基于網(wǎng)絡(luò)藥理學探討柴胡干預(yù)帕金森病的作用機制

徐水婷，胡玉英

1 廣西中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院，廣西南寧 530001；2 廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院腦病科，廣西南寧 530023

帕金森?。≒D）是一種常見于中老年人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，臨床典型的四大主癥包括靜止性震顫、運動遲緩、肌強直及姿勢平衡障礙。目前PD的發(fā)病機制尚不明確，研究表明其與氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、免疫炎性異常等諸多因素有關(guān)［1-2］。目前左旋多巴仍是治療PD的金標準，但隨著用藥時間延長，藥效逐漸減弱，且伴隨出現(xiàn)各種不良反應(yīng)及并發(fā)癥。傳統(tǒng)中藥柴胡具有明顯疏肝解郁之功效。PD的臨床治療中，以柴胡為主的中藥復(fù)方應(yīng)用廣泛?，F(xiàn)代藥理學表明，柴胡可有效降低促炎性細胞因子的表達［3］，影響神經(jīng)遞質(zhì)的產(chǎn)生，抑制蛋白沉積，調(diào)節(jié)細胞凋亡通路，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)等［4-6］。目前對于柴胡干預(yù)PD的藥理學機制的研究相對較少。而網(wǎng)絡(luò)藥理學基于“疾病—基因—靶點—藥物”相互作用網(wǎng)絡(luò)，綜合觀察藥物對疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)與影響，從而系統(tǒng)、整體地探索藥物與機體的相互作用［7］。本研究則通過網(wǎng)絡(luò)藥理學方法，從化學成分、作用靶點和信號傳導(dǎo)通路等方面進行系統(tǒng)研究，進一步揭示柴胡的藥理作用機制，并為PD的中藥治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 柴胡有效成分篩選及相關(guān)靶點預(yù)測 在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）搜索“柴胡”的化學成分，按照“口服生物利用度（OB）≥30%，藥物類藥性（DL）≥0.18”條件篩選出柴胡有效成分，然后保存相關(guān)靶點，并通過ChemMapper網(wǎng)站補充柴胡成分靶點信息。利用UniProt數(shù)據(jù)庫對柴胡有效成分的相關(guān)靶點進行基因注釋。

1.2 柴胡—PD共同靶點收集及網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖構(gòu)建 以“Parkinson's disease”作為關(guān)鍵詞，檢索人類基因數(shù)據(jù)庫（GeneCards）和在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM），整合去重后得到PD的疾病靶點。運用在線軟件Venny 2.1.0對獲得的柴胡成分靶點和PD疾病靶點進行分析處理，最終得到柴胡與PD的共同靶點。利用Cytoscape軟件構(gòu)建柴胡—PD共同靶點的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

1.3 柴胡—PD蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將柴胡—PD共同靶點帶入STRING網(wǎng)站，選擇homo sapiens種屬，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖。下載并保存PPI網(wǎng)絡(luò)中的tsv文件，運用Cytoscape的CentiScaPe插件進行PPI網(wǎng)絡(luò)拓撲分析，以連接度（Degree）≥62最終篩選出核心靶點。

1.4 柴胡—PD共同靶點GO分析及KEGG通路富集分析 將柴胡—PD共同靶點導(dǎo)入已安裝Bioconductor、ClusterProfiler、ggplot程 序包及相關(guān)附加包的Rstudio軟件中進行GO功能富集分析及KEGG通路富集分析，包括GO分析的生物過程（BP）、細胞成分（CC）和分子功能（MF）以及KEGG通路。按照P≤0.01且從小到大排序，選取前20位GO分析和KEGG通路富集分析結(jié)果，并對分析結(jié)果進行可視化構(gòu)建。

1.5 KEGG通路關(guān)系網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 從得到的KEGG通路數(shù)據(jù)中選取富集最顯著的前20位，運用Cytoscape軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖。計算出網(wǎng)絡(luò)中各個節(jié)點的Degree值，調(diào)整節(jié)點的大小，以表示靶點與通路的相關(guān)性大小。

2 結(jié)果

2.1 柴胡有效成分及相關(guān)靶點 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫共篩選出柴胡有效成分17個。見表1。通過ChemMapper網(wǎng)站補充柴胡有效成分的相關(guān)靶點，整理去重后共得到746個潛在靶點。

表1 柴胡17個有效成分基本信息

2.2 柴胡—PD共同靶點及網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖 在Gene-Cards數(shù)據(jù)庫中得到PD相關(guān)靶點7 232個，選擇相關(guān)度得分≥13.01的靶點作為PD的潛在靶點，共獲得907個。結(jié)合OMIM數(shù)據(jù)庫補充相關(guān)靶點，去重后得到1 809個PD相關(guān)靶點。將柴胡有效成分的746個靶點與1 809個PD相關(guān)靶點取交集，通過在線軟件Venny 2.1.0繪制韋恩圖，獲得172個共同靶點，見圖1。利用Cytoscape軟件構(gòu)建柴胡—PD共同靶點的可視化網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，見圖2。

