烏鱧globin基因家族的鑒定及在鰓和鰓上器官中的表達(dá)模式分析?

陶澤鑫，李建龍，溫海深，李 超，孫冬磊，陳基偉，李 昀??

(1.海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國海洋大學(xué))，山東 青島 266003；2.威海海洋職業(yè)學(xué)院海洋生物系，山東 威海 264300；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院, 山東 青島 266200)

珠蛋白(Globin)是一類含有血紅素的蛋白質(zhì)，能夠在卟啉環(huán)中心的鐵原子和多肽鏈上的組氨酸殘基之間可逆地結(jié)合氧氣與其他氣體[1]。在脊椎動(dòng)物中，Globin進(jìn)化成血紅蛋白(Hemoglobin，Hb)、肌紅蛋白(Myoglobin，Mb)、細(xì)胞珠蛋白(Cytoglobin，Cygb)、神經(jīng)珠蛋白(Neuroglobin，Ngb)、雄激素結(jié)合珠蛋白(Androglobin，Adgb)、珠蛋白E(GbE)、珠蛋白Y(GbY)和珠蛋白X(GbX)8種不同的類型[2]。其中Adgb起源于動(dòng)物進(jìn)化早期[3]，與其他globin基因家族成員關(guān)系遙遠(yuǎn)，不在本文研究范圍內(nèi)。Hb和Mb是目前研究較多的兩類Globin。Hb存在于紅細(xì)胞中，是由兩個(gè)α亞基和兩個(gè)β亞基組成的四聚體結(jié)構(gòu),每條鏈均能與一個(gè)亞鐵血紅素結(jié)合。Mb存在于脊椎動(dòng)物的心肌和骨骼肌中，是一種只有三級(jí)結(jié)構(gòu)的單鏈蛋白質(zhì)，與Hb的α和β亞基三級(jí)結(jié)構(gòu)極為相似。Hb和Mb不僅能夠儲(chǔ)存和運(yùn)輸氧氣，還具有催化亞硝酸鹽降解、調(diào)節(jié)一氧化氮(Nitric oxide，NO)的產(chǎn)生和消除以及活性氧(Reactive oxygen species，ROS)防御等作用[4-5]。此外，Mb還具有增加線粒體中可用氧氣的功能[6]。近十幾年，隨著基因組研究的迅速發(fā)展，Ngb、Cygb和GbE等新的globin基因家族成員被鑒定出來，然而其具體的功能機(jī)制尚未明確。Ngb主要在神經(jīng)細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞中表達(dá)，推測其具有氧化代謝、消除NO和ROS以及抑制細(xì)胞凋亡等多種功能[7]。Cygb主要在成纖維細(xì)胞以及神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)，可能參與膠原蛋白合成[8-9]和ROS防御[10]過程。此外，在一些脊椎動(dòng)物中還存在特殊的變異Globin亞型，如僅在鳥類、海龜和肺魚等存在的GbE[11-12]，僅在熱帶爪蟾(Xenopustropicalis)、非洲爪蟾(Xenopuslaevis)和鴨嘴獸(Ornithorhynchusanatinus)等部分有頜類脊椎動(dòng)物中存在的GbY[13-14]，只在硬骨魚類和爪蟾中存在的GbX[15]。目前這幾種Globin的具體生理功能仍處于研究階段[16]。

烏鱧(Channaargus)隸屬鱸形目(Perciformes)鱧科(Channidae)鱧屬(Channa)，是一種營養(yǎng)價(jià)值較高的淡水經(jīng)濟(jì)魚類，富含蛋白質(zhì)、必需氨基酸、二十二碳六烯酸(DHA)等多不飽和脂肪酸以及鐵、鋅和銅等多種微量元素[17-18]。烏鱧生活在含氧率較低的下層水環(huán)境，具有很強(qiáng)的低氧耐受能力。研究發(fā)現(xiàn)，烏鱧的紅細(xì)胞數(shù)量非常高[19]，且血紅蛋白含量也顯著高于其他魚類[20]。同時(shí)烏鱧還具有一種特殊的輔助呼吸器官——鰓上器官(Suprabranchial organ)，可用于在低氧環(huán)境中進(jìn)行空氣呼吸，甚至在離開水的情況下短暫生存[21]。然而，關(guān)于烏鱧耐低氧及空氣呼吸的分子機(jī)制尚未被闡明。

