響應(yīng)面法優(yōu)化白芨多糖提取工藝

竇 欣

（陜西能源職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，陜西西安 710613）

1 材料與方法

1.1 實驗材料與設(shè)備

白芨（產(chǎn)地：云南，批號：20200820）；乙醇、氯仿、正丁醇、濃硫酸、D-葡萄糖、苯酚，以上試劑均為分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

PD5-5型冷凍干燥機，SIM；KQ-500DA數(shù)控超聲波清洗器，昆山舒美；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；p4紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 白芨多糖的提取

參考孔令珊[1]將白芨片粉碎，將粉末全部通過20目篩，稱取過篩后的粉末約20g按料液比1：4的比例加入95%的乙醇溶液進行回流提取2h，進行2次，棄去提取液，殘渣烘干備用。

稱取上述白芨粉末2g以料液比1：20加入蒸餾水，45℃下以超聲功率100W超聲波輔助提取3次，每次1h。將所有濾液進行濃縮并將濃縮液置于分液漏斗中，用Sevag法除去蛋白后將濾液繼續(xù)濃縮至稠膏狀，再加入4倍量的95%乙醇放置過夜，使其沉淀完全，將沉淀物進行冷凍干燥，即得白芨多糖。

1.2.2 白芨多糖的含量測定方法

（1）標準曲線的繪制

參考劉長命等[2]的方法加以改變進行白芨多糖測定時標準曲線的繪制；準確稱取D-葡萄糖對照品0.0104g于250mL容量瓶中進行定容。分別量取葡萄糖標準溶液0.0、0.8、1.2、1.6、2、2.4、2.8、3.2、3.6mL于試管中，再分別加入4.0、3.2、2.8、2.4、2.0、1.6、1.2、0.8、0.4mL蒸餾水，再各加2mL的6%苯酚溶液、10mL的濃硫酸搖勻，靜置30min。以溶劑空白作為對照溶液，以490nm作為測定波長進行吸光度測量。測量結(jié)果以葡萄糖溶液濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，得到線性方程與相關(guān)系數(shù)。

（2）方法學(xué)考察

利用方法學(xué)考察的實驗內(nèi)容對苯酚-硫酸測定白芨多糖含量進行穩(wěn)定性、精密度、回收率、重復(fù)性等方面的考察。

（3）白芨多糖含量計算

冷凍干燥后白芨多糖經(jīng)過粉碎，精密稱取約0.05g，加入蒸餾水充分溶解后，定容至100mL，作為樣品溶液待測。應(yīng)用1.2.1中方法將測得樣品的吸光值代入標準曲線回歸方程，計算出白芨多糖的含量。

1.2.3 白芨多糖得率的計算

將1.2.1中計算得到的白芨多糖含量按照公式（1）計算白芨多糖得率。

式中：C為樣品濃度（g/mL），V為定容后的體積（V），M為樣品質(zhì)量（g）。

1.2.4 單因素考察白芨多糖提取條件

在固定超聲提取功率為100W的條件下通過單因素考察不同條件下白芨多糖的得率從而得到白芨多糖提取的最佳條件。

（1）提取溫度對白芨多糖提取的影響

將超聲提取時的溫度設(shè)定為20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃，在料液比為1：20、提取時間為30min、提取功率100W的條件下進行白芨多糖的提取。

（2）提取時間對白芨多糖提取的影響

將超聲提取時間設(shè)定為20min、30min、40min、50min、60min，在料液比為1∶20、提取溫度為45℃、提取功率100W的條件下進行白芨多糖的提取。

（3）料液比對白芨多糖提取的影響

將提取時的料液比設(shè)置為1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，提取時間為30min，提取溫度為45℃、提取功率100W的條件下進行白芨多糖的提取。

1.2.5 響應(yīng)面分析優(yōu)化白芨多糖提取工藝

在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上采用Box-Benhnen中心組合實驗設(shè)計原理對于超聲輔助提取白芨多糖工藝進行優(yōu)化，并采用三因素三水平響應(yīng)面分析方法優(yōu)化白芨多糖提取工藝（表1）[3]。

表1 超聲波輔助提取白芨多糖響應(yīng)面分析實驗因素及水平設(shè)計表

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的繪制

采用1.2.2項下方法，以吸光度為縱坐標，葡萄糖溶液濃度為橫坐標所得的標準曲線回歸方程為：y=3.0567x-0.0058，r=0.9997。結(jié)果說明線性關(guān)系良好。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 穩(wěn)定性試驗

