基于高效液相指紋圖譜及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測分析山銀花質(zhì)量標(biāo)志物

周新茹，王志輝,2，龍雨青，曾 梅，楊 敏，童巧珍,2 ,3，周日寶,2,3*，劉湘丹,2,3*

1湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院；2 湘產(chǎn)大宗道地藥材種質(zhì)資源及規(guī)范化種植重點研究室；3湖南省普通高等學(xué)校中藥現(xiàn)代化研究重點實驗室，長沙 410208

山銀花甘，寒，歸肺、心、胃經(jīng)，具清熱解毒，疏散風(fēng)熱功效，用于癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風(fēng)熱感冒、溫病發(fā)熱等癥[1]，目前《中國藥典》有山銀花的中成藥處方達80多個，如感冒止咳片、口炎清片、感冒止咳膠囊、清肝利膽顆粒、銀屑靈顆粒等。山銀花不僅為大宗常用中藥材、成方制劑原材料，也是化工香料提取原料，同時還作為茶葉和護膚保健品開發(fā)，市場應(yīng)用前景廣闊。

現(xiàn)代研究表明，山銀花化學(xué)成分數(shù)量多且復(fù)雜，包括有機酸類、三萜皂苷類、黃酮類、揮發(fā)油類及微量元素等[2]。目前《中國藥典》僅將綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙及川續(xù)斷皂苷乙作為山銀花質(zhì)量評價指標(biāo)，只對有機酸類與皂苷類共3種化學(xué)成分做了限量規(guī)定。大量研究表明木犀草苷等黃酮類成分也是山銀花發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，中藥化學(xué)成分復(fù)雜，發(fā)揮藥效并不僅依靠某一化學(xué)成分，而是多個組分內(nèi)部之間存在普遍的加合作用，因此僅以少數(shù)成分對藥材進行品質(zhì)評價不夠全面。

為提升規(guī)范中藥材及產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，劉昌孝院士[3-7]在研究分析現(xiàn)有質(zhì)量評價控制方法問題的基礎(chǔ)上，于2016年提出了中藥質(zhì)量標(biāo)志物(Q-Marker)的概念。中藥質(zhì)量標(biāo)志物有傳遞與溯源、特有性、有效性、可測性及復(fù)方配伍五原則[8-10]，可作為較全面的中藥材及產(chǎn)品質(zhì)量評價控制指標(biāo)。Q-Marker這一概念提出后，被廣泛應(yīng)用于解析中藥材、飲片、制劑與有效性密切相關(guān)的中藥內(nèi)在化學(xué)質(zhì)量屬性，為中藥材及其產(chǎn)品的全過程質(zhì)量控制及質(zhì)量溯源提供了新的思路。

隆回、溆浦為湖南灰氈毛忍冬來源山銀花主產(chǎn)區(qū)，根據(jù)其花冠后期是否展開分五彩花(花冠展開)和湘蕾(花冠不展開)兩大類，目前產(chǎn)地初加工方式主要有蒸汽殺青與低溫干燥兩種，從而市場形成了四種湘產(chǎn)山銀花藥材規(guī)格：蒸汽殺青湘蕾、低溫干燥湘蕾、蒸汽殺青五彩花、低溫干燥五彩花。為評價不同規(guī)格湘產(chǎn)山銀花質(zhì)量，建立比較全面的質(zhì)量評價指標(biāo)，本文基于中藥質(zhì)量標(biāo)志物的概念，結(jié)合HPLC指紋圖譜、多元統(tǒng)計分析和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等研究方法預(yù)測并驗證山銀花Q-Marker，以期為山銀花質(zhì)量評價和質(zhì)量控制提供思路和參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀(包括G1312C二元泵、G1316A柱溫箱、G7129A自動進樣器、VVID檢測器，美國Agilent公司)；色譜柱：Agilent ZORABAX SB-C18(250 mm×4.6 mm)；SK8200型超聲儀(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；Eco-S15型實驗室純水系統(tǒng)(上海和泰儀器有限公司)。