目前，許多學(xué)者對(duì)于硬骨魚類中g(shù)lobin基因的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了研究。有學(xué)者對(duì)黃河裸裂尻魚(Schizopygopsispylzovi)中g(shù)lobin基因家族進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)9個(gè)基因成員，并對(duì)其在低氧條件下的表達(dá)模式進(jìn)行研究，結(jié)果表明在重度缺氧條件下hb、cygb和ngb等基因表達(dá)水平顯著降低，但mb在心臟中表達(dá)水平顯著升高[22]。蟾胡子鯰(Clariasbatrachus)是一種能在陸地上呼吸和移動(dòng)的淡水魚，具有能夠進(jìn)行空氣呼吸的鰓上器官。比較基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究表明，蟾胡子鯰基因組中mb基因相較于其他硬骨魚類出現(xiàn)擴(kuò)增，且hb基因在輔助呼吸器官中表達(dá)水平顯著高于鰓[23]，推測其與空氣呼吸機(jī)制有關(guān)。為探究Hb、Mb及其他Globin在同樣具有耐低氧和空氣呼吸能力的烏鱧中發(fā)揮的潛在作用，本文對(duì)烏鱧globin基因家族進(jìn)行了全基因組鑒定、系統(tǒng)進(jìn)化分析及基因結(jié)構(gòu)分析，并對(duì)其在鰓上器官發(fā)育空氣暴露脅迫中鰓和鰓上器官的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。研究結(jié)果為闡明Globin在烏鱧耐低氧和空氣呼吸過程中的功能機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 烏鱧globin基因的鑒定和序列分析

從NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中獲取人(Homosapiens)、斑馬魚(Daniorerio)和攀鱸(Anabastestudineus)的所有g(shù)lobin基因家族成員的氨基酸序列，通過TBLASTN(1×10-5)對(duì)本課題組前期獲得的烏鱧基因組數(shù)據(jù)庫(JAJQTP000000000)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(PRJNA832507)進(jìn)行檢索，初步確定烏鱧的globin基因候選核苷酸序列，并通過在線網(wǎng)站SoftBerry(http://linux1.softberry.com/berry.phtml)的基因結(jié)構(gòu)預(yù)測功能進(jìn)一步注釋。然后，通過BLASTN(1×10-10)進(jìn)行比對(duì)，明確基因序列和拷貝數(shù)，并對(duì)幾種不同脊椎動(dòng)物的globin基因拷貝數(shù)進(jìn)行比較分析。通過NCBI在線工具Open Reading Frame(ORF)Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預(yù)測烏鱧globin基因的氨基酸序列。利用ExPASy Prot-Param工具(https://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測烏鱧Globin的分子量(molecular weight，MW)和等電點(diǎn)(isoelectric point，pI)。通過CDD數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)對(duì)烏鱧Globin的特征結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測。利用在線網(wǎng)站MEME(https://meme-suite.org/meme/tools/meme)對(duì)烏鱧Globin的保守基序(motif)進(jìn)行分析，并通過TBtools軟件[24]對(duì)結(jié)構(gòu)域和motif進(jìn)行可視化。

1.2 globin基因系統(tǒng)進(jìn)化分析和共線性分析

將預(yù)測獲得的烏鱧globin基因的氨基酸序列與人、小鼠(Musmusculus)、雞(Gallusgallus)、斑馬魚和攀鱸等脊椎動(dòng)物的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。將所有氨基酸序列輸入MEGA 7.0軟件[25]，用ClustalW進(jìn)行多重序列比對(duì)(默認(rèn)參數(shù))，通過Neighbor-Joining(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，bootstrap值選擇重復(fù)1 000次。利用在線網(wǎng)站Interactive Tree Of Life(http://itol.embl.de/)制作出進(jìn)化樹圖。

通過共線性分析進(jìn)一步確定基因的同源性。利用多重共線性掃描工具包(MCScanX)的默認(rèn)參數(shù)[26]分析烏鱧基因組的共線性關(guān)系以及烏鱧基因與其他物種基因的共線性關(guān)系。通過Circos[27]展示烏鱧基因組中的共線性基因，并將globin基因定位到烏鱧染色體上。在NCBI數(shù)據(jù)庫獲取斑馬魚(GRCz11)和攀鱸(fAnaTes1.2)的最新版參考基因組數(shù)據(jù)，通過Multiple Synteny Plot工具(https://github.com/CJ-Chen/TBtools)進(jìn)行物種間的共線性分析。

