氨氮急性脅迫對(duì)斑石鯛幼魚行為模式和血液學(xué)參數(shù)的影響?

張盛坤，徐進(jìn)虎，孫雪倩，劉怡君，李 麗，2，李文升，龐尊方，田相利，2??

(1.海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)海洋大學(xué))，山東 青島 266003；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237；3.萊州明波水產(chǎn)有限公司，山東 煙臺(tái) 261442)

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，氨氮是蛋白質(zhì)分解代謝的主要產(chǎn)物，占魚類釋放的含氮廢物的50%以上[1]。氨氮積累是集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖的主要問題之一。由于蛋白質(zhì)飼料的大量投喂或水體的更新頻率較低，氨氮可能會(huì)在水體中積累達(dá)到極高濃度[2]。水體中氨氮的積累會(huì)對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物產(chǎn)生多種脅迫，導(dǎo)致魚類神經(jīng)元功能和大腦活動(dòng)的改變，機(jī)體缺氧、厭食、生長(zhǎng)遲緩、能量代謝紊亂、離子平衡破壞、抗病力減弱，以及鰓上皮組織病變[3]。

水生動(dòng)物行為模式往往是生理和生態(tài)因素相互作用的綜合反映，是評(píng)估污染物對(duì)魚類和其他水生動(dòng)物種群影響的優(yōu)良重要之一[4]。環(huán)境污染物脅迫可影響獵物-捕食者的相互作用、求偶和其他重要行為，導(dǎo)致個(gè)體或種群在遠(yuǎn)低于產(chǎn)生形態(tài)或生理變化的毒物水平下發(fā)生破壞/混亂[5]。魚類行為的改變也可以作為識(shí)別突發(fā)環(huán)境污染的一項(xiàng)敏感指標(biāo)[6]。了解自然和非自然狀態(tài)下魚類的特定行為模式，對(duì)于水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)激管理非常重要[7]。血液學(xué)參數(shù)是各種環(huán)境壓力下魚類健康狀況的重要指標(biāo)[8-9]。由于血液在營(yíng)養(yǎng)、氧氣和代謝廢物的運(yùn)輸中起著重要作用，血液學(xué)參數(shù)可提供魚類健康狀況的關(guān)鍵信息[10]。在環(huán)境污染物脅迫下的魚類的行為和生理受多種因素的影響，開展不同環(huán)境污染物脅迫下魚類行為模式和血液學(xué)研究有著重要的價(jià)值。

斑石鯛(Oplegnathuspunctatus)隸屬石鯛科(Oplegnathidae)石鯛屬(Oplegnathus)，體表呈黑褐色，具有不規(guī)則黑斑，主要分布于太平洋東北部的中國(guó)、朝鮮、日本等溫?zé)釒Ы吨邢聦雍Ｓ?，常見其棲息于近岸珊瑚礁或巖礁叢中[11]。斑石鯛肉質(zhì)細(xì)膩，營(yíng)養(yǎng)豐富，具有較高的食用價(jià)值和觀賞價(jià)值，是新興的名貴水產(chǎn)品種。目前山東、福建、廣東、海南等沿海地區(qū)已經(jīng)初步形成一定的斑石鯛養(yǎng)殖規(guī)模。對(duì)于斑石鯛的研究目前主要集中在基礎(chǔ)生物學(xué)、生態(tài)學(xué)、苗種培育及病害防控等方面[12-15]，在斑石鯛?wèi)?yīng)對(duì)環(huán)境脅迫方面的研究尚不多見?；诖耍疚难芯苛税钡{迫對(duì)斑石鯛行為模式和血液學(xué)參數(shù)的影響，以期為斑石鯛養(yǎng)殖管理及健康養(yǎng)殖技術(shù)的提高提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究所用的斑石鯛幼魚購(gòu)自煙臺(tái)萊州明波水產(chǎn)有限公司，斑石鯛幼魚平均體長(zhǎng)為(11.71±0.37)cm，平均體質(zhì)量為(42.87±3.87)g，養(yǎng)殖用水為經(jīng)過濾、消毒處理后的自然海水。實(shí)驗(yàn)前，斑石鯛幼魚在實(shí)驗(yàn)室條件下先暫養(yǎng)10 d。暫養(yǎng)期間，光照周期為12 h光照∶12 h黑暗，水溫控制在22～24 ℃，鹽度在30～31，溶氧水平為7.2～7.4 mg/L。每天9：00和18:00各投喂一次，投喂量為實(shí)驗(yàn)魚體質(zhì)量的1.5%，投喂后1 h清理殘餌糞便，每天換水一次，換水量為總水量50%左右。暫養(yǎng)結(jié)束后挑選質(zhì)量、大小相似的健康斑石鯛幼魚用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