1.2 試藥

新綠原酸(20 mg/支，批號：19081403)；綠原酸(20 mg/支，批號：18071907)；咖啡酸(20 mg/支，批號：20110501)；獐芽菜苷(20 mg/支，批號：19090902)；3，4-二-O-咖啡?？鼘幩?異綠原酸B，20 mg/支，批號：21022308)；3，5-二-O-咖啡酰奎寧酸(異綠原酸A，20 mg/支，批號：21032304)；灰氈毛忍冬皂苷乙(20 mg/支，批號：20072203)；川續(xù)斷皂苷(20 mg/支，批號：19120601)對照品均購自成都普菲德生物科技有限公司，質(zhì)量分數(shù)均≥98%；甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純；水為超純水；其余試劑均為分析純。29批山銀花樣品采自湖南隆回和溆浦，具體信息見表1，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)周日寶教授與劉湘丹副教授鑒定為忍冬科植物灰氈毛忍冬L.macranthoidesHand.-Mazz.的干燥花蕾及帶初開的花。

表1 山銀花樣品來源信息表Table 1 Information of the source of Lonicerae Flos samples

續(xù)表1(Continued Tab.1)

1.3 數(shù)據(jù)庫與軟件

中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件(2012 年版)；Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)；Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)；STRING(https：//string-db.org/)數(shù)據(jù)庫；Cytoscape 3.8.2軟件；Metascape(www.metascape.org/)數(shù)據(jù)庫；PDB數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)；ZINC數(shù)據(jù)庫(http://zinc.docking.org)；Schr?dinger軟件。

2 方法與結(jié)果

2.1 山銀花指紋圖譜研究

2.1.1 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠(非親水性)為填充劑(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以乙腈為流動相A，以0.4%磷酸水溶液為流動相B，按下表2進行梯度洗脫；柱溫30 ℃；檢測波長：210 nm。

表2 梯度洗脫條件Table 2 Gradient elution conditions

2.1.2 對照品溶液制備

精密稱取新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、獐牙菜苷、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、灰氈毛忍冬皂苷甲、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙對照品適量，用70%甲醇溶解分別制得對照品溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，密封，低溫避光保存，備用。

2.1.3 供試品溶液制備

精密稱取供試山銀花樣品粉末1 g，置于帶塞錐形瓶中，加入70%甲醇溶液50 mL，稱重，靜置12 h后，室溫超聲30 min后用70%甲醇補重，取上清液過0.45 μm微孔濾膜，制得供試品溶液。

2.1.4 方法學(xué)考察

2.1.4.1 精密度試驗

取S20號樣品，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。以異綠原酸A為參照峰，測得22個共有峰相對保留時間的RSD在0.003%～2.07%，相對峰面積的RSD在1.00%～2.99%，表明儀器精密度良好。

2.1.4.2 重復(fù)性試驗

取S20號樣品6份，每份精密稱取1 g，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣，記錄色譜圖。以異綠原酸A為參照峰，測得22個共有峰相對保留時間的RSD在0.01%～2.78%，相對峰面積的RSD在0.52%～2.67%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.4.3 穩(wěn)定性試驗

精密稱取S20號樣品1 g，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下，分別于0、4、8、12、18、24 h進樣，進行色譜分析，記錄色譜圖。以異綠原酸A為參照峰，測得22個共有峰相對保留時間的RSD在0.30%～2.57%，相對峰面積的RSD在0.31%～3.00%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5 指紋圖譜的建立

將29批山銀花藥材樣品供試品溶液分別進樣測定，將圖譜以AIA格式保存，導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2012 年版)。以S1號圖譜作為參照譜，采用中位數(shù)法，進行多點校正和色譜峰匹配，29批山銀花藥材樣品共得到了22個共有峰，其指紋圖譜疊加圖見圖1，對照指紋圖譜見圖2，混合對照品圖譜見圖3。

圖1 29批山銀花樣品指紋圖譜疊加圖Fig.1 Fingerprint superposition of 29 batches of Lonicerae Flos