1.3 烏鱧鰓上器官發(fā)育時(shí)期的樣品采集

烏鱧鰓上器官發(fā)育時(shí)期的實(shí)驗(yàn)用魚取自山東省臨沂市沂水縣個(gè)體養(yǎng)殖戶。在繁殖季節(jié)挑選體格健壯、性腺發(fā)育良好的烏鱧親魚，通過人工授精獲得受精卵，在繁殖池進(jìn)行孵化和培育。分別在烏鱧仔稚魚受精后3、5和8 d時(shí)，將仔稚魚用MS-222麻醉后在體視鏡下用鑷子采集鰓上器官樣品，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)(每個(gè)樣品采集24尾魚進(jìn)行混樣)，樣品在RNA保護(hù)液中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 烏鱧空氣暴露脅迫實(shí)驗(yàn)的樣品采集

空氣暴露脅迫的實(shí)驗(yàn)用魚取自于江蘇省連云港市東?？h辰發(fā)黑魚養(yǎng)殖專業(yè)合作社，隨機(jī)挑選體質(zhì)健康、規(guī)格均一的4月齡烏鱧幼魚(體長為(23.69±1.36)cm,體質(zhì)量為(113.27±14.05)g)暫養(yǎng)2周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將烏鱧幼魚放在底部放置了濕潤海綿的100 L實(shí)驗(yàn)空桶中進(jìn)行空氣暴露脅迫實(shí)驗(yàn)，每個(gè)桶中放入20尾幼魚。分別在暴露于空氣中0、3、6和24 h時(shí)，將幼魚用MS-222麻醉后采集鰓和鰓上器官樣品，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)(每個(gè)樣品采集3尾魚進(jìn)行混樣)，樣品在液氮中速凍后，放置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 烏鱧globin基因的表達(dá)分析

采用TRIZOL法(Invitrogen，美國)對(duì)以上樣品總RNA進(jìn)行提取，并用NanoDrop 2000核酸定量儀(Thermo Scientific，美國)和瓊脂糖凝膠電泳對(duì)總RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測。質(zhì)檢合格后，用TruSeq Stranded mRNA LTSample Prep Kit試劑盒(Illumina，美國)構(gòu)建cDNA文庫，并通過Agilent 2100生物分析儀(Agilent Technologies，美國)進(jìn)行質(zhì)量檢測。質(zhì)檢合格后，用Illumina HiSeq X Ten平臺(tái)進(jìn)行高通量測序(High-Throughput Sequencing)。

測序得到原始數(shù)據(jù)(Raw data)，然后通過Trimmomatic軟件[28]進(jìn)行質(zhì)控過濾，得到干凈數(shù)據(jù)(Clean data)。通過Hisat2軟件[29]將Clean data比對(duì)到烏鱧參考基因組，利用Samtools軟件[30]對(duì)比對(duì)結(jié)果文件排序去重，使用stringtie軟件[31]計(jì)算基因表達(dá)水平，得到globin基因表達(dá)量的FPKM值，并通過DESeq2 R包(http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html)進(jìn)行差異表達(dá)統(tǒng)計(jì)分析，以P<0.05表示差異顯著。取log10(FPKM+1)，利用pheatmap R包(https://CRAN.R-project.org/package=pheatmap)展示globin基因的表達(dá)量熱圖。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 烏鱧globin基因的鑒定及拷貝數(shù)分析

在烏鱧中共鑒定獲得18條globin基因序列，分別是hbaa、hba1、hbad、hbb1、hbb2.1、hbb2.2、hbb2.3、hbb2.4、hbba、hbbc、hbae1.1、hbae1.2、hbae1.3、hbae1.4、mb、cygb、cygb1和ngb(見表1)。各globin序列的ORF長度在372～687個(gè)核苷酸之間，編碼含有123～228個(gè)氨基酸的蛋白，它們的預(yù)測分子量在13.96～26.05 kDa之間。此外，其等電點(diǎn)和登錄號(hào)也在表1中列出。