精密吸取白芨多糖樣品溶液0.4mL，按照1.2.2項下的方法每隔一定時間進行一次測定，計算出吸光度的相對標準偏差RSD=1.31%，說明本實驗物質(zhì)在90min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.2 重復(fù)性試驗

取6份前處理過得白芨干燥粉末，各稱定5g，按照1.2.1項下方法進行白芨多糖的提取，將每份樣品得到的白芨多糖粉末精密稱定0.05g，分別溶解后定容于250mL的容量瓶中，得到一定濃度的白芨多糖溶液，每份溶液取0.4mL，按照1.2.2項下的方法進行吸光度的測定，根據(jù)結(jié)果計算出吸光度的相對標準偏差RSD=2.02%，說明本實驗方法重復(fù)性良好。

2.2.3 精密度實驗

精密量取白芨多糖溶液0.4mL，按照1.2.2項下的方法進行吸光度值的測定，根據(jù)結(jié)果計算出吸光度的相對標準偏差RSD=0.77%，說明本實驗方法精密度良好。

2.2.4 回收率實驗

精密量取體積相等的白芨多糖樣品溶液10份，其中9份中加入不同量的標準物質(zhì)，按照1.2.2項下方法進行吸光度的測定，再使用標準曲線計算出白芨多糖的量，根據(jù)不加標準物質(zhì)的樣品溶液的吸光度值計算出樣品中白芨多糖的量，根據(jù)數(shù)據(jù)可以求得平均回收率為97.81%，相對標準偏差RSD=1.01%。

以上的方法學(xué)考察結(jié)果說明了本次方法的結(jié)果可靠、可以用于白芨多糖含量的檢測。

2.3 單因素考察白芨多糖提取實驗結(jié)果分析

從實驗結(jié)果可以看到，隨著提取溫度的升高白芨多糖的得率也在增大，溫度達到50℃后，白芨多糖的得率不再增加。所以將50℃定為最佳提取溫度。隨著提取時間的增加，白芨多糖的得率也在進一步增加，白芨粉末需要溶脹一段時間才能更好地進行有效成分的溶出，所以隨著時間的增加白芨多糖的溶出也在增加。但當提取時間達到40min時，白芨多糖的得率出現(xiàn)最大值，隨后開始下降，所以將40min作為最佳提取時間。隨著料液比的增加白芨多糖的得率也進一步增加，溶劑越多，有效成分的溶出越多，溶解平衡越晚達到，隨著料液比的增加白芨多糖的溶出也在增加。但當料液比到達1∶20時，白芨多糖的得率也出現(xiàn)最大值，隨后開始下降，所以選擇料液比1∶20為最優(yōu)條件。

2.4 響應(yīng)面實驗結(jié)果

通過響應(yīng)曲面圖1的結(jié)果進行分析，用白芨得率作為測試變量，得到其最佳值的提取工藝預(yù)測如下：超聲溫度50.99℃、超聲時間42.18min、料液比22.07mL/g。但是，考慮到實際條件下的操作，最佳條件可以修改為：超聲溫度51℃、超聲時間42min、料液比22mL/g。使用上述條件進行驗證實驗，發(fā)現(xiàn)白芨多糖的實驗收率為69.5%與預(yù)測值非常吻合。結(jié)果表明，回歸模型對白芨得率的預(yù)測是準確和充分的。

圖1 兩因素的交互作用對白芨多糖得率的響應(yīng)面圖

3 結(jié)束語

采用超聲波輔助水提醇沉法對白芨多糖的提取，用D-葡萄糖在苯酚-硫酸法的基礎(chǔ)上建立了回歸曲線，并從穩(wěn)定性、精密度、重復(fù)性、回收率等方面進行了驗證，證明了本試驗方法相對可靠。使用單因素法考察了在固定超聲功率100W的前提下應(yīng)用不同超聲時間、超聲溫度以及料液比的條件下對白芨多糖得率的影響，使用響應(yīng)面分析法對超聲波輔助提取白芨多糖工藝進行優(yōu)化，得到了最優(yōu)提取工藝：在超聲功率100W的前提下，超聲溫度51℃、超聲時間42min、料液比22mL/g。在此條件下進行了驗證實驗，得到的白芨多糖的得率為69.5%，符合推測。