圖2 29批山銀花對照指紋圖譜Fig.2 Reference fingerprint of Lonicerae Flos

圖3 混合對照品圖譜Fig.3 HPLC of mixed reference substances注：1-新綠原酸；2-綠原酸；3-咖啡酸；4-獐牙菜苷；5-木犀草苷；6-異綠原酸B；7-異綠原酸A；8-灰氈毛忍冬皂苷乙；9-灰氈毛忍冬皂苷甲；10-川續(xù)斷皂苷乙。Note:1-Neochlorogenic acid;2-Chlorogenic acid;3-Caffeic acid;4-Sweroside;5-Cynaroside;6-Isochlorogenic acid B;>7-Isochlorogenic acid A;8-Macranthoidin B;9-Macranthoidin A;10-Dipsacoside B.

2.1.6 相似度分析

將 29批山銀花的圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件(2012 年版)，計算相似度，結(jié)果29批山銀花的相似度見表3。29批山銀花的指紋圖譜相似度均>0.95，表明所采集的山銀花樣品質(zhì)量穩(wěn)定均一。

表3 山銀花藥材相似度結(jié)果Table 3 Results of similarity evaluation of 29 batches of Lonicerae Flos

2.1.7 層次聚類分析

運用SPSS 26數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件，采用組間聚類方法，歐氏距離平方法測量樣品間距離進行系統(tǒng)聚類分析(hierarchical clustering analysis，HCA)，結(jié)果見圖4。由圖可知，在分類距離為20時，山銀花樣本被分為兩大類，S1、S4、S5、S15、S16、S22、S23、S26、S27、S29 、S6、S7、S17、S18為一類，S3、S8、S13、S14、S19、S24、S28、S2、S9、S10、S11、S12、S20、S21、S25為一類。在距離為6時，樣本被分為4類，山銀花各批次間有明顯的分類距離；S1、S4、S5、S15、S16、S22、S23、S26、S27、S29被歸為一類，S6、S7、S17、S18被分為一類，S3、S8、S13、S14、S19、S24、S28 被分為一類，S2、S9、S10、S11、S12、S20、S21、S25被歸為一類。

圖4 聚類分析結(jié)果Fig.4 Systematic tree map

2.1.8 正交偏最小二乘法判別分析

圖5 山銀花成分VIP圖Fig.5 OPLS-DA score scatter plot of 29 batches of Lonicerae Flos

2.2 基于成分-靶點-通路的有效性分析

對本研究圖5中VIP>1且通過對照品指認的八種化學(xué)成分(綠原酸、異綠原酸A、新綠原酸、獐芽菜苷、異綠原酸B、灰氈毛忍冬皂苷乙、咖啡酸、川續(xù)斷皂苷乙)進行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，驗證分析山銀花的潛在質(zhì)量標(biāo)志物的有效性，相關(guān)活性化合物信息如表4所示。

表4 活性化合物信息表Table 4 Information of active compound

2.2.1 靶標(biāo)的預(yù)測篩選與蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

使用 Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)數(shù)據(jù)庫對以上8個活性化合物進行靶標(biāo)預(yù)測，選擇其中可能性(Probability)大于0的靶點合并、刪除重復(fù)項，共獲得154個人源靶標(biāo)。將潛在靶標(biāo)導(dǎo)入STRING(https：//string-db.org/)數(shù)據(jù)庫，選擇物種為人類，設(shè)置combined_score≥0.9的97個靶標(biāo)作為相互作用關(guān)系數(shù)據(jù) ，通過Cytoscape 3.8.2軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)，并使用Cytoscape 3.8.2軟件中的Network Analyze工具進行網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)分析，計算度值(degree)、介數(shù)中心性(betweenness centrality)和接近中心性(closeness centrality)等參數(shù)，見圖6。該網(wǎng)絡(luò)由97個節(jié)點(靶標(biāo))組成，以尺寸和顏色來表示拓撲學(xué)參數(shù)值大小，顏色越深尺寸越大表示拓撲學(xué)參數(shù)越大。選取度值≥6(二倍中位數(shù))、介數(shù)中心性和接近中心性2 個重要拓撲參數(shù)均大于中位數(shù)的靶點作為核心靶點[11]，如圖6所示，核心靶標(biāo)共有16個：STAT3、EGFR、MAPK1、APP、PIK3CA、ITGB1、CASP3、FYN、ESR1、LCK、CASP8、PRKCD、MAP2K1、ERBB2、SYK、JUN。