正式實(shí)驗(yàn)前，對(duì)不同氨氮濃度對(duì)斑石鯛幼魚影響進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn)，測(cè)得24 h-LC50為18.57 mg/L。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，本研究設(shè)置了3個(gè)氨氮脅迫組，即6、12和18 mg/L，以氨氮濃度0 mg/L作為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)期間各處理組氨氮濃度基本保持穩(wěn)定(見表1)。每個(gè)處理組分別設(shè)置三個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)放入8尾規(guī)格相似的斑石鯛幼魚。實(shí)驗(yàn)前停食24 h，實(shí)驗(yàn)期間不喂食，光照、水溫、鹽度和溶氧等條件同暫養(yǎng)期。脅迫實(shí)驗(yàn)開始前，先分別對(duì)各處理組的斑石鯛幼魚行為拍攝1 h，作為氨氮脅迫前斑石鯛幼魚行為的初始狀態(tài)，之后對(duì)斑石鯛幼魚進(jìn)行8 h的氨氮脅迫。脅迫期間，利用攝像機(jī)對(duì)每個(gè)重復(fù)進(jìn)行持續(xù)拍攝。最后將拍攝得到的視頻分割成每個(gè)時(shí)長(zhǎng)為10 min、分辨率為800像素×800像素的視頻片段，再利用idtracker.ai[16]軟件對(duì)這些視頻片段進(jìn)行數(shù)據(jù)化處理，得到魚體中心點(diǎn)像素坐標(biāo)。經(jīng)過計(jì)算后，分別得到平均游泳速度、運(yùn)動(dòng)時(shí)間百分比、平均角速度、平均曲率、個(gè)體間距離和離散度6個(gè)行為參數(shù)。拍攝結(jié)束后，從每個(gè)玻璃魚缸隨機(jī)抽選3尾魚，用MS-222麻醉后進(jìn)行靜脈抽血，測(cè)定血常規(guī)參數(shù)和血清生化指標(biāo)。

表1 實(shí)驗(yàn)前后各處理組水體中氨氮濃度變化

1.3 實(shí)驗(yàn)裝置

本研究所用實(shí)驗(yàn)裝置由養(yǎng)殖裝置和錄像裝置兩部分組成。其中，養(yǎng)殖裝置為一個(gè)75 cm×60 cm×45 cm的玻璃水族箱，被過濾棉和分隔板縫合而成的隔離板分隔成60 cm×60 cm和15 cm×60 cm兩部分，前者為拍攝區(qū)，后者為增氧區(qū)。隔離板可起到阻隔氣泡的作用，可防止增氧區(qū)產(chǎn)生的氣泡對(duì)拍攝產(chǎn)生影響。在養(yǎng)殖區(qū)外壁貼有白色不透明玻璃膜，以防止外界環(huán)境對(duì)斑石鯛幼魚的可能視覺刺激。錄像設(shè)備分為攝像頭和錄像機(jī)兩部分，攝像頭固定在養(yǎng)殖區(qū)的正上方，正對(duì)水面拍攝，拍攝視頻幀率為25幀/s。實(shí)驗(yàn)裝置具體如圖1所示。

(A.拍攝區(qū)；B.增氧區(qū)；C.錄像機(jī)；D.攝像頭。A.Shooting area; B.Oxygenation zone; C.Video recorder; D.Camera.)

1.4 測(cè)定方法及主要參數(shù)

1.4.1 行為參數(shù)的測(cè)定 將拍攝后剪輯的視頻片段導(dǎo)入視頻分析軟件idtracker.ai中，根據(jù)斑石鯛幼魚的運(yùn)動(dòng)軌跡，輸出斑石鯛幼魚在每一幀圖像中的像素坐標(biāo)，再將該坐標(biāo)單位轉(zhuǎn)換成厘米后，利用相關(guān)公式進(jìn)行計(jì)算，可得到魚體平均游泳速度、運(yùn)動(dòng)時(shí)間百分比、平均角速度、平均曲率、個(gè)體間距離和離散度等主要行為參數(shù)。主要計(jì)算公式如下：

(1)平均游泳速度VS(cm/s)：

(1)

平均游泳速度表示魚群在一定時(shí)間內(nèi)的活躍程度[17]。式中：Δx(t)為坐標(biāo)x臨近點(diǎn)間的差異；Δy(t)為坐標(biāo)y臨近點(diǎn)間的差異；dt為兩個(gè)坐標(biāo)點(diǎn)的時(shí)間間隔。

(2)運(yùn)動(dòng)時(shí)間百分比PM(%)：

(2)

運(yùn)動(dòng)時(shí)間百分比反映魚類的活躍程度[18]，計(jì)算時(shí)將單尾魚的游泳速度大于等于1 cm/s時(shí)設(shè)定為運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，游泳速度小于1 cm/s則定義為靜止?fàn)顟B(tài)[19]。式中：T1表示魚類進(jìn)行游泳運(yùn)動(dòng)(游泳速度超過1 cm/s)的總時(shí)間，T2表示實(shí)驗(yàn)觀察時(shí)間(每個(gè)視頻片段的時(shí)長(zhǎng)，即600 s)[20]。

