東亞飛蝗DSCAM2多克隆抗體制備

邱 佳，余 瑛

(重慶理工大學 藥學與生物工程學院， 重慶 400054)

0 引言

唐氏綜合征細胞粘附分子(Down syndrome cell adhesion molecule，DSCAM)是免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)超家族中的成員，具有與Ig相類似的結構特征，其典型的結構域通常以Ig-Fibronectin，F(xiàn)N-Ig-FN模式串聯(lián)[1-2]而成。最近的研究表明，無脊椎動物的DSCAM在適應性免疫系統(tǒng)中起著與抗體相似的作用[3]。DSCAM可以通過選擇性剪接產生多種異構體，與各種病原體特異性結合。理論上，對黑腹果蠅Dscam的N端細胞外結構域Ig2、Ig3、Ig7和跨膜結構域進行選擇性剪接，可以產生38 000個異構體[4]。DSCAM異構體已被證實在昆蟲免疫保護方面起關鍵作用，其功能涉及病原體特異性識別、細胞吞噬、免疫信號轉導和抗菌肽轉錄等多個途徑[5-6]。在哺乳動物中，DSCAM參與人類神經元的發(fā)育和軸突生長[7]。DSCAM缺失可導致脊髓發(fā)育失調，引發(fā)自閉癥、抑郁癥和精神分裂癥等精神疾病有關[8]。此外， DSCAM表達降低與非小細胞肺癌、結直腸癌以及骨肉瘤等多種腫瘤形成密切相關[9-11]。

人們普遍認為，無脊椎動物缺乏適應性免疫，主要依靠先天免疫(包括物理屏障如幾丁質外骨骼、細胞免疫和體液免疫)進行機體防御[12]。DSCAM在無脊椎和脊椎動物廣泛存在，且與抗體結構相似，表明它可能與物種進化過程中的抗體演化存在關聯(lián)。然而，人們對DSCAM選擇性編輯的調控機制及其與免疫作用的關系仍然未知。

最近有研究發(fā)現(xiàn)，受到真菌感染的東亞飛蝗血淋巴細胞差異表達DSCAM2，提示其可能參與了細胞免疫反應。本研究以東亞飛蝗為材料，從其血細胞中克隆了含有DSCAM保守結構域的DSCAM2828-957抗原片段，經重組表達、純化和免疫小鼠獲得了多克隆抗體并對其特異性和細胞定位進行了檢測。此外，還對DSCAM2與影響血淋巴計數(shù)的關系進行了初步探索，為下一步進行DSCAM2的選擇性剪接機制和免疫相關功能研究奠定了工作基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1試劑

Taq DNA聚合酶、dNTP、QuickCutTMEcoR Ⅰ、QuickCutTMHind III、10×QuickCut Green Buffer 、DNA 連接酶均購自TaKaRa公司，Ultrapure RNA Kit(DNase I)、HiFiScript cDNA Synthesis Kit購自康為世紀公司，質粒提取試劑盒、DNA快速純化/回收試劑盒購自OMEGA試劑公司，BCA試劑盒購自碧云天公司，其他試劑均為國產分析純。

蛋白質純化試劑及配方：細胞裂解液：25 mmol/L磷酸二氫鈉 (pH值為8.0)，0.4 mol/L NaCl， 0.1%tween20，0.1 mmol /L苯甲基磺酰氟(PMSF)。包涵體溶解液：25 mmol/L磷酸二氫鈉(pH值為7.4)，0.1 mol/L NaCl，9 mol/L尿素，0.1 mmol /L PMSF。平衡溶液：25 mmol/L Tris-HCl (pH值為8.0)，0.4 mol/L NaCl，20 mmol/L咪唑。50 mmol/L咪唑洗脫液：25 mmol/L 磷酸氫二鈉(PH值為7.4)，0.1 mol/L NaCl，18 mol/L尿素，50 mmol/L咪唑。400 mmol/L 咪唑洗脫液：25 mmol/L磷酸氫二鈉(pH值為7.4)，0.1 mol/L NaCl，18 mol/L尿素，400 mmol/L咪唑。

1.1.2動物、質粒及菌株

東亞飛蝗由重慶大學基因中心提供。BALB/c小鼠購自重慶醫(yī)科大學動物中心。質粒pET30a(+)、大腸桿菌 DH5α、BL21(DE3) 細胞為本實驗室保存。