圖6 蛋白質(zhì)互作圖Fig.6 Protein-protein interaction network

2.2.2 基因功能富集分析

通過 Metascape(www.metascape.org/)在線基因功能富集分析工具對16個核心靶標(biāo)進行基因本體論(gene ontology，GO)和全基因組及代謝途徑(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析，設(shè)定分析的物種為“智人”，其他選項設(shè)定默認，選擇P值≤0.01進行個性化分析。根據(jù)數(shù)據(jù)信息，選擇按照P值升序排列的前15條基因功能，以名稱與富集因子使用微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)網(wǎng)站可視化作圖得到分子生物學(xué)功能(molecular function，MF)、生物學(xué)過程(biological process，BP)和細胞學(xué)組分(cellular components，CC)的柱狀圖，選擇按照P值升序排列前15條的基因通路制作KEGG通路氣泡圖。

2.2.2.1 靶標(biāo)的GO功能注釋

GO功能注釋結(jié)果見圖7，包括16個核心靶標(biāo)的BP(332條)、CC(29條)和MF(35條)的富集結(jié)果。柱狀圖縱坐標(biāo)為count，以不同的顏色區(qū)分GO注釋的三大功能。因條目數(shù)量過多，每個功能注釋僅展示p值最小前15的條目，見圖7。主要涉及水解酶活性正向調(diào)節(jié)、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路、酶聯(lián)受體蛋白信號通路、細胞的激活、造血或淋巴器官的發(fā)育、免疫系統(tǒng)生長、蛋白質(zhì)磷酸化、peptidyl-tyrosine磷酸化、peptidyl-tyrosine改變、對生長因子的響應(yīng)、對無機物的反應(yīng)、白細胞激活、細胞對有機氮化合物的反應(yīng)、細胞對氮化合物的反應(yīng)、蛋白質(zhì)磷酸化的正向調(diào)節(jié)、膜筏、microdomain、細胞質(zhì)的核周區(qū)、神經(jīng)膠質(zhì)細胞投影、質(zhì)膜蛋白復(fù)合物、早期內(nèi)體、復(fù)雜受體、質(zhì)膜細胞質(zhì)側(cè)的外源性成分、膜的外部成分、囊腔、細胞前緣、粘著斑、細胞基質(zhì)結(jié)、質(zhì)膜外源成分、質(zhì)膜的細胞質(zhì)側(cè)、蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白激酶活性、醇基受體磷酸轉(zhuǎn)移酶活性、激酶活性、酶激活活動、磷酸酶綁定、非跨膜蛋白酪氨酸激酶活性、磷脂酶激活活動、鏈接蛋白結(jié)合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、激酶綁定、脂肪酶催化劑活性、磷脂酶結(jié)合、蛋白磷酸酶綁定等生物活動。

圖7 GO功能注釋柱狀圖Fig.7 The bar graph of GO function enrichment analysis

2.2.2.2 靶標(biāo)信號通路富集分析

對山銀花的16個核心靶標(biāo)的通路富集分析如圖8(僅展示p值最小的15條)所示，圖中點的大小代表count，顏色深淺代表-log10(P)，橫坐標(biāo)代表GeneRatio，結(jié)果表明主要涉及癌癥通路、癌癥蛋白聚糖通路、PD-L1在癌癥中的表達和PD-1檢查點通路、卡波濟肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、內(nèi)分泌的阻力、粘著斑、破骨細胞分化、自然殺傷細胞介導(dǎo)的細胞毒性、雌激素信號通路、乳腺癌、丙型肝炎、非小細胞肺癌、乙型肝炎、胰腺癌、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥等115條信號通路。

圖8 靶標(biāo)信號通路富集分析氣泡圖Fig.8 The bubble chart of KEGG function enrichment analysis