(3)平均角速度VA((°)/s):

(3)

平均角速度反映魚類改變運(yùn)動(dòng)方向的頻率[19]。式中，Δx(t)為坐標(biāo)x臨近點(diǎn)間的差異，Δy(t)為坐標(biāo)y臨近點(diǎn)間的差異，25為每秒的幀數(shù)。

(4)平均曲率M((°)/m):

(4)

平均曲率表示游泳軌跡的彎曲程度，平均曲率越大表示運(yùn)動(dòng)的不規(guī)則性越高[19]。式中，Δx(t)為坐標(biāo)x臨近點(diǎn)間的差異，Δy(t)為坐標(biāo)y臨近點(diǎn)間的差異。

(5)個(gè)體間距離DI(cm)：

(5)

個(gè)體間距離表示魚群中個(gè)體之間的平均距離(cm)，用于評(píng)價(jià)群體凝聚力[21]。該數(shù)值越小，魚群的群體凝聚力越強(qiáng)。式中，xi和xj為魚群中第i、j條魚在t時(shí)刻的橫坐標(biāo)值，yi和yj為魚群中第i、j條魚在t時(shí)刻的縱坐標(biāo)值，n=8。

(6)離散度SL(cm)：

SL=

(6)

1.4.2 血液生理生化參數(shù)的測(cè)定 本研究測(cè)定的斑石鯛幼魚的主要血液學(xué)參數(shù)包括血常規(guī)參數(shù)和血清生化指標(biāo)。其中，血常規(guī)參數(shù)包括白細(xì)胞數(shù)量、血紅蛋白含量、紅細(xì)胞數(shù)量、紅細(xì)胞壓積，利用BC-1800 blood biochemical analyzer(Mindray，Delhi，India)全自動(dòng)血液分析儀進(jìn)行分析測(cè)定；血清生化指標(biāo)包括葡萄糖、甘油三脂、總膽固醇、總蛋白、白蛋白、尿酸、乳酸脫氫酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶，使用CABAS C-311全自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行分析測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用IBM SPSS Statistics 25.0數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。對(duì)數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差齊性進(jìn)行檢驗(yàn)后，利用單因素方差分析(ANOVA)和Duncan’s多重比較對(duì)數(shù)據(jù)間差異顯著性進(jìn)行分析，并以P<0.05代表差異顯著。同時(shí)，利用Spearson相關(guān)分析對(duì)實(shí)驗(yàn)期間斑石鯛幼魚各行為參數(shù)的變化之間的相關(guān)性及脅迫8 h 后各行為參數(shù)和血液學(xué)參數(shù)之間的相關(guān)性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 氨氮脅迫下斑石鯛幼魚行為參數(shù)

實(shí)驗(yàn)期間不同氨氮濃度下斑石鯛幼魚游泳速度的變化情況如圖2所示?？梢钥闯?，對(duì)照組斑石鯛幼魚平均游泳速度總體上比較穩(wěn)定；6 mg/L組斑石鯛幼魚的平均游泳速度呈隨時(shí)間高低波動(dòng)的狀態(tài)，在8 h時(shí)與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)；12 mg/L組斑石鯛幼魚平均游泳呈先上升后下降的趨勢(shì)，在3 h達(dá)到最高，之后持續(xù)下降，8 h時(shí)顯著低于對(duì)照組和6 mg/L組(P<0.05)；18 mg/L組斑石鯛幼魚平均游泳速度在0～1 h保持穩(wěn)定，之后持續(xù)下降，然后保持在較低水平，在8 h時(shí)與12 mg/L處理組無顯著差異(P>0.05)，但顯著低于對(duì)照組和6 mg/L處理組(P<0.05，見圖2A)。在整個(gè)脅迫期間，斑石鯛幼魚平均游泳速度隨氨氮濃度的升高而顯著下降(P<0.05，見圖2B)。

不同氨氮濃度下斑石鯛幼魚運(yùn)動(dòng)時(shí)間百分比隨時(shí)間的變化如圖3所示。可以看出，對(duì)照組斑石鯛幼魚的運(yùn)動(dòng)時(shí)間百分比除在氨氮脅迫6 h時(shí)出現(xiàn)明顯降低，其余時(shí)間基本保持穩(wěn)定；6 mg/L脅迫組在1 h時(shí)顯著降低，之后保持相對(duì)穩(wěn)定，但總體上一直低于對(duì)照組；12 mg/L組在0～4 h之間持續(xù)下降，在4～7 h之間保持相對(duì)穩(wěn)定，在7～8 h之間略有增加，但在2～8 h期間均顯著低于其他處理組(P<0.05)；18 mg/L組在0～1 h之間迅速降低，在1～3 h之間則顯著增加，在3～8 h保持相對(duì)穩(wěn)定并與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05，見圖3A)。在整個(gè)脅迫期間，6和12 mg/L組斑石鯛幼魚運(yùn)動(dòng)時(shí)間百分比均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，其中12 mg/L組最低，18 mg/L組與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05，見圖3B)。

