 也可以反映青貯效果，代表了青貯飼料中蛋白質分解量，比值越大，青貯質量越低[27]。說明在青貯柞樹葉中添加除LW 外的發(fā)酵添加劑可以提高青貯品質。由Flieg 評分的計算公式可知，F(xiàn)lieg 評分的結果與DM 和pH 有關，該試驗中除M組外其余各組的DM含量無顯著差異，因此Flieg評分的變化規(guī)律與pH相差不大。

3.2 不同發(fā)酵添加劑對青貯柞樹葉營養(yǎng)成分的影響

CP 含量是反映物質營養(yǎng)價值的重要指標，其值越高，則表明可被利用的營養(yǎng)成分越高，而NDF 與ADF 含量所反映的則剛好相反。ADF 和NDF 是評價纖維質量最有效的指標，它們含量越高則表明家畜消化率越低[28]。在本試驗中，發(fā)現(xiàn)糖蜜添加組（M 組、LAB-M 組、EM-M 組）顯著提高了青貯柞樹葉的CP、WSC以及乳酸的含量，原因可能是：首先，糖蜜的添加直接提高了WSC 含量，進一步提高了柞樹葉青貯中的WSC含量；其次，因WSC的提高使乳酸菌的數(shù)量在青貯早期有了很大的增加，縮短了青貯發(fā)酵進入穩(wěn)定期的時間，使其他雜菌對發(fā)酵底物和蛋白質的消耗量減少[29]。這與毛一帆等[30]和吳金彩等[31]的研究結論一致。LW 組CT 含量有效降低，與呂竑建等[7]的試驗結果一致。

3.3 不同發(fā)酵添加劑對青貯柞樹葉中微生物數(shù)量的影響

青貯的品質與其微生物數(shù)量息息相關，特別是乳酸菌具有決定性的作用。青貯早期的乳酸菌快速增殖是青貯成功的基礎，該過程產(chǎn)生大量乳酸，使pH迅速降低，抑制有害菌的繁殖，形成了有利于發(fā)酵的環(huán)境[32]。乳酸菌不但是降低青貯料pH 的主要菌種，還是保存青貯材料的主要菌種[33]。霉菌是致使青貯飼料腐敗變質的主要因素，接觸空氣以及含水量特別高的飼料部分容易發(fā)生霉變，產(chǎn)生有毒有害物質，導致飼料酸敗，影響動物的采食量[34]。霉菌對青貯的品質有不好的影響，目前可以通過降低pH和確保青貯處于非有氧環(huán)境來有效抑制霉菌生長[35]。酵母菌和好氧細菌在有氧的條件下，會快速地生長繁殖，將青貯飼料二次發(fā)酵，使其營養(yǎng)價值降低甚至腐敗變質[36]，酵母也被認為是青貯在開始時就變質的最重要的微生物因素。

4 結論

通過乳酸菌、蜜糖、EM 菌和1%的石灰水這4 種青貯添加劑的使用，前三者在一定程度上改善了青貯柞樹葉的品質。綜合各項指標進行評價，各組青貯柞樹葉的綜合營養(yǎng)價值從高到低依次為：EM-M 組＞LAB-M 組＞M 組＞EM 組＞LAB 組＞LW 組＞CK 組，即EM-M組提升青貯品質的效果最優(yōu)。