狂犬病病毒核衣殼蛋白的原核表達與鑒定

谷志鵬，向夢玲，凌洪權，駱 璐，吳勝昔，董春霞，冉 皚，郭 宇

(1.重慶理工大學 藥學與生物工程學院， 重慶 400054；2.重慶市動物疫病預防控制中心， 重慶 401120)

0 引言

狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(rabies virus，RV)引起的人獸共患致死性傳染病，發(fā)病后病死率幾乎100%[1]。目前患者尚無有效的治療方法，是世界上傳播最廣、影響和危害最為慘重的烈性疾病，會在發(fā)病3～6 d后出現(xiàn)呼吸功能和循環(huán)功能衰竭而死亡[2-3]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織報告，1986—2020年中，每年約6萬多人死于狂犬病[4]，主要在亞洲和非洲等一些不發(fā)達國家流行，特別是在 20 世紀中葉，狂犬病在世界各地爆發(fā)并造成了許多人死亡[5-6]。近年來，隨著狗、貓以及城市和農(nóng)村地區(qū)飼養(yǎng)寵物的家庭快速增加，野生犬和貓的數(shù)量明顯增多，使狂犬病的發(fā)病率明顯上升，給人類和動物生命安全造成了威脅。

RV 屬彈狀病毒科、狂犬病毒屬，呈典型的子彈狀，表面具有包膜[7]，基因組為大約12 000 bp 的單鏈RNA[8]。編碼5種結構蛋白，依次為核蛋白(nucleoprotein,N)、衣殼蛋白(Phosphoprotein PP)、膜蛋白(M atrix protein MP)、糖蛋白(Glycoprotein GP)和聚合酶蛋白(Large protein LP)[9]。與其他蛋白相比，N蛋白比較穩(wěn)定，堿基易位、缺失較少，是 RV 基因分型判斷的檢測標準。N蛋白作為主要抗原，在刺激機體產(chǎn)生抗體的同時，對疫苗的研制、診斷、流行病學有重要價值[10]。

本次研究在不改變RV N蛋白基因序列下，對密碼子優(yōu)化，通過化學合成RV N基因，并將其克隆至pET28a(+)原核表達載體，構建pET28a-RV N重組質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)化至 BL21 (DE3)感受態(tài)細胞中，利用His-tag鎳柱純化出了RV N蛋白，并對其進行生物特性鑒定，為后續(xù)疫苗的研制與狂犬病的診斷奠定了基礎。

1 材料

1.1 菌株和質(zhì)粒

原核表達載體pET28a(+)，由重慶理工大學基因工程實驗室贈予，pET28a-RV N/BL21(DE3) 由上海生工生物工程有限公司構建。

1.2 主要試劑及儀器

Tris、Imidazole購自Genview公司；Glycine購自Beyotime公司；10×QuickCut Green buffer、限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ購自TaKaRa公司；NGCTM層析系統(tǒng)、His-tag鎳柱購自購美國Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 RV N基因合成

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫對應的RV N 基因序列(1489853)，將此序列委托上海生物生工有限公司進行密碼子優(yōu)化，并在上下游引物中引入酶切位點NdeI和XhoI，插入His標簽進行合成。

2.2 pET28a-RV N重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定與測序

將公司合成的甘油菌進行平板劃線培養(yǎng)，選取單菌落到試管中活化過夜，錐形瓶擴大培養(yǎng)，得到大量菌株。將得到的菌液取3～4 mL用小型質(zhì)粒試劑盒提取RV N蛋白基因的質(zhì)粒。用NdeI、XhoI、酶切緩沖液、質(zhì)粒、超純水配制雙酶切體系，將制備的體系置于37 ℃水浴鍋中進行 0.5～1 h雙酶切，經(jīng)電泳鑒定正確后，送上海生工進行測序鑒定。

2.3 RV N重組蛋白誘導表達

從-80 ℃冰箱中取出甘油菌，進行平板劃線培養(yǎng)，選取單菌落到試管中活化過夜，通過錐形瓶進行擴大培養(yǎng)，當菌液OD600nm 值在 0.6～0.8 時，加入一定量的 IPTG，30 ℃下誘導8 h。4 500 r/min 離心13 min，離心后倒掉上清,按照菌重的1∶20或1∶30加入裂解液，超聲破碎35 min后，11 000 r/min離心13 min后，進行SDS-PAGE電泳鑒定。