(A.不同氨氮濃度下斑石鯛幼魚運(yùn)動(dòng)時(shí)間百分比隨時(shí)間的變化；B.整個(gè)脅迫期間斑石鯛幼魚的平均運(yùn)動(dòng)時(shí)間百分比。A.Changes of the percentage time on moving of juvenile spotted knifejaw with time under different ammonia nitrogen concentrations; B.The percentage time on moving of juvenile spotted knifejaw during the whole stress period.)

不同氨氮濃度下斑石鯛幼魚平均角速度變化見圖4。各處理組平均角速度均隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而呈現(xiàn)出小幅波動(dòng)，但基本都維持在3～5(°)/s之間(見圖4A)。在整個(gè)脅迫期間各處理組無顯著差異(P<0.05，見圖4B)。

(A.不同氨氮濃度下斑石鯛幼魚平均角速度隨時(shí)間的變化；B.整個(gè)脅迫期間斑石鯛幼魚的總平均角速度。A.Changes of average angular velocity of juvenile spotted knifejaw with time under different ammonia nitrogen concentrations; B.Average angular velocity of juvenile spotted knifejaw during the whole stress period.)

不同氨氮濃度下斑石鯛幼魚平均曲率的變化如圖5所示。可以看出，對(duì)照組和6 mg/L組斑石鯛幼魚平均曲率一直維持在較低水平；12 mg/L組在0～5 h之間保持相對(duì)穩(wěn)定，在6 h時(shí)迅速增加，顯著高于其他處理組(P<0.05)，7和8 h雖有所下降，但仍顯著高于其他處理組(P<0.05)；18 mg/L組總體上呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在4 h時(shí)達(dá)到最高，顯著高于其他處理組(P<0.05)，在4～8 h之間持續(xù)降低，但在8 h時(shí)仍顯著高于對(duì)照組和6 mg/L組(P<0.05，見圖5A)。在整個(gè)脅迫期間，6 mg/L組和對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)，而12和18 mg/L組斑石鯛幼魚平均曲率則顯著高于對(duì)照組(P<0.05，見圖5B)。

(A.不同氨氮濃度下斑石鯛幼魚平均曲率隨時(shí)間的變化；B.整個(gè)脅迫期間斑石鯛幼魚的總平均曲率。A.Changes of average meandering of juvenile spotted knifejaw with time under different ammonia nitrogen concentrations; B.Average meandering of juvenile spotted knifejaw during the whole stress period.)

不同氨氮濃度下斑石鯛幼魚個(gè)體間距離的變化如圖6所示。對(duì)照組斑石鯛幼魚個(gè)體間距離保持相對(duì)穩(wěn)定；6 mg/L組在0～1 h之間迅速降低，在1～4 h之間保持相對(duì)穩(wěn)定，在4～8 h之間則持續(xù)增加，到8 h時(shí)個(gè)體間距離與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)；12 mg/L組在1～2 h之間增加，之后維持相對(duì)穩(wěn)定，并在2～8 h之間期間總體上高于其他處理組；18 mg/L組在0～1 h之間顯著降低，在1～4 h顯著增加，在4～8 h之間則保持相對(duì)穩(wěn)定并與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05，見圖6A)。在整個(gè)脅迫期間，6 mg/L組斑石鯛幼魚個(gè)體間距離顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，12 mg/L組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而18 mg/L組與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05，見圖6B)。

(A.不同氨氮濃度下斑石鯛幼魚個(gè)體間距離隨時(shí)間的變化；B.整個(gè)脅迫期間斑石鯛幼魚的平均個(gè)體間距離。A.Changes of inter-individual distance of juvenile spotted knifejaw with time under different ammonia nitrogen concentrations; B.Inter-individual distance of juvenile spotted knifejaw during the whole stress period.)

不同氨氮濃度下斑石鯛幼魚分布離散度的變化如圖7所示。對(duì)照組斑石鯛幼魚離散度保持相對(duì)穩(wěn)定；6 mg/L組在0～1 h之間迅速降低，在1～4 h之間保持相對(duì)穩(wěn)定，在4～8 h之間則持續(xù)增加，到8 h時(shí)離散度與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)；12 mg/L組在1～2 h之間增加，之后維持相對(duì)穩(wěn)定，并在2～8 h之間期間總體上高于其他處理組；18 mg/L組在0～1 h之間顯著降低，在1～4 h持續(xù)回升，在4～8 h之間則保持相對(duì)穩(wěn)定并與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05，見圖7A)。在整個(gè)脅迫期間，6 mg/L組斑石鯛幼魚離散度顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，12 mg/L組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而18 mg/L 組與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05，見圖7B)。

(A.不同氨氮濃度下斑石鯛幼魚離散度隨時(shí)間的變化；B.整個(gè)脅迫期間斑石鯛幼魚的離散度。A.Changes of dispersion of juvenile spotted knifejaw with time under different ammonia nitrogen concentrations; B.Dispersion of juvenile spotted knifejaw during the whole stress period.)