表1 烏鱧globin基因家族成員的序列特征

對(duì)globin基因在人、小鼠、雞、斑馬魚、斑點(diǎn)叉尾鮰(IetalurusPunetaus)及具有空氣呼吸能力的攀鱸、黃鱔(Monopterusalbus)和烏鱧共8種脊椎動(dòng)物中的拷貝數(shù)進(jìn)行了總結(jié)(見表2)。結(jié)果顯示，相對(duì)于人、鼠、雞等高等脊椎動(dòng)物，globin基因家族在硬骨魚類中發(fā)生顯著擴(kuò)增。其中，烏鱧中鑒定出18個(gè)拷貝，與黃鱔、斑點(diǎn)叉尾鮰比較接近，而攀鱸中具有最多的拷貝數(shù)，共23個(gè)globin基因。在globin基因家族的各亞家族中，Hb亞家族的基因種類和拷貝數(shù)是最多的，在烏鱧和其他硬骨魚類中有14～20個(gè)，可達(dá)人、鼠、雞等高等脊椎動(dòng)物的1.5～2倍。在硬骨魚類的Hb亞家族中主要包括hba、hbb和hbae基因成員，其拷貝數(shù)分別有3～4個(gè)、5～8個(gè)和3～8個(gè)，而不存在hbd、hbe、hbg、hbm、hbq和hbz。Cybg、Ngb和Mb亞家族基因在各物種中都有分布，且僅有1～2個(gè)拷貝。除部分硬骨魚類中存在GbX以及雞中存在GbE外，大多數(shù)物種中GbX、GbE和GbY亞家族基因都是缺失的(見表2)。

表2 幾種典型脊椎動(dòng)物中g(shù)lobin基因的拷貝數(shù)

2.2 globin基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

選取人、鼠、雞、斑馬魚、攀鱸以及烏鱧的全部globin基因的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。由于gbx、gbe和gby在大部分物種中是缺失的，添加斑點(diǎn)雀鱔(Lepisosteusoculatus)、弓鰭魚(Amiacalva)、斑胸草雀(Taeniopygiaguttata)、納氏鱘(Acipensernaccarii)、熱帶爪蟾等物種的gbx、gbe和gby的氨基酸序列以保證進(jìn)化樹的完整性。如圖1所示，根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系globin基因共分為8組，分別為Hbα、Hbβ、Cygb、Mb、Ngb、GbY、GbE和GbX。各組中硬骨魚類的同類基因聚為一枝，其他高等脊椎動(dòng)物聚為另一枝。烏鱧的各globin基因與硬骨魚類聚為一枝，且最先與親緣關(guān)系最近的攀鱸聚在一起(見圖1)。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明globin基因在進(jìn)化上較為保守，該結(jié)果為烏鱧globin基因注釋提供了依據(jù)。

(分支節(jié)點(diǎn)上的數(shù)字表示bootstrapping值，黑色箭頭表示烏鱧的globin基因，不同顏色圓環(huán)表示globin基因不同的亞家族。Numbers on node denote the bootstrapping values, black arrows denote globin genes of northern snakehead, and different colored rings denote different subfamilies of globin genes.)

2.3 烏鱧globin基因結(jié)構(gòu)分析

圖2展示了烏鱧globin基因的氨基酸序列的結(jié)構(gòu)域和motif。利用CDD數(shù)據(jù)庫預(yù)測得到4種類型的保守結(jié)構(gòu)域，包括血紅蛋白α鏈的Hb-α-like結(jié)構(gòu)域，血紅蛋白β鏈的Hb-β-like結(jié)構(gòu)域，細(xì)胞珠蛋白的Cygb結(jié)構(gòu)域和其他珠蛋白具有的Globin-like超家族結(jié)構(gòu)域。此外，通過MEME數(shù)據(jù)庫預(yù)測得到5個(gè)motif。Hbα鏈具有motif 1、2、3和4；Hbβ鏈具有motif 1、2、3、4和5，其中hbbc只有motif 1和3。其他亞家族差異較大，cygb和cygb1缺少motif 5，mb只含有motif 1和2，而ngb只含有motif 3和4(見圖2)。

圖2 烏鱧globin基因結(jié)構(gòu)可視化分析

2.4 烏鱧globin基因共線性分析

通過Circos對(duì)烏鱧基因組的共線性區(qū)塊、基因密度和globin基因在染色體上的位置進(jìn)行展示。如圖3所示，烏鱧的globin基因分布于Chr3、Chr17、Chr18和Chr20四條染色體上。Chr17上包含12個(gè)globin基因，是所有染色體中最多的，其中包括11個(gè)Hb亞家族基因和1個(gè)Cygb亞家族基因。Chr3上有1個(gè)Mb亞家族基因和1個(gè)Cygb亞家族基因，Chr18上有1個(gè)Ngb亞家族基因，Chr20上有3個(gè)Hb亞家族基因。此外還發(fā)現(xiàn)Chr17上的hbb2和hbae1均存在4個(gè)拷貝，在染色體上交替排列，形成串聯(lián)重復(fù)事件。

(灰線表示烏鱧基因組的共線性區(qū)塊，藍(lán)色方塊表示烏鱧染色體，外環(huán)表示基因密度。The gray line denotes the genome collinearity block of northern snakehead, the blue square denotes the chromosome of northern snakehead, and the outer ring denotes the gene density.)