2.4 RV N重組蛋白誘導表達條件優(yōu)化

將pET28a-RV N/BL21(DE3)重組菌平板劃線在含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基，次日選取單菌落接種于試管中37 ℃培養(yǎng)過夜，用移液槍從試管中取1～2 mL菌液于錐形瓶中37 ℃、180 r/min 搖床震蕩培養(yǎng)至OD600nm值達到0.6～0.8。分別進行誘導溫度(20、25、30、37 ℃)、誘導劑IPTG終濃度(0.1 、0.5 、1 、1.4 mmol/L)、誘導時間(2、4、6、8、10 h)的篩選。將菌液5 500 r/min離心14 min后，加入裂解液和1%菌重的PMSF 用35 W的功率超聲破碎，12 000 r/min離心11 min，沉淀按菌重1∶20的體積加入PBS，用渦旋振蕩器進行混勻，取20 μL 混懸液和上清，進行SDS-PAGE電泳鑒定。

2.5 RV N重組蛋白的純化

根據(jù)2.4篩選得到的最佳條件，對pET28a-RV N/BL21菌液擴大培養(yǎng)，將菌液配平8 000 r/min離心12 min后，倒掉上清按照菌重1∶30加入PBS重懸后，再按照之前步驟重復一次后，加入裂解液超聲破碎30 min，倒掉上清加入溶解液和1%菌重的PMSF后，放入4 ℃冰柜攪拌過夜。11 000 r/min離心13 min，收集上清液，用0.22 μm濾頭過濾，打開電腦、啟動蛋白純化儀、收集器，濾液上樣于His-tag鎳柱，用NGCTM層析系統(tǒng)對RV N 重組蛋白進行純化，具體操作步驟見文獻[11]，并收集280 nm紫外吸收峰下的洗脫液。

2.6 RV N重組蛋白的SDS-PAGE鑒定

將原液上清、沉淀、空載體、流穿液不同濃度咪唑液在280 nm紫外吸收峰下的洗脫液各取 20 μL，加入上樣緩沖液5 μL，混勻，100 ℃煮沸10 min，使其變性，進行SDS-PAGE電泳鑒定，取出凝膠倒入考馬斯亮藍染色液，放在搖床震蕩30 min，倒入脫色液脫色過夜，次日進行成像。

2.7 RV N重組蛋白的Western Blot 鑒定

將純化后得到的RV N 蛋白樣品進行 SDS-PAGE電泳，待電泳完畢后，將電泳凝膠進行只留mark和目的條帶的切膠處理，將切好的電泳凝膠轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，待轉(zhuǎn)膜完成后，將膜用含5%脫脂奶粉的TBST在水平搖床上室溫封閉1 h。以RV N蛋白標準抗體作為一抗(1∶5 000稀釋)放在4 ℃冰箱中過夜，次日取出膜放在盒子里用TBST洗3次。以羊抗鼠IgG抗體為二抗(1∶4 000)，水平搖床孵育1 h。加入按照等量A液和B液混合的顯色液，靜置3 min，將膜的正面放在成像儀中進行顯影。

3 結果與分析

3.1 pET28a(+)-RV N重組質(zhì)粒酶切鑒定及測序

將重組質(zhì)粒pET28a( + )RV-N雙酶切凝膠電泳，在1 359 bp目的基因與5 369 bp處有明顯條帶，與預期目的片段及空載體大小基本一致(見圖1)。將狂犬病重組N蛋白進行測序，顯示連接位點均正確。

M:標準酶切MARKER； 1;狂犬病雙酶切鑒定

3.2 RV N重組N蛋白表達鑒定

將公司合成的pET28a(+)-RV N菌株和BL21空載體在相同條件下進行誘導表達后進行 SDS-PAGE 電泳鑒定。結果顯示:BL21空載體不表達目的蛋白，重組菌株經(jīng)在一定條件下，沉淀在51KD處表達出大量的目的蛋白，而超聲破碎后的上清中沒有(見圖2)。這與預期分子量大小相符，說明pET28a( + )RV -N重組菌株構建成功。

M:蛋白分子質(zhì)量標準；1:pET28a(+)上清2：pET28a(+)沉淀；3-4：經(jīng)誘導pET28a(+)-RV N沉淀，5-6:經(jīng)誘導pET28a(+)-RV N上清

3.3 RV N重組N蛋白誘導表達條件優(yōu)化

為探究RV N重組蛋白表達的影響因素，選取溫度(20、25、30、37 ℃)、IPTG濃度(0.1、0.5、1.0、1.5 mmol/L)、時間(2、4、6、8、10 h)3個因素對蛋白表達進行優(yōu)化，經(jīng)過SDS-PAGE電泳鑒定。結果見圖3—5。在誘導溫度為30 ℃、IPTG終濃度為0.1 mmol /L、誘導時間為8 h時，51 kD處出現(xiàn)最大蛋白表達量。

M:蛋白分子質(zhì)量標準;1.pET28a(+)沉淀；3、5、7、9：20、25、30、37 ℃(0.5 mmol·L-1 IPTG，7 h)誘導條件下RV N重組蛋白超聲破碎后沉淀；2、4、6、8：20、25、30、37 ℃(0.5 mmol·L-1 IPTG，7 h)誘導條件下RV N重組蛋白超聲破碎后上清