2.2 氨氮脅迫下斑石鯛幼魚行為參數(shù)之間的相關(guān)性

表2顯示的是不同處理組內(nèi)各行為參數(shù)之間的相關(guān)性分析?？梢钥闯觯瑢?duì)照組與各脅迫組的個(gè)體間距離和離散度均顯著正相關(guān)(P<0.05)。氨氮脅迫組與對(duì)照組在行為參數(shù)的相關(guān)性上存在一些共性差異：對(duì)照組斑石鯛幼魚平均游泳速度與運(yùn)動(dòng)時(shí)間百分比、平均角速度與曲率均呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，而在各脅迫組中，上述指標(biāo)均未見顯著相關(guān)(P>0.05)；對(duì)照組平均游泳速度與平均曲率未見顯著相關(guān)(P>0.05)，而在各脅迫組中，斑石鯛幼魚平均游泳速度與平均曲率均呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。

表2 不同處理組各行為參數(shù)之間的相關(guān)性

各脅迫組斑石鯛幼魚之間在行為參數(shù)的相關(guān)性上也存在差異。其中，6 mg/L組斑石鯛幼魚平均游泳速度與平均角速度呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，運(yùn)動(dòng)時(shí)間百分比與平均角速度也呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)；12 mg/L組斑石鯛幼魚平均游泳速度、運(yùn)動(dòng)時(shí)間百分比和平均曲率均與個(gè)體間距離和離散度呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，運(yùn)動(dòng)時(shí)間百分比與平均角速度則呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)；18 mg/L組平均游泳速度、運(yùn)動(dòng)時(shí)間百分比與個(gè)體間距離呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，平均游泳速度與曲率呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。

2.3 氨氮脅迫對(duì)斑石鯛幼魚血液生理生化參數(shù)的影響

氨氮脅迫對(duì)斑石鯛幼魚血液生理生化參數(shù)的影響見表3?？梢钥闯觯S著氨氮濃度的升高，斑石鯛幼魚血液中白細(xì)胞數(shù)量、血紅蛋白濃度和紅細(xì)胞數(shù)量均經(jīng)歷了下降-上升-下降的過程。其中，6 mg/L組白細(xì)胞數(shù)量、血紅蛋白濃度和紅細(xì)胞數(shù)量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；12 mg/L組白細(xì)胞數(shù)量、血紅蛋白濃度和紅細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)；18 mg/L組白細(xì)胞數(shù)量、血紅蛋白濃度和紅細(xì)胞數(shù)量均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。12 mg/L組紅細(xì)胞壓積顯著高于對(duì)照組，6和18 mg/L組與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)。各脅迫組斑石鯛幼魚血清中的葡萄糖、總膽固醇、白蛋白和總蛋白濃度均與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)。6和12 mg/L組乳酸脫氫酶活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，18 mg/L組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。6和12 mg/L組谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，18 mg/L組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。6和12 mg/L組谷草轉(zhuǎn)氨酶活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，18 mg/L組與對(duì)照組無顯著差異(P>0.05)。血清中甘油三酯、尿酸濃度和堿性磷酸酶活性均呈隨氨氮濃度升高而升高的趨勢(shì)。

表3 氨氮脅迫對(duì)斑石鯛幼魚血液生理生化參數(shù)的影響

2.4 斑石鯛幼魚的行為特征與血液學(xué)參數(shù)的相關(guān)性分析

氨氮脅迫8 h后斑石鯛幼魚行為參數(shù)與血液學(xué)參數(shù)之間的相關(guān)性分析結(jié)果見表4?？梢钥闯?，斑石鯛幼魚平均游泳速度與甘油三酯、尿酸濃度和堿性磷酸酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；運(yùn)動(dòng)時(shí)間百分比與總膽固醇濃度及乳酸脫氫酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；平均曲率與紅細(xì)胞壓積、甘油三酯、尿酸濃度和堿性磷酸酶活性呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；而平均角速度、個(gè)體間距離和離散度與各種血液學(xué)參數(shù)的相關(guān)性均不顯著(P>0.05)?？傊?，平均游泳速度、運(yùn)動(dòng)時(shí)間百分比和平均曲率均與多種血液學(xué)參數(shù)存在顯著相關(guān)關(guān)系。