對(duì)攀鱸、斑馬魚和烏鱧進(jìn)行物種間共線性分析，共得到12個(gè)攀鱸和烏鱧globin基因有直系同源關(guān)系的共線性區(qū)塊，以及10個(gè)斑馬魚和烏鱧globin基因的共線性區(qū)塊，分別位于攀鱸的Chr1、Chr8、Chr12和Chr19，斑馬魚的Chr3、Chr12和Chr17，以及烏鱧的Chr3、Chr17、Chr18和Chr20染色體上(見圖4)。

(灰線表示物種間的共線性區(qū)塊，黑線表示烏鱧globin基因的共線性區(qū)塊，不同顏色方塊表示不同物種的染色體。The gray line denotes the collinearity block between species, the black line denotes the collinearity block of northern snakehead globin genes, and different colored ring squares denote the chromosomes of different species.)

2.5 烏鱧globin基因在鰓上器官發(fā)育和空氣暴露脅迫中的表達(dá)分析

對(duì)烏鱧鰓上器官發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)、烏鱧空氣暴露脅迫中鰓和鰓上器官的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，將globin基因的表達(dá)量用聚類熱圖進(jìn)行展示(見圖5)。

在仔稚魚鰓上器官發(fā)育過程中，hbba和hbbc幾乎檢測不到表達(dá)(FPKM<1)，其他基因表達(dá)水平差異較大，其中hba1、hbb1在鰓上器官不同發(fā)育時(shí)期均具有相對(duì)較高的表達(dá)水平(FPKM>1000)。hba1、hbb1、hbae1(包括hbae1.1、hbae1.2和hbae1.3)、hbb2(包括hbb2.1、hbb2.2和hbb2.4)和hbaa的表達(dá)量與其在鰓上器官發(fā)育早期階段(受精后3 d)的表達(dá)量相比發(fā)生顯著變化(P<0.05)。其中hbae1.1、hbb2.1和hbb2.2的表達(dá)量在發(fā)育中期階段(受精后5 d)和發(fā)育后期階段(受精后8 d)持續(xù)顯著升高(受精后5 d的表達(dá)量分別為受精后3 d的5.14、4.36和3.87倍，受精后8 d的表達(dá)量分別為受精后3 d的26.03、23.83和23.63倍)，而hbae1.2、hbae1.3、hbb2.4和hbaa的表達(dá)量在受精后8 d顯著升高(表達(dá)量分別為受精后3 d的22.27、13.75、27.19和15.42倍)。此外，hba1和hbb1的表達(dá)量在受精后5 d顯著降低(表達(dá)量分別為受精后3 d的0.42和0.41倍)。

在幼魚的鰓和鰓上器官中，hbba相對(duì)其他globin基因具有較高的表達(dá)水平(FPKM>1 000)，而hbae1.4、hbb2.4和ngb幾乎檢測不到表達(dá)(FPKM<1)。空氣暴露脅迫后，hbae1(包括hbae1.1、hbae1.2和hbae1.3)、hbb2(包括hbb2.1和hbb2.2)、cygb和hbba的表達(dá)量發(fā)生顯著變化(P<0.05)。其中在幼魚鰓中，hbae1.1、hbb2.2、cygb和hbba的表達(dá)量在24 h顯著升高(表達(dá)量為0 h的11.00、1.49、1.85和1.99倍)，而hbae1.2的表達(dá)量在3 h顯著降低(表達(dá)量為0 h的0.46倍)。在幼魚鰓上器官中，hbae1.3和cygb的表達(dá)量在24 h顯著升高(表達(dá)量為0 h的1.53和1.58倍)，而hbb2.2和hbb2.1的表達(dá)量分別在3與6 h呈現(xiàn)顯著降低的趨勢(表達(dá)量為0 h的0.56和0.66倍)(見圖5)。

(熱圖顏色表示表達(dá)量的高低，G表示鰓，S表示鰓上器官，表示顯著差異(P<0.05)。Heatmap color denotes the level of expression, G denotes the gill, S denotes the suprabranchial organ, denotes ted the significant differences(P<0.05).)