圖1 柴胡—PD共同靶點韋恩圖

圖2 柴胡—PD共同靶點的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

2.3 柴胡—PD共同靶點PPI網(wǎng)絡(luò)及核心靶點 在STRING網(wǎng)站中導(dǎo)入柴胡—PD的172個共同靶點后，得到柴胡—PD共同靶點PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖3。使用Cytoscape中CentiScaPe插件進行拓撲結(jié)構(gòu)分析，以Degree值≥62最終篩選出28個核心靶點，其中AKT1、INS、TNF、CASP3、IL6、TP53、VEGFA等為主要核心靶點，見圖4。

圖3 柴胡—PD共同靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 柴胡—PD核心靶點圖

2.4 柴胡—PD共同靶點GO功能及KEGG通路富集分析結(jié)果 將柴胡—PD共同靶點導(dǎo)入Rstudio軟件中進行GO功能富集分析及KEGG通路富集分析，以P值＜0.01為篩選條件，得到439條GO生物學過程，159條KEGG通路。再利用R軟件進行GO條形圖以及KEGG氣泡圖的繪制，見圖5、6。圖5分別給出前20條BP、CC、MF富集分析結(jié)果，表明柴胡干預(yù)PD主要涉及基因表達、MAP激酶活性的正調(diào)控、老化、凋亡、細胞增殖等生物過程，細胞外間隙、膜筏、線粒體、高分子配合物、質(zhì)膜等細胞成分以及相同的蛋白結(jié)合、酶結(jié)合、蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性、大分子復(fù)雜結(jié)合、血紅素結(jié)合等分子功能。圖6顯示了柴胡干預(yù)PD排名前20的信號通路，包括癌癥通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化、HIF-1信號通路等。

圖5 GO功能富集分析結(jié)果圖

圖6 KEGG通路富集分析結(jié)果圖

2.5 KEGG通路關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖 從得到的KEGG通路數(shù)據(jù)中選取富集最顯著的前20位構(gòu)建KEGG通路關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，見圖7。

圖7 KEGG通路關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

PD屬中醫(yī)學“顫病”等范疇，按運動癥狀主要分為震顫型和僵直少動型，前者多為肝腎虧虛、肝風內(nèi)動，治宜補益肝腎、平肝熄風；后者多為肝腎虧虛、筋失濡養(yǎng)，治宜補益肝腎、養(yǎng)血柔筋［8］。由此可知，肝腎虧虛是PD的重要病機。肝以氣為用，以血為本，若肝失所養(yǎng)，肝風內(nèi)動，可致震顫［9］。中醫(yī)臟腑理論認為，肝膽相表里，且肝膽兩經(jīng)相互絡(luò)屬，在生理和病理上有著密切的聯(lián)系。肝主疏泄，膽主通降，膽汁的正常排泄依靠肝的疏泄功能，肝膽合病終屬“少陽病”范疇。臨床發(fā)現(xiàn)從“和解少陽”治療PD，能改善患者癥狀，療效明顯［10］。

中藥柴胡歷史悠久，味苦、辛，性微寒，歸肝膽經(jīng)，具有和解少陽之功，是治療少陽證的首選藥材。中醫(yī)認為，PD臟腑定位主在肝，治療方藥以柴胡劑為主，取其君藥柴胡和解少陽、調(diào)暢氣機之效。現(xiàn)代藥理研究表明，柴胡皂苷通過抑制炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)，具有顯著的保肝作用，這也是柴胡發(fā)揮“引藥

入肝”藥性的物質(zhì)基礎(chǔ)［11-13］。本研究發(fā)現(xiàn)，乙酸芳樟酯、黃芩苷、茵陳黃酮、山柰酚、柴胡皂苷、槲皮素、豆甾醇等為柴胡主要有效成分。目前研究較多的眾多黃酮類成分中，山柰素是一種很強的活性氧自由基清除劑，具有抗氧化作用［14］，槲皮素也可通過降低氧化產(chǎn)物的水平，減輕紋狀體的炎癥及氧化損傷。其他柴胡活性成分中，黃芩苷對過氧化脂質(zhì)及氧化型谷胱甘肽形成均有抑制作用，能夠增強超氧化物歧化酶、過氧化氫酶的活性，進而改善氧化應(yīng)激反應(yīng)［15］。曲克蘆丁可有效增強腺苷酸環(huán)化酶及乙酰膽堿酯酶的活性，從而促進神經(jīng)元細胞的快速修復(fù)，維持神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)的完整性［16］。豆甾醇能通過大腦血流屏障，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，提高線粒體跨膜電位和ATP量，從而減輕PD患者的神經(jīng)元變性［17］等。這些有效成分可在某種程度上干預(yù)PD的發(fā)病機制。