表4 斑石鯛幼魚行為參數(shù)和血液學(xué)參數(shù)之間的相關(guān)性

3 討論

3.1 氨氮急性脅迫對(duì)斑石鯛幼魚行為模式的影響

魚類行為的改變可以作為識(shí)別突發(fā)環(huán)境污染的敏感指標(biāo)[6]，因此深入了解自然和非自然狀態(tài)下魚類的特定行為模式的差異對(duì)于水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)激管理非常重要[7]。通常，正常狀態(tài)和非正常狀態(tài)下魚類的行為會(huì)存在明顯差異。魚類群體在正常條件下游動(dòng)活躍、分布均勻，各行為參數(shù)的變化不大[17]，但在惡劣環(huán)境條件下，則會(huì)表現(xiàn)出活躍性降低、不穩(wěn)定游動(dòng)增加、底部活動(dòng)時(shí)間長(zhǎng)和凝聚力增強(qiáng)等防御性策略[23]。在本研究中，主要使用游泳速度、運(yùn)動(dòng)時(shí)間百分比、角速度、游泳軌跡曲率、個(gè)體間距離和個(gè)體分布的離散度等行為學(xué)參數(shù)研究了不同氨氮濃度下斑石鯛幼魚行為變化的總體特征。平均游泳速度是魚類行為學(xué)研究中常用的指標(biāo)，運(yùn)動(dòng)時(shí)間百分比反映魚類的活躍程度，平均角速度則反映魚類改變運(yùn)動(dòng)方向的頻率。游泳軌跡的曲率是反映不穩(wěn)定運(yùn)動(dòng)的重要指標(biāo)，指每游動(dòng)1 m的總轉(zhuǎn)彎角度，較高的曲率度意味著較高的“之”字形游泳行為[24]。個(gè)體間距離反映了魚類個(gè)體之間的聚集程度，而離散度則反映了個(gè)體分布的均勻程度。研究表明，環(huán)境污染物脅迫可導(dǎo)致水生動(dòng)物的行為模式發(fā)生明顯改變。例如，氨氮脅迫使虹鱒(Oncorhynchusmykiss)平均游泳速度顯著降低[20]，本研究中斑石鯛幼魚的游泳速度隨氨氮濃度的升高而顯著降低，表明氨氮脅迫導(dǎo)致斑石鯛幼魚的行為活動(dòng)明顯受到抑制。與C60納米顆粒脅迫導(dǎo)致斑馬魚(Daniorerio)的曲率顯著升高相似[24]，本研究也發(fā)現(xiàn)中濃度和高濃度氨氮脅迫(12和18 mg/L)使斑石鯛幼魚的曲率顯著上升，而且從脅迫初期的逃避行為向不活躍狀態(tài)轉(zhuǎn)變的過程中一直伴隨著曲率的增加，表明其運(yùn)動(dòng)軌跡的不規(guī)則性增加[21]。更緊密的集群一般反映出水生動(dòng)物更高的焦慮水平[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，6 mg/L氨氮脅迫下斑石鯛幼魚個(gè)體間距離顯著降低，而12和18 mg/L下魚類個(gè)體間距離則出現(xiàn)不同程度的增加，這表明低濃度的氨氮脅迫增加了斑石鯛幼魚的焦慮水平，而中、高濃度氨氮脅迫反而降低了斑石鯛幼魚的焦慮程度。這種現(xiàn)象在其他研究中也有發(fā)現(xiàn)，例如高濃度苯并芘暴露顯著增加了斑馬魚個(gè)體間距離，而低濃度暴露則沒有出現(xiàn)[5]；在石油中暴露24 h降低了大西洋黃魚(Micropogoniasundultus)的群體凝聚力，使其焦慮行為明顯降低[26]。程淑紅等發(fā)現(xiàn)環(huán)境污染物刺激會(huì)使尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)群體的離散程度增大[22]，本研究也發(fā)現(xiàn)12 mg/L氨氮脅迫下斑石鯛幼魚分布的離散程度會(huì)顯著增加。綜合本研究結(jié)果，氨氮脅迫下斑石鯛幼魚的平均游泳速度、曲率、個(gè)體間距離、離散度這4個(gè)行為參數(shù)的變化比其他參數(shù)更明顯，可作為表征斑石鯛幼魚對(duì)不同濃度氨氮脅迫行為響應(yīng)的關(guān)鍵指標(biāo)。