3 討論

Globin是一類小呼吸蛋白，能夠通過血紅素基團(tuán)可逆地結(jié)合氧氣，在脊椎動(dòng)物中起到運(yùn)輸和儲(chǔ)存氧氣并進(jìn)行氧化能量代謝的作用[32]。目前，globin基因家族已在高等脊椎動(dòng)物中得到深入研究，但是在多數(shù)經(jīng)濟(jì)魚類中尚未得到系統(tǒng)的研究。

魚類的globin基因數(shù)量是脊椎動(dòng)物中最多的，這有利于魚類適應(yīng)比陸生動(dòng)物更為劇烈的環(huán)境和氧含量變化[33]。本研究中烏鱧的globin基因數(shù)量與其他硬骨魚類相近，且相較于其他高等脊椎動(dòng)物出現(xiàn)顯著擴(kuò)增。這種擴(kuò)增現(xiàn)象可能是硬骨魚類特有的第三次全基因組復(fù)制事件(WGD)，即魚類特異性基因組復(fù)制(FSGD)所導(dǎo)致的[34]。有學(xué)者認(rèn)為，這種多重基因重復(fù)事件(Multiple gene duplication events)造成了globin基因家族復(fù)雜的進(jìn)化過程[3]。串聯(lián)復(fù)制是一種最常見的基因家族擴(kuò)增機(jī)制[35]。在烏鱧的globin基因中，hbb2和hbae1基因均存在4個(gè)序列相似的拷貝，在Chr17上形成串聯(lián)重復(fù)。同時(shí)，globin基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析和共線性分析表明，globin基因在進(jìn)化上較為保守，烏鱧的globin基因與其他硬骨魚類的globin基因具有較高的同源性。

與大多數(shù)脊椎動(dòng)物相同，烏鱧的globin基因家族中具有Hb、Mb、Ngb和Cygb亞家族成員，而不存在GbE、GbY和GbX亞家族。通過對(duì)烏鱧globin基因的序列和結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Hb亞家族成員在ORF長度、氨基酸數(shù)目、motif和結(jié)構(gòu)域等方面保守性較高，而與其他亞家族成員的差異較大。表明在進(jìn)化過程中不同亞家族間發(fā)生了功能分化，而亞家族內(nèi)各成員功能較為保守。Hb是存在于紅細(xì)胞中的呼吸蛋白，Hb起到結(jié)合氧氣并提供能量的重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，魚類可以通過Hb結(jié)構(gòu)改變和基因拷貝數(shù)的增加來適應(yīng)水中的低氧環(huán)境[36]。在烏鱧中，存在14個(gè)hb基因拷貝，包括hba、hbb、hbae、hbbc等不同類型，說明烏鱧的Hb結(jié)構(gòu)與其他脊椎動(dòng)物相似，是由2條Hbα鏈和2條Hbβ鏈組成的四聚體結(jié)構(gòu)。此外，鑒定發(fā)現(xiàn)了一種血紅蛋白β亞基陰極組件(Emoglobin cathodic subunit beta)基因(hbbc)，該基因也存在于黃鱔、攀鱸和斑點(diǎn)雀鱔等其他可以進(jìn)行空氣呼吸的硬骨魚類中。血紅蛋白陰極組件與其他血紅蛋白組分相比，具有更高的氧氣結(jié)合能力[37]。據(jù)報(bào)道，翼甲鯰屬(Pterygoplichthys)物種在缺氧的情況下，可以通過血紅蛋白陰極組件所具有的較高氧氣結(jié)合與運(yùn)輸能力，維持機(jī)體正常生命活動(dòng)[38]。Mb和Ngb亞家族基因在大部分脊椎動(dòng)物中只存在一個(gè)拷貝，具有較高的保守性。在具有空氣呼吸能力的非洲肺魚(Protopterusannectens)和蟾胡子鯰中，分別具有7和15個(gè)mb拷貝[23,39]，這可能是它們適應(yīng)低氧環(huán)境的關(guān)鍵策略。在金魚(Carassiusauratus)中ngb的表達(dá)水平與耐低氧的能力呈正相關(guān)[40]。但在烏鱧中，Mb和Ngb均只有一個(gè)拷貝，且在鰓和鰓上器官中的表達(dá)水平無顯著差異。此外據(jù)報(bào)道，由于第三次全基因組復(fù)制事件，硬骨魚類具有2個(gè)cygb拷貝[41]。在烏鱧中也同樣發(fā)現(xiàn)了2個(gè)cygb基因。