1.1.3DSCAM2序列

該序列數(shù)據來源于東亞飛蝗血淋巴轉錄組測序結果，具體核酸序列在網站NCBI可查詢，編號為AJF38204.1。

1.2 方法

1.2.1DSCAM2基因的生物信息學分析

利用NCBI中BLASTp對DSCAM2序列結構分析；采用軟件BioEdit進行本地數(shù)據庫比對出特異性區(qū)段；同時分析出抗原表位(http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl)豐富區(qū)段，以此確定PCR擴增區(qū)段。

1.2.2引物設計

采用 primer 5.0軟件，根據選定的抗原區(qū)域設計引物序列分別為F primer：5′-GTTGAATTCATCAGTGTACAAGCTCCCCC-3′; R primer：5′-CAGAAGCTTTCACTTGATTGGAGACTTTCCA-3′。F或R primer分別添加了EcoR I和HindIII識別位點序列。

1.2.3pET30a(+)-DSCAM2828-957重組質粒的構建

東亞飛蝗血淋巴細胞提取總RNA，用反轉錄試劑盒合成cDNA第一鏈，DSCAM2828-957PCR的擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 7 min。擴增結束后進行1%瓊脂糖凝膠電泳。

將得到的PCR產物回收純化，純化的PCR產物和pET30a(+)質粒分別用EcoR Ⅰ、Hind III雙酶切，再將其進行回收純化、連接，轉化到DH5α感受態(tài)細胞。用含卡拉霉素的LB平板篩選轉化子。挑選幾個菌落PCR鑒定后的陽性克隆進行質粒酶切鑒定及質粒測序。

1.2.4重組DSCAM2828-957表達和純化

將鑒定為正確序列的質粒，轉入大腸桿菌BL21(DE3)中，37 ℃、250 r/min培養(yǎng)，待OD600至0.6～0.8時，加入濃度為1.0mmol/L IPTG誘導，25℃，250 r/min培養(yǎng)。誘導時間分別為0、6、12、18、24 h。收集不同誘導時間的菌體，進行細胞超聲破碎，分離裂解上清及沉淀，SDS-PAGE檢測目的蛋白表達情況。

采用表達水平達到峰值的誘導、培養(yǎng)條件，對DSCAM2828-957/ BL21(DE3)進行1L發(fā)酵液培養(yǎng)，離心收集菌體，細胞超聲破碎后。16 000 r/min離心收集沉淀，并用包涵體溶解液溶解沉淀。用Ni-NTA進行純化，SDS-PAGE考馬斯亮藍法檢測目的蛋白純度，BCA試劑盒測定蛋白濃度。

1.2.5DSCAM2多克隆抗體制備和效價測定

將純化的重組抗原進行SDS-PAGE電泳，電泳結束后凝膠用1 mol/L氯化鉀染色10 min；切下含有目標條帶的凝膠塊；凝膠塊用超純水洗滌去除氯化鉀，經液氮研磨成細粉，用PBS重懸備用。取健康BALB/c雌性小鼠(6～8周)，按每次每只100 μg抗原劑量腹腔注射小鼠，間周免疫，總共免疫3～4次。效價大于5 000時，眼球采血，收集血清，-80 ℃保存。間接ELISA法測定效價。參考文獻[13],將抗血清倍比稀釋至1∶64 000，所有血清標本均重復3孔，同時設 PBS 作為對照組，讀取酶標儀450 nm波長處吸光度值。

1.2.6東亞飛蝗血淋巴特異性檢測及細胞定位

1) Western blot法檢測特異性。將東亞飛蝗血淋巴細胞總蛋白和純化后的重組DSCAM2828-957蛋白分別經10% SDS-PAGE分離，轉移至用甲醇激活的PVDF膜上，用5%脫脂牛奶的TBST 37 ℃封閉 1 h；以 DSCAM2828-957多抗血清為一抗(1∶1 000 稀釋)，37 ℃作用2 h；TBST洗滌3次，加入二抗Anti-Mouse IgG(1∶10 000稀釋)，37 ℃作用1 h；TBST洗滌 3次，按ECL顯色試劑盒說明書配制顯色液，并進行化學發(fā)光顯示。

2) 瑞氏-吉姆薩染色。制作東亞飛蝗血淋巴細胞涂片，干燥，依次使用瑞氏和吉姆薩染色，觀察。

3) 免疫熒光法。制作東亞飛蝗血淋巴細胞涂片，根據文獻[14]多聚甲醛固定，打孔，以 DSCAM2828-957多抗血清為一抗(1∶1 000 稀釋)，加FITC標記的兔抗鼠二抗，在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.7東亞飛蝗總血細胞計數(shù)