本研究發(fā)現(xiàn)斑石鯛幼魚在不同的氨氮濃度下行為參數(shù)隨時(shí)間的變化呈現(xiàn)出不同的特征。對(duì)照組斑石鯛幼魚總體上呈現(xiàn)出活躍且散漫的狀態(tài)，游泳速度較高，各行為參數(shù)在實(shí)驗(yàn)期間變化不大；在低濃度氨氮脅迫下，斑石鯛幼魚經(jīng)歷了游泳速度波動(dòng)和集群凝聚力增強(qiáng)到逐漸恢復(fù)的過程，個(gè)體間距離和離散度先降低再恢復(fù)；在中濃度氨氮脅迫下，斑石鯛幼魚在前期表現(xiàn)出明顯的逃避行為，游泳速度保持在較高水平，同時(shí)伴隨著運(yùn)動(dòng)時(shí)間的減少和個(gè)體間距離、離散度的增加，后期則呈現(xiàn)出活躍性降低狀態(tài)，運(yùn)動(dòng)時(shí)間維持在較低水平并伴隨平均游泳速度降低和平均曲率的增加；而在高濃度氨氮脅迫下，斑石鯛幼魚在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間表現(xiàn)出從逃避行為到活躍性降低和游泳軌跡曲率增加，再到行為呆滯、對(duì)反應(yīng)降低的行為變化過程，前期平均游泳速度降低和平均曲率增加，后期平均游泳速度維持在較低水平，平均曲率則逐漸降低?？梢钥闯?，斑石鯛幼魚在低氨氮濃度下可逐步適應(yīng)環(huán)境脅迫，在中濃度脅迫初期表現(xiàn)出快速游泳和四散逃離的逃避行為，經(jīng)過一定時(shí)間的持續(xù)脅迫后，這種行為會(huì)被明顯的不活躍所代替。而在高濃度脅迫下，斑石鯛幼魚初期的活動(dòng)行為便受到抑制，活躍性明顯降低，但在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，除了平均游泳速度顯著降低外，其他各指標(biāo)均反而又趨同于對(duì)照組，這種對(duì)高濃度氨氮毒性刺激下行為反應(yīng)的缺失，可能與高濃度氨氮脅迫下斑石鯛幼魚機(jī)體生理機(jī)能已受到嚴(yán)重破壞、無法有效調(diào)節(jié)有關(guān)。與此相似，在不同濃度氨氮脅迫下的尼羅羅非魚也表現(xiàn)出了類似的行為特征[17]。這一結(jié)果表明，氨氮脅迫對(duì)斑石鯛幼魚行為的影響存在明顯時(shí)間和劑量效應(yīng)，即在低濃度或短時(shí)間氨氮脅迫下，斑石鯛幼魚能通過機(jī)體調(diào)節(jié)逐漸適應(yīng)脅迫環(huán)境，表現(xiàn)出積極的適應(yīng)性行為，但隨著氨氮濃度的增加和脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，氨氮的毒性效應(yīng)逐漸超過魚體的調(diào)節(jié)閾值，導(dǎo)致魚類的行為受到抑制。

為了加深對(duì)不同氨氮脅迫下斑石鯛幼魚行為特征的理解和精準(zhǔn)表征，本研究對(duì)斑石鯛幼魚各行為參數(shù)進(jìn)行了相關(guān)性分析。結(jié)果表明，各脅迫組和對(duì)照組的個(gè)體間距離和離散度均呈顯著正相關(guān)關(guān)系，說明斑石鯛幼魚的集群凝聚力和分布的均勻程度呈現(xiàn)出協(xié)同變化趨勢(shì)。各脅迫組平均游泳速度與平均曲率間均存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，但對(duì)照組上述參數(shù)之間則未見顯著相關(guān)。結(jié)合各脅迫組平均游泳速度和曲率變化情況，可以看出，游泳速度下降和曲率增加可能是斑石鯛幼魚對(duì)氨氮脅迫響應(yīng)的典型行為特征。

3.2 急性氨氮脅迫對(duì)斑石鯛幼魚血液學(xué)參數(shù)的影響

血液學(xué)參數(shù)是用來評(píng)估暴露于環(huán)境污染物中魚類健康狀況的關(guān)鍵指標(biāo)[27]。氨氮脅迫可導(dǎo)致魚類循環(huán)系統(tǒng)中氨的積累。由于氨與血液中的血紅蛋白有很高的親和力，它會(huì)取代氧氣，從而影響某些血液學(xué)特性，導(dǎo)致魚體呈缺氧狀態(tài)[28]。白細(xì)胞是魚類的主要免疫細(xì)胞，能吞噬異物并產(chǎn)生抗體，具有抵抗病原體入侵的作用，其數(shù)量或功能的改變可導(dǎo)致機(jī)體免疫功能的變化[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，6 mg/L氨氮脅迫下斑石鯛幼魚血液中白細(xì)胞數(shù)量、血紅蛋白濃度和紅細(xì)胞數(shù)量均出現(xiàn)不同程度降低，說明即使是低濃度氨氮短時(shí)間脅迫也會(huì)對(duì)斑石鯛幼魚血液指標(biāo)產(chǎn)生明顯影響；而在12 mg/L氨氮脅迫下，斑石鯛幼魚上述血液學(xué)參數(shù)相比6 mg/L氨氮脅迫均出現(xiàn)顯著增加，說明斑石鯛幼魚在中濃度氨氮脅迫下處于應(yīng)激狀態(tài)，機(jī)體通過增強(qiáng)供氧水平和免疫力來增強(qiáng)對(duì)環(huán)境的適應(yīng)力；但在高濃度氨氮脅迫下，斑石鯛幼魚血液中白細(xì)胞數(shù)量、血紅蛋白濃度和紅細(xì)胞數(shù)量均顯著低于其他處理組，這一結(jié)果可能會(huì)導(dǎo)致機(jī)體非特異性免疫力降低和組織缺氧[1]，斑石鯛幼魚在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前表現(xiàn)出的低活躍性特征就可能與組織缺氧有關(guān)。