2.2.3 化合物-靶標(biāo)-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將上述分析得到115個通路及16個關(guān)鍵靶標(biāo)與對應(yīng)的化合物數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建“化合物-靶標(biāo)-通路”網(wǎng)絡(luò)，如圖9所示[12]。圖中外面兩層藍色圓點為115個通路，最內(nèi)層紅色圓點為8個潛在質(zhì)量標(biāo)志物，次內(nèi)層綠色遠點為16個核心靶點。

圖9 化合物-靶標(biāo)-通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig.9 Compound-target-pathway network diagram

2.2.4 分子對接驗證

根據(jù)上述網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果結(jié)合考量山銀花功效，選擇STAT3、EGFR、MAPK1及PIK3CA作為分子對接驗證的靶標(biāo)蛋白，從PDB數(shù)據(jù)庫中下載STAT3(ID:5AX3 配體：5ID)、EGFR(ID:6JRK 配體：C6O)、MAPK1(ID:TAUV 配體：RYW)及PIK3CA(ID:3ZIM 配體：KKR)結(jié)構(gòu)，從ZINC數(shù)據(jù)庫下載8個潛在質(zhì)量標(biāo)志物化合物的mol2格式，使用Schr?dinger軟件中的Protein Preparation wizard模塊對蛋白質(zhì)進行補足缺失殘基以及中性化等操作，最后進行能量最小化并添加OPLS4力場，使用Receptor Grid Generation模塊根據(jù)原有配體默認生成Grid文件，采用Schr?dinger的LigPrep模塊對各分子進行加氫、能量最小化、幾何優(yōu)化等處理，在OPLS4的力場下，將蛋白質(zhì)與化合物對接，并將打分結(jié)果與原配體化合物進行對比[13]，對接結(jié)果見表5，對接結(jié)合見圖10。8個化合物與蛋白質(zhì)對接后docking score均<0，93.75%的化合物docking score<-5且與原活性化合物對接結(jié)果相近，證明8個成分與靶點對接效果良好。

表5 成分與關(guān)鍵靶蛋白的分子對接結(jié)果Table 5 Binding result of components with its key targets

圖10 EGFR蛋白與獐芽菜苷(A)、灰氈毛忍冬皂苷乙(B)對接圖Fig.10 Docking diagram of EGFR protein with sweroside (a) and macranthoidin B (b)

2.3 化學(xué)可測性分析

2.3.1 方法學(xué)考察

2.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取對照品溶液，70%甲醇等比稀釋新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、獐芽菜苷、異綠原酸B、異綠原酸A、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，密封，低溫避光保存，備用。精密吸取各濃度對照溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，按“2.1.1”項色譜條件測定，以對照品濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，8種化學(xué)成分線性回歸方程見表6。

表6 山銀花中8種化學(xué)成分線性回歸方程Table 6 Linear regression equations of eight chemical constituents of Lonicerae Flos

從表6可知，新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、獐牙菜苷、異綠原酸B、異綠原酸A、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙線性關(guān)系良好。

2.3.1.2 精密度實驗

取S20號樣品，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，在該項色譜條件下連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖。測得新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、獐牙菜苷、異綠原酸B、異綠原酸A、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙峰面積的RSD分別為2.42%、0.32%、0.99%、1.18%、2.34%、0.24%、1.45%、0.93%，表明儀器精密度良好。

2.3.1.3 穩(wěn)定性實驗

精密稱取S20號樣品，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，在該項色譜條件下，分別于0、4、8、12、18、24 h進樣，進行色譜分析，記錄色譜圖。測得新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、獐牙菜苷、異綠原酸B、異綠原酸A、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙峰面積的RSD分別為2.99%、0.44%、2.20%、2.47%、2.65%、0.37%、1.83%、0.92%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.1.4 重復(fù)性實驗

精密稱取S20號樣品6份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，在該項色譜條件下進樣，記錄色譜圖。測得新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、獐牙菜苷、異綠原酸B、異綠原酸A、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續(xù)斷皂苷乙峰面積的RSD分別為1.98%、1.86%、1.56%、2.26%、2.52%、1.47%、2.29%、1.22%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.1.5 加樣回收實驗