取羽化一周的東亞飛蝗成蟲，每只經腹節(jié)注射500 ng siRNA，以GFP siRNA片段為干擾陰性對照，干擾48 h后經血球計數(shù)法檢測血細胞密度變化。

使用GraphPad Prism 8.0.1 對數(shù)據進行統(tǒng)計分析，為確定統(tǒng)計學意義，采用霍爾姆-西達克方法校正多重比較，小于0.05的值被認為具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 DSCAM2基因的生物信息學分析

經NCBI中BLASTp分析，東亞飛蝗DSCAM2蛋白由2 015個氨基酸殘基組成，其中包含了Dscam c、IgI_4_Dscam、IgI_2_Dscam、IgI_1_Dscam、IgI_7_Dscam、IgI_5_Dscam、IgC2_3_Dscam、IgI_6_Dscam、Ig _DSCAM、FN3、I-set、IGc2、Ig_3、IgI_3_Robo、IG_like、IG、PHA03376、PHA02826等18種結構域，主要集中在58～1 990區(qū)段。與果蠅DSCAM2異構體X16(NCBI中ID：XP_039148152.1)或人類DSCAM異構體2(NCBI中ID：NP_001258463.1)蛋白結構分析對比(見圖1)，都具有I-set、Ig_3和FN3保守結構域，但I-set 和Ig_3拷貝數(shù)不同且東亞飛蝗和果蠅比人類的多了一個Dscam_C結構域，這些差異是否影響其功能目前尚不清楚。

圖1 東亞飛蝗DSCAM2與果蠅DSCAM2異構體X16或人類DSCAM異構體2結構域比較

2.2 重組pET30a(+)-DSCAM2828-957構建

從東亞飛蝗血細胞中提取總RNA，用反轉錄試劑盒合成cDNA 第一鏈，然后用F primer、R primer對DSCAM2828-957基因片段進行PCR擴增。經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，顯示擴增產物大小為414 bp，與設計的片段長度符合，如圖2(a)。

A.DSCAM2828-957基因RT-PCR擴增。M:DL2000 DNA marker；1:陰性對照；2-3:DSCAM2828-957PCR產物

將該片段與pET30a(+)質粒進行酶切，再經連接、轉化DH5α得到轉化子，提取重組轉化子質粒進行EcoR I和Hind III雙酶切(圖2(b))檢測，電泳結果顯示重組質粒插入片段與擴增片段大小一致，質粒測序結果也顯示插入序列與DSCAM2828-957相同，表明pET30a(+)-DSCAM2828-957重組質粒構建成功。

2.3 DSCAM2重組表達及純化

將pET30a(+)-DSCAM2828-957質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)，得到pET30a(+)-DSCAM2828-957/ BL21(DE3)表達菌株。對此表達菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)后收集菌體。采用超聲裂解法破胞，離心后分別收集上清和沉淀，進行SDS-PAGE分析，結果見圖3(a)和圖3(b)，表明IPTG誘導培養(yǎng)6～24 h的裂解液上清及沉淀中均有DSCAM2828-957重組蛋白，沉淀中含量更高。這表明DSCAM2828-957重組蛋白在BL21(DE3)中主要以包涵體形式表達，其相對分子質量約21.1 KDa。

將包含體蛋白用尿素溶液溶解，用Ni-NTA親和層析純化重組DSCAM2828-957，經SDS-PAGE檢測(圖3(c))可知，DSCAM2828-957重組蛋白可用50 mM/L 咪唑溶液洗脫，image J軟件分析顯示該濃度下洗脫得到的DSCAM2828-957純度為75%，蛋白濃度為1.913 g/L。

M:蛋白質分子量marker；目標條帶黑色箭頭所示。

2.4 DSCAM2多克隆抗體的效價測定、特異性鑒定及定位

為了制備高純度DSCAM2828-957以保證免疫后多克隆抗體的特異性，本研究采用切膠免疫法免疫小鼠，獲取的多克隆抗體效價測定大于 1∶64 000；采用Western blot檢測DSCAM2828-957和東亞飛蝗血淋巴細胞總蛋白均顯示出現(xiàn)單一條帶(見圖4)，表明制備的多克隆抗體具有特異性。

東亞飛蝗具有原血細胞、粒細胞、漿細胞和類卵母細胞4類血淋巴細胞，其中原血細胞和粒細胞較小，瑞氏-吉姆薩染色原血細胞為球形紅色，而粒細胞具有多種形態(tài)且根據酸堿性質顯色[15]。對東亞飛蝗血淋巴細胞進行了瑞氏-吉姆薩染色(見圖5(a))和免疫熒光檢測(見圖5(b))，從細胞形態(tài)、大小和染色特征對比分析表明，東亞飛蝗嗜堿性粒細胞高表達DSCAM2。