血糖作為一種直接供能物質(zhì)，可為環(huán)境脅迫下魚體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、提高滲透調(diào)節(jié)和物質(zhì)代謝提供能量保障[30]。本研究中氨氮脅迫下斑石鯛幼魚血糖濃度與對(duì)照組相比未見顯著差異，而甘油三酯濃度則均顯著高于對(duì)照組，這可能與斑石鯛幼魚通過加速脂肪分解來提高機(jī)體能量供給以維持血糖穩(wěn)定和應(yīng)對(duì)氨氮脅迫有關(guān)[31-32]。尿酸是嘌呤代謝的終產(chǎn)物，血清尿酸含量可直接反映機(jī)體蛋白質(zhì)分解代謝水平[33]。在本研究中，斑石鯛幼魚血清尿酸含量隨氨氮濃度的升高而升高，表明為應(yīng)對(duì)氨氮脅迫，斑石鯛幼魚對(duì)能量的需求提高，大量蛋白質(zhì)用于分解代謝。

乳酸脫氫酶活性可反映機(jī)體能量代謝的水平,肌體受損會(huì)導(dǎo)致乳酸脫氫酶活性增高[34-35]。本研究中，18 mg/L氨氮脅迫下斑石鯛幼魚血清中乳酸脫氫酶活性顯著上升，說明高濃度氨氮脅迫導(dǎo)致斑石鯛幼魚表現(xiàn)出了疲勞損傷癥狀[34]。谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶是存在于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和線粒體中的關(guān)鍵酶。當(dāng)肝細(xì)胞膜和線粒體膜受損時(shí)，膜通透性增加，谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶被釋放進(jìn)入血液中[36]。在18 mg/L氨氮脅迫下，斑石鯛幼魚血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶均不同程度高于對(duì)照組，表明高濃度氨氮急性脅迫可能導(dǎo)致斑石鯛幼魚的肝臟功能受到損害。堿性磷酸酶是魚類重要的非特異性免疫標(biāo)志酶之一，主要存在于肝臟、腎臟和血紅細(xì)胞中[37]。高濃度氨氮可造成細(xì)胞損傷，導(dǎo)致血漿中堿性磷酸酶活性在短時(shí)間快速升高[38]。本研究各脅迫組石斑魚幼魚堿性磷酸酶活性均顯著高于對(duì)照組，表明各處理組斑石鯛幼魚均出現(xiàn)了不同程度的細(xì)胞損傷。

魚類行為是機(jī)體各種生理現(xiàn)象在外部表現(xiàn)的綜合結(jié)果[39]。本研究對(duì)氨氮脅迫8 h后斑石鯛幼魚個(gè)體行為參數(shù)和血液學(xué)指標(biāo)進(jìn)行了相關(guān)分析。結(jié)果表明，表征斑石鯛幼魚行為特征的平均游泳速度和平均曲率與總膽固醇、尿酸濃度及堿性磷酸酶活性均顯著相關(guān)，而運(yùn)動(dòng)時(shí)間百分比則與總膽固醇濃度和乳酸脫氫酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性顯著相關(guān)。由此可見，氨氮脅迫下斑石鯛幼魚的行為模式與機(jī)體生理狀態(tài)直接相關(guān)。本研究中，在高濃度氨氮脅迫下，斑石鯛幼魚在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前對(duì)氨氮脅迫缺乏行為反應(yīng)，這種現(xiàn)象可能與魚類機(jī)體生理功能的嚴(yán)重受損有關(guān)。

4 結(jié)語

氨氮脅迫會(huì)導(dǎo)致斑石鯛幼魚行為模式發(fā)生明顯改變，主要表現(xiàn)為平均游泳速度降低和平均曲率升高。同時(shí)氨氮脅迫導(dǎo)致斑石鯛幼魚的血液參數(shù)發(fā)生改變，造成機(jī)體不同程度的生理?yè)p傷。平均游泳速度、運(yùn)動(dòng)時(shí)間百分比和平均曲率與多種血液學(xué)參數(shù)顯著相關(guān),這顯示出斑石鯛幼魚在氨氮脅迫下行為模式變化與其生理狀態(tài)改變直接相關(guān)。