M:蛋白分子質(zhì)量標準;1.pET28a(+)沉淀；3、5、7、9：0.1、0.5、1、1.5 mmol/L IPTG(30 ℃，7 h)誘導條件下 RV N重組蛋白超聲破碎后沉淀 2、4、6、8：0.1、0.5、1、1.5 mmol/L IPTG(30 ℃，7 h)誘導條件下 RV N重組蛋白誘導表達上清

M:蛋白分子質(zhì)量標準 1：pET28a(+)空載體沉淀；2-6：狂犬病時間分別在2、4、6、8、10 h (0.1 mmol·L-1 IPTG，30 ℃)RV N重組蛋白超聲破碎后沉淀

3.4 RV N重組N蛋白的純化

將pET28a(+)-RV N重組菌株平板劃線培養(yǎng)，在最佳條件下進行大量培養(yǎng)，菌液離心超聲破碎溶解過夜，使用蛋白純化儀進行純化，設置了不同濃度的咪唑?qū)?RV N 蛋白進行洗脫。結果顯示:RV N 蛋白在300 mM咪唑濃度下有280 nm 紫外吸收峰，結果如圖6所示。

圖6 NGCTM層析系統(tǒng)純化RV N重組蛋白圖譜

3.5 RV N重組蛋白的SDS-PAGE鑒定

取超聲破碎后蛋白溶解原液、流穿液、不同濃度咪唑洗脫下的280 nm紫外吸收峰進行SDS-PAGE電泳鑒定，結果(見圖7)表明，300 mM洗脫下來的蛋白液即為純化后的RV N重組蛋白，且純度較高，雜蛋白較少。

M：蛋白分子質(zhì)量標準；1：包涵體提取液；2:流穿液；3-4：5%洗下雜蛋白；5-8：純化后N蛋白

3.6 RV N重組蛋白的Western Blot 鑒定

Western Blot鑒定結果表明(圖8)，在51 kD處出現(xiàn)明顯特異性蛋白印跡條帶，而空載體轉(zhuǎn)化的DE3菌液對照沒有任何條帶，與預期結果相同。說明表達已成功表達 RV N蛋白。

M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1:RV N 重組蛋白 2：pET28a(+)空載體轉(zhuǎn)化的DE3菌液

4 討論

狂犬病是一種致死性疾病，在中國2000多年前就有人被感染，一旦發(fā)病，死亡率幾乎 100%[12-13]。在狂犬病的預防與控制中，狂犬病的檢測尤為重要，目前在臨床實踐中對狂犬病的診斷方法主要是通過流行病學和臨床癥狀,缺乏對狂犬病特異性診斷[14],而狂犬病N蛋白基因序列相對穩(wěn)定，點突變少，常用作于病毒的分型與診斷,隨著對N蛋白基因序列的進一步研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)現(xiàn)病毒菌株的來源和遺傳聯(lián)系以及致病力的變化方面有著重要意義[15]。

RV N是機體防止病毒感染的關鍵蛋白，它是一種T細胞(Th)調(diào)節(jié)抗原能誘導不同基因型RV 產(chǎn)生特異性保護，在開發(fā)新型狂犬病疫苗發(fā)揮著決定作用[16]。

本研究在RV N蛋白基因序列起始密碼子N端與C端分別加入His-tag，并選擇pET28a(+)作為表達載體進行RV N重組蛋白的表達，在篩選溫度、IPTG濃度、時間這3個因素對RV核蛋白表達影響中，發(fā)現(xiàn)IPTG濃度 0.1 mmol/L，6 h，30 ℃時 RV 重組蛋白表達量最高。本研究前幾次蛋白純化中沒能洗脫出目的蛋白，在后續(xù)數(shù)次實驗中，添加了不同濃度的咪唑并延長了洗脫時間，發(fā)現(xiàn)在300 mM 咪唑濃度下洗脫出目的蛋白。在純化中發(fā)現(xiàn)蛋白不易溶解且與鎳柱結合難度高，不易洗脫，之后加入一定量脫氧膽酸鈉、DTT、提高溶解液pH值至8.0，增加蛋白溶解時間來提高蛋白的可溶性，經(jīng)過電泳發(fā)現(xiàn)溶解度增加。經(jīng)SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)，RV N 重組蛋白在菌體內(nèi)形成包涵體，這可能是因為蛋白聚合酶的功能太強，蛋白沒有時間折疊致使過多的蛋白質(zhì)的非特異性結合[17]。其次，在大腸桿菌原核表達載體沒有糖基化功能，導致中間體的大量積累和不溶性包涵體蛋白形成。本次研究成功制備出RV N蛋白，純度濃度較高，具有良好的生物活性，為后續(xù)單克隆抗體以及疫苗的制備奠定了基礎。