A.重組DSCAM2828-957蛋白特異性檢測。M:蛋白質分子量markerB.東亞飛蝗血淋巴細胞總蛋白特異性檢測。M:蛋白質分子量marker

(a)東亞飛蝗血淋巴細胞瑞氏-吉姆薩染色，黑色箭頭所示嗜堿性粒細胞(b)免疫熒光分析DSCAM2在東亞飛蝗血淋巴細胞中的定位，白色箭頭所示嗜堿性粒細胞。

2.5 敲低DSCAM2表達水平引起東亞飛蝗總血細胞計數(shù)增加

用siRNA干擾DSCAM2后，進行東亞飛蝗血淋巴細胞計數(shù)，結果發(fā)現(xiàn)其血淋巴細胞計數(shù)顯著增多(見圖6)，表明DSCAM2可能參與血細胞增殖調控，詳細的機制需要進一步研究。

*，p<0.05，Mean±SEM(n=3)

3 討論

3.1 DSCAM2抗原片段的選擇與多克隆抗體的特異性

本研究對DSCAM2蛋白序列進行特異性、親水性、抗原性和可及性等生物信息學分析[16]，選取特異性好、抗原表位豐富、大小約400 bp、含有Dscam_C保守結構域片段作為克隆區(qū)。采用原核系統(tǒng)成功克隆并成功表達了DSCAM2828-957抗原，經Ni親和層析純化目的蛋白免疫小鼠，獲取了高效價的多克隆抗體。此方法中選取的抗原DNA片段大小易于在原核系統(tǒng)高水平表達且具有較好的免疫原性，其帶有的His-tag，在純化條件選擇時，無需考慮蛋白變性與否，降低了純化包涵體蛋白難度[17]。同時，利用電泳后切膠[18-19]處理，在較短時間內能獲得大量的高純度抗原蛋白，更容易獲得特異性較高的抗體。本實驗使用該方法在3次免疫后，DSCAM2828-957多克隆抗血清效價達 1∶64 000，表明該制備方法獲得的抗血清高效，能同時識別多個抗原表位且周期短[20]。采用Western blot 檢測重組DSCAM2828-957和東亞飛蝗血淋巴細胞總蛋白中的DSCAM2均只有1個條帶，表明設計的重組抗原及獲得的抗體均具有較好的特異性，可用于后續(xù)采用免疫學方法檢測DSCAM2表達和研究DSCAM2相關功能[21]。

3.2 DSCAM2異構體與抗原識別

昆蟲DSCAM2有多種異構體，如秀麗果蠅(Drosophila elegans)的DSCAM2異構體至少包括76種蛋白(數(shù)據來自NCBI Protein 搜索結果)，分子量在73.8～282 KDa范圍。本研究制備的抗體檢測到東亞飛蝗血細胞DSCAM2分子量僅24.7 KDa。這種小分子DSCAM2，目前報道較少，其功能尚不明確。越來越多的研究證明，DSCAM基因可以由不同的病原體誘發(fā)產生不同的亞型，增加免疫細胞吞噬的效率，從而表現(xiàn)出類似適應性免疫的功能[22]，不同亞型DSCAM及其異構體的作用仍有待闡明。本研究發(fā)現(xiàn)的DSCAM2異構體主要在血淋巴嗜堿性粒細胞高表達，前期研究已顯示嗜堿性粒細胞很可能參與病原真菌吞噬過程[23]，提示DSCAM2的功能可能與嗜堿性粒細胞對真菌的特異性識別和吞噬作用有關。

由于對昆蟲DSCAM2在各種組織中異構體的分布情況報道很少，本研究制備的抗體對DSCAM2的特異性檢測也只針對東亞飛蝗血淋巴細胞，因此尚不清楚該抗體在東亞飛蝗其他組織特異性如何，也不能確認該方法制備的抗體是否可以用于其他昆蟲血淋巴細胞的免疫檢測。但本研究提供的抗原設計和抗體制備方法及思路仍能為快速制備高效價、特異性強的目標抗體提供借鑒。

選取抗原表位豐富且特異性強的抗原片段作為重組抗原能較好地保證所制備的多克隆抗體的特異性。本研究制備的抗體對于探索DSCAM2在東亞飛蝗血淋巴細胞中的功能或剪接機制提供了可靠的研究工具。