精密稱定已知含量的對應(yīng)山銀花樣品6份，分別精密加入適量對照品溶液，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按照2.1.1項色譜條件下進樣，記錄色譜圖，計算加樣回收率。結(jié)果表明新綠原酸的平均回收率為102.84%(RSD=2.28%)，綠原酸的平均回收率為96.44%(RSD=0.74%)，咖啡酸的平均回收率為100.68%(RSD=2.53%)，獐牙菜苷的平均回收率為100.28%(RSD=1.32%)，異綠原酸B的平均回收率為101.97%(RSD=0.80%)，異綠原酸A的平均回收率為99.79%(RSD=2.70%)，灰氈毛忍冬皂苷乙的平均回收率為99.71%(RSD=1.14%)，川續(xù)斷皂苷乙的平均回收率為100.38%(RSD=2.30%)，表明該方法的回收率良好。

2.3.2 含量測定

按“2.1.3”項下方法制備29批山銀花樣品供試品溶液，按“2.1.1”項色譜條件進樣，記錄色譜圖，根據(jù)表6中標(biāo)準(zhǔn)曲線進行計算，其百分含量結(jié)果見表7。

表7 山銀花樣品中8種化學(xué)成分的含量Table 7 Content of eight main components of Lonicerae Flos

2.4 基于植物親緣性的質(zhì)量標(biāo)志物分析

2005版《中國藥典》始將金銀花和山銀花分列，其中忍冬科忍冬干燥花蕾或帶初開的花臨床作金銀花入藥；灰氈毛忍冬、紅腺忍冬、華南忍冬及黃褐毛忍冬干燥花蕾或帶初開的花臨床作山銀花使用，建立同科同屬不同種來源中藥材(金銀花和山銀花)的定性鑒別方法以確保入藥來源的準(zhǔn)確性十分必要。Wang等[14]采用 UPLC 法測定新綠原酸、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙等含量，用于定性鑒別區(qū)分金銀花和山銀花；金銀花與山銀花上述成分含量不同，金銀花皂苷類成分極低不易檢測，而山銀花中皂苷類含量高；Zhang等[15]利用測定金銀花與灰氈毛忍冬中的新綠原酸、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A等成分的含量區(qū)分忍冬與灰氈毛忍冬。綜上所述，金銀花與山銀花在酚酸類、黃酮類及皂苷類成分含量上存在顯著差異，將新綠原酸、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續(xù)斷皂苷乙等作為山銀花的質(zhì)量標(biāo)志物能夠區(qū)別不同來源“銀花”。

3 討論與結(jié)論

3.1 基于化學(xué)成分可測性對質(zhì)量標(biāo)志物討論

本文通過HPLC建立了山銀花的指紋圖譜，29批山銀花樣品間相似度>0.95，方法學(xué)考察結(jié)果證明HPLC指紋圖譜穩(wěn)定可靠。對山銀花進行潛在質(zhì)量標(biāo)志物的含量測定，結(jié)果表明，所有樣品以上8種成分均可檢測，且所有樣品綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙及川續(xù)斷皂苷乙成分含量都遠高于藥典標(biāo)準(zhǔn)，表明湖南產(chǎn)不同規(guī)格山銀花質(zhì)量均良好。HCA分析結(jié)果表明，在分類距離為20時，除18號樣品外，其他樣品按加工方式聚成兩大類(蒸汽殺青、低溫干燥)；在分類距離為6時，除1、27、13、18外其他樣品按照品種與加工方式的不同聚成4類(蒸汽殺青湘蕾、蒸汽殺青五彩花、低溫干燥湘蕾、低溫干燥五彩花)。其中，1、27是蒸汽殺青湘蕾但與低溫干燥湘蕾在HCA分析中分類距離更近，18是蒸汽殺青的五彩花在分類學(xué)上與低溫干燥五彩花分類更近，13是蒸汽殺青湘蕾與蒸汽殺青五彩花分類更近，提示加工方法對藥材品質(zhì)有較大的影響。