本研究顯示，GO富集分析結(jié)果主要涉及基因表達、MAP激酶活性的正調(diào)控、老化、凋亡、細胞增殖等生物過程。KEGG通路顯著富集主要在脂質(zhì)和動脈粥樣硬化通路、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化通路、HIF-1信號通路等。脂質(zhì)參與了大多數(shù)經(jīng)典的PD相關(guān)過程，例如氧化應(yīng)激，但血脂水平與PD風險之間的因果關(guān)系尚未確定［18］。有研究認為，PD患者的動脈粥樣硬化程度隨著PD病程的進展逐漸減輕，可能是通過miR-106a-5p/ABCA1通路影響泡沫細胞膽固醇的逆轉(zhuǎn)運而發(fā)揮作用［19］。HIF-1α作為最先發(fā)現(xiàn)的低氧誘導(dǎo)因子家族中蛋白因子，低氧時呈高表達，可精準反映細胞內(nèi)氧分壓水平，并對下游靶細胞進行調(diào)控，從而發(fā)揮神經(jīng)保護作用［20］。除了前20條顯著富集的通路外，共同靶點還富集在MAPK信號通路、PI3K/AKT信號通路、IL-17信號通路等與PD相關(guān)的信號通路上。MAPK是神經(jīng)元凋亡的強效因子，其過度激活可導(dǎo)致PD神經(jīng)元死亡［21］。p38 MAPK信號通路作為MAPK信號通路之一，其異常激活后能通過調(diào)控自噬參與PD進程［22］。另外，PTEN/PI3K/AKT軸可控制代謝、凋亡、細胞生長和增殖等多種生物信號傳導(dǎo)過程，是一條調(diào)節(jié)機體功能的重要途徑［23］，PI3K/AKT信號傳導(dǎo)也是自噬的經(jīng)典負調(diào)控途徑［24］，通過上調(diào)miR-221靶向PTEN介導(dǎo)的PI3K/AKT信號通路來調(diào)節(jié)自噬，從而發(fā)揮對PD的保護作用［25］。炎癥對PD神經(jīng)退行性變的關(guān)鍵作用已得到充分證實。IL-17就是一種促炎因子。有研究表明，產(chǎn)生IL-17的T淋巴細胞通過IL-17R介導(dǎo)并導(dǎo)致下游的NF-κB激活［26］。NF-κB作為免疫反應(yīng)的主要轉(zhuǎn)錄因子，過度的激活引發(fā)異常的炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致PD患者多巴胺能神經(jīng)元丟失的主要因素之一［27］。綜上，柴胡中的活性成分可能通過上述通路，調(diào)節(jié)血脂水平、氧化應(yīng)激、神經(jīng)保護、凋亡、自噬、炎癥反應(yīng)等，從而發(fā)揮干預(yù)PD的作用。

本研究PPI網(wǎng)絡(luò)核心靶點和及KEGG關(guān)系網(wǎng)絡(luò)分析顯示，柴胡可能通過AKT1、INS、TNF、CASP3、IL-6、TP53、VEGFA等靶點發(fā)揮治療作用。AKT又稱蛋白激酶B，AKT1作為其亞型之一，通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄發(fā)揮作用，其活性減低與PD的發(fā)病密切相關(guān)［28］。TNF、IL-6均是典型的炎性細胞因子。PD的發(fā)病過程涉及神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)和多種免疫應(yīng)激反應(yīng)，與血清TNF-α及IL-6等水平的變化有密切聯(lián)系［29］。其中，TNF分型TNF-α是由單核細胞和淋巴細胞產(chǎn)生的重要炎癥介質(zhì)，參與機體免疫反應(yīng)［30］，通過誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，使活性氧堆積在紋狀路，引起神經(jīng)元凋亡，參與PD發(fā)病過程［31］。IL-6也是調(diào)控機體炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答較為重要的炎癥因子之一［32］。CASP3是調(diào)控細胞凋亡過程的標志蛋白，細胞凋亡原本是細胞主動死亡的過程，在維持機體穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著非常重要的作用，但異常凋亡與PD的發(fā)展進程有關(guān)［33］。VEGF對PD具有治療作用，主要是VEGF與VEGFR2結(jié)合后激活P13K/Akt及MEK/Erk途徑減少神經(jīng)細胞凋亡，通過一個獨立的機制直接作用于神經(jīng)細胞促進神經(jīng)再生和恢復(fù)［34］。

綜上，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學探討柴胡干預(yù)PD的作用機制，結(jié)果表明，柴胡通過多成分、多靶點、多通路發(fā)揮作用，表明了多個生物學過程的介導(dǎo)和參與是中藥發(fā)揮治療作用的關(guān)鍵，也為本課題后期研究中藥復(fù)方治療PD的作用機制奠定了理論基礎(chǔ)。

利益沖突所有作者聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明徐水婷：論文撰寫及文獻資料的收集分析；胡玉英：論文審核及修正，指導(dǎo)寫作