研究表明，在硬骨魚類個(gè)體發(fā)育的不同階段hb基因的表達(dá)會(huì)發(fā)生變化，這種現(xiàn)象稱為血紅蛋白的轉(zhuǎn)換表達(dá)(Hemoglobin switching)[42]。根據(jù)仔稚魚鰓上器官發(fā)育和幼魚空氣暴露脅迫轉(zhuǎn)錄組中g(shù)lobin基因表達(dá)的聚類熱圖，可以發(fā)現(xiàn)仔稚魚和幼魚中g(shù)lobin基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)模式也存在明顯差異。對(duì)仔稚魚鰓上器官發(fā)育中g(shù)lobin基因的表達(dá)分析表明，hba1、hbb1在不同發(fā)育時(shí)期的鰓上器官中均有較高的表達(dá)量，而hbae1、hbb2和hbaa等基因的表達(dá)量在發(fā)育中期和后期顯著升高，可能在鰓上器官的生成過程中發(fā)揮著重要作用。hbae基因是硬骨魚類globin基因家族中特有的一類調(diào)控胚胎期血紅蛋白生成的基因，有研究對(duì)斑馬魚中hbae1.1進(jìn)行敲除，發(fā)現(xiàn)缺失該基因會(huì)導(dǎo)致Hb含量明顯下降[43]。在烏鱧中共發(fā)現(xiàn)4個(gè)hbae1基因的拷貝，其表達(dá)量在仔稚魚中高于幼魚，并在仔稚魚的鰓上器官發(fā)育中期和后期呈逐漸升高的趨勢，說明hbae1對(duì)鰓上器官中Hb的生成具有重要影響。此外，研究發(fā)現(xiàn)hbae1和hbb2基因成員在鰓上器官發(fā)育中具有相似的表達(dá)模式，推測是由于兩者以頭對(duì)頭(3′-5′—5′-3′)的方式串聯(lián)，共享啟動(dòng)子與增強(qiáng)子，存在協(xié)同表達(dá)機(jī)制[44]。對(duì)幼魚鰓和鰓上器官的空氣暴露脅迫中g(shù)lobin基因的表達(dá)分析表明，hbae1、hbb2、cygb和hbba等基因的表達(dá)量在暴露于空氣24 h時(shí)顯著升高，說明進(jìn)行較長時(shí)間的空氣呼吸可能導(dǎo)致烏鱧的鰓和鰓上器官中g(shù)lobin基因的表達(dá)水平升高。對(duì)各globin基因功能進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，cygb可能在鰓和鰓上器官的結(jié)締組織形成中發(fā)揮著重要作用，而hbae1、hbb2和hbba等基因則可能與鰓和鰓上器官中Hb的生成有關(guān)。

4 結(jié)語

本研究對(duì)烏鱧的globin基因家族進(jìn)行了鑒定，并對(duì)其進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析、基因結(jié)構(gòu)分析和表達(dá)分析等相關(guān)研究。研究表明，烏鱧共有18個(gè)globin基因，分屬于Hb、Mb、Ngb和Cygb四個(gè)亞家族，且在進(jìn)化上較為保守。相較于高等脊椎動(dòng)物，烏鱧的globin基因數(shù)量出現(xiàn)顯著擴(kuò)增。轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，在仔稚魚中，hbae1(包括hbae1.1、hbae1.2和hbae1.3)、hbb2(包括hbb2.1、hbb2.2和hbb2.4)和hbaa的表達(dá)量在鰓上器官發(fā)育過程中呈顯著升高的趨勢，而hba1和hbb1的表達(dá)量則在發(fā)育中期顯著降低。在幼魚中,hbae1(包括hbae1.1、hbae1.2和hbae1.3)、hbb2(包括hbb2.1和hbb2.2)、cygb和hbba的表達(dá)量在空氣暴露脅迫后不同時(shí)間點(diǎn)的鰓和鰓上器官中發(fā)生顯著變化。這些globin基因可能在烏鱧空氣呼吸及低氧脅迫中發(fā)揮潛在的生物學(xué)功能。本研究為進(jìn)一步探究globin基因在烏鱧耐低氧和空氣呼吸中的功能機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。