3.2 基于有效性對質(zhì)量標(biāo)志物討論

山銀花入藥時其味甘，寒，歸肺、心、胃經(jīng)，具清熱解毒，疏散風(fēng)熱功效。現(xiàn)代研究表明，甘味[16]與皂苷、維生素、蛋白質(zhì)、甾醇及氨基酸等成分有關(guān)，清熱解毒、疏散風(fēng)熱與現(xiàn)代研究中的抗炎抗菌增強免疫等反應(yīng)有關(guān)。運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從有效性角度分析發(fā)現(xiàn)，咖啡酸、獐牙菜苷等八種化合物通過調(diào)控STAT3、EGFR、MAPK1、APP、PIK3CA、ITGB1、CASP3等16個關(guān)鍵靶點，作用于能量代謝、神經(jīng)遞質(zhì)傳遞、炎癥反應(yīng)等生理過程，與其清熱解毒、疏散風(fēng)熱的傳統(tǒng)功效相關(guān)。

深入分析相關(guān)靶點可以發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)的靶點尤其多，以STAT3與EGFR靶點為例 。STAT3靶點全稱Signal Transducer And Activator Of Transcription 3，信號轉(zhuǎn)換器與轉(zhuǎn)錄激活器[18]。STAT家族成員作為細胞因子和生長因子[18]，該蛋白可被各種細胞因子和生長因子磷酸化激活，包括EGF、IL5、IL6、HGF、LIF和BMP2[18]。EGFR靶點全稱表皮生長因子受體，該蛋白是表皮生長因子家族成員的受體[17]。EGFR誘導(dǎo)受體二聚化和酪氨酸自磷酸化，導(dǎo)致細胞增殖[18]。EGFR是導(dǎo)致新冠病毒(COVID-19)由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型(SARS-CoV-2)感染引起的嚴(yán)重形式的細胞因子風(fēng)暴的組成部分[18,19]。研究證實，上述靶點確為肺部相關(guān)感染中表現(xiàn)突出的靶點，與山銀花的傳統(tǒng)性味歸經(jīng)一致。

文獻表明咖啡酸通過NF-kB依賴性途徑抑制TNF-α和PGE2的產(chǎn)生，提高巨噬細胞的細菌清除活性[20]，抑制AGE的形成，調(diào)節(jié)腸道炎癥[21]，降低血清和腎臟中ACE和精氨酸酶活性、降低MDA和升高NOx水平來抗高血壓[21]，阻斷STAT3和抑制MMP2和MMP-9，阻止ROS的產(chǎn)生以及減少腫瘤細胞血管生成來起抗肝癌作用[22]，激活JNK/Bcl-2介導(dǎo)的體外自噬降低A53Tα-突觸核蛋白改善帕金森病行為并保護多巴胺能神經(jīng)元[23]，降低氧化應(yīng)激改善血脂水平，減少主動脈損傷抗動脈粥樣硬化[24]。獐芽菜苷能通過上調(diào)miR-29a、抑制col1和TIMP1發(fā)揮抗肝纖維化作用[25]，抑制NLRP3炎癥體的激活預(yù)防非酒精性脂肪性肝炎[26,27]，誘導(dǎo)肝癌細胞Akt磷酸化并抑制Pck1表達來抗癌[28]。通過代謝組學(xué)分析，異綠原酸A、異綠原酸B、綠原酸、新綠原酸、川續(xù)斷皂苷乙等均為山銀花的入血成分[29]，因此文獻研究結(jié)果與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究證明以上8個潛在質(zhì)量標(biāo)志物確為山銀花發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。

綜上，本研究基于HPLC指紋圖譜結(jié)合聚類分析可有效區(qū)分不同品種與加工方式的山銀花；本研究基于OPLS-DA分析結(jié)果，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)闡明了綠原酸、異綠原酸A、新綠原酸、獐芽菜苷、異綠原酸B、灰氈毛忍冬皂苷乙、咖啡酸、川續(xù)斷皂苷乙8個化合物可作為山銀花質(zhì)量標(biāo)志物，其為進一步建立提升山銀花質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了參考。