酪蛋白糖基化改性的研究進(jìn)展

曾冰蕙，郝夢(mèng)真，劉桂蓉，熊文文，車會(huì)蓮

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

酪蛋白含量約占牛奶蛋白80%左右[1]，分子量約為19～25 kDa，是牛乳中含量最多的蛋白質(zhì)。酪蛋白分為4種組分：αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白和κ-酪蛋白，它們?cè)谂Ｄ讨械谋壤s為40:10:35:15[2]。酪蛋白是牛乳中營養(yǎng)價(jià)值最高的蛋白質(zhì)，含有8種人體必需氨基酸，是氨基酸的優(yōu)質(zhì)食源[3]，可以通過膳食為人體發(fā)育提供必要的營養(yǎng)物質(zhì)[4]。故酪蛋白已作為原輔料應(yīng)用于食品工業(yè)，如用作乳化劑[5?6]等。但酪蛋白本身特性具有一定的局限性，研究人員著眼于通過物理、化學(xué)反應(yīng)研發(fā)一系列酪蛋白衍生品，為酪蛋白的廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

相比于其它化學(xué)修飾，糖基化反應(yīng)是一種較為安全的蛋白質(zhì)改性手段[7]，使親水性較高的碳水化合物（一般是單糖或寡糖）連接到蛋白質(zhì)分子中的部分氨基酸殘基上，從而改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象、溶解度、熱穩(wěn)定性、乳化性等功能特性，并對(duì)其抗氧化、免疫原性、免疫活性等體內(nèi)活性也造成一定的影響[8]。酪蛋白糖基化復(fù)合物可以作為功能成分添加到食品中，以改善食品的質(zhì)地、口感、功能等特性。

了解不同糖基化方法、不同糖基對(duì)酪蛋白功能特性的影響，對(duì)酪蛋白的廣泛應(yīng)用以及高效開發(fā)蛋白質(zhì)類食品有重要意義。本文將首次綜述近年來在酪蛋白糖基化反應(yīng)領(lǐng)域的研究方法、影響因素及研究結(jié)果，旨在為新產(chǎn)品的研發(fā)乃至乳制品加工產(chǎn)業(yè)提供一個(gè)宏觀視角及理論支撐。

1 糖基化反應(yīng)

1.1 糖基化反應(yīng)的定義

理論上，蛋白質(zhì)與糖類溶液混合時(shí)所形成的體系有5種可能[9]：可溶性復(fù)合物、不溶性復(fù)合物、共溶體系、熱力學(xué)不相容體系和膠體絮凝。糖基化反應(yīng)是指親水性較高的碳水化合物（一般是單糖或寡糖）共價(jià)或非共價(jià)地連接到蛋白質(zhì)分子的部分氨基酸殘基上，形成可溶性復(fù)合物和/或不溶性復(fù)合物的體系。

1.2 共價(jià)連接糖基化反應(yīng)

1.2.1 美拉德反應(yīng)（非酶法糖基化） 美拉德反應(yīng)又稱羰氨反應(yīng)，是還原糖的羰基與多肽或蛋白質(zhì)氨基酸殘基的氨基之間的反應(yīng)[10]（圖1），已被認(rèn)為是一種有效的且有應(yīng)用前景的蛋白質(zhì)修飾方法，以改善蛋白質(zhì)或多肽的體內(nèi)外功能活性。

圖1 美拉德反應(yīng)過程簡(jiǎn)圖Fig.1 Simplified scheme of Maillard reaction

美拉德反應(yīng)有三個(gè)階段，分別產(chǎn)生不同的產(chǎn)物，本綜述研究對(duì)象為酪蛋白糖基化復(fù)合物，其是美拉德反應(yīng)的初始階段和/或中間階段的產(chǎn)物，不包含危害人體健康的晚期糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）。美拉德反應(yīng)末期在一定條件下會(huì)產(chǎn)生AGEs，這是一類復(fù)雜的化合物，有著各自不同的理化特性，例如有的呈現(xiàn)棕色，有的具有熒光特性等[11]。美拉德反應(yīng)根據(jù)反應(yīng)環(huán)境可分為濕法與干法。

1.2.1.1 濕法 濕法的操作簡(jiǎn)單，糖基接枝速度快、效率高，反應(yīng)時(shí)間較短，適用于小分子糖類的糖基化反應(yīng)。將酪蛋白溶液與糖液混合，以溶液的形式進(jìn)行水浴加熱，之后迅速冷卻、干燥成粉等到糖基化產(chǎn)物[12]。但濕法反應(yīng)溫度高會(huì)導(dǎo)致糖基化產(chǎn)物褐變嚴(yán)重[13]，同時(shí)還會(huì)使一些熱敏感的蛋白質(zhì)發(fā)生變性，產(chǎn)物得率變低。

但酪蛋白由于熱穩(wěn)定性較好，故采用濕法制備糖基化酪蛋白的研究較多。如徐世濤等[3]通過濕法研究了不同糖基種類的糖基化對(duì)酪蛋白特性的影響；Jing等[14]用濕法制備了葡萄糖、果糖、核糖的糖基化酪蛋白產(chǎn)物；Wang等[15]研究了木糖與酪蛋白的濕法產(chǎn)物等。

超聲處理有利于底物分子之間接觸更為均勻，增加分子碰撞的概率。且高強(qiáng)度超聲波獨(dú)特的物理、機(jī)械和化學(xué)效應(yīng)，有利于蛋白質(zhì)表面活性的增加[16]及自由巰基、二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變[17]。一些研究顯示[7,18]，使用超聲輔助預(yù)處理底物溶液后，再進(jìn)行濕法加熱，結(jié)果顯示超聲預(yù)處理可以顯著提高反應(yīng)的效率。這一發(fā)現(xiàn)給今后的濕法糖基化反應(yīng)乃至所有糖基化反應(yīng)的底物預(yù)處理提供了一種可行的優(yōu)化方案。

1.2.1.2 干法 將混合底物溶液先凍干成粉，而后置于一定溫度（50～130 ℃）與一定濕度（60%～80%）的環(huán)境中孵化稱為干法[12]。此方法適用于大分子多糖與蛋白質(zhì)的反應(yīng)。

干法以空氣作為反應(yīng)介質(zhì)，故存在糖基化速率較慢，反應(yīng)時(shí)間較長，且反應(yīng)底物容易接觸不均勻[19]等缺點(diǎn)。本文所篩選查閱的文章中，僅有兩項(xiàng)研究使用干法成功制備了酪蛋白糖基化復(fù)合物[20?21]?？傮w而言，大多研究制備酪蛋白糖基化復(fù)合物采用的是濕法，可能與實(shí)驗(yàn)條件較為簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)周期較短、實(shí)驗(yàn)可控性較強(qiáng)有關(guān)。

1.2.2 酶法糖基化 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶是酶法糖基化最常用的一種酶，其可以催化蛋白質(zhì)分子中谷氨酸殘基與賴氨酸殘基的ε-氨基之間發(fā)生反應(yīng)，在分子間和/或分子內(nèi)形成異肽鍵。伯胺類物質(zhì)與賴氨酸殘基具有相似結(jié)構(gòu)，例如具有伯胺活性的殼寡糖[22]，故使用殼聚糖制備酪蛋白糖基化復(fù)合物時(shí)，多采用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化。

該種方法效率高、安全性高、特異性高、糖類接枝度高[23]。較于美拉德反應(yīng)，酶法突出優(yōu)點(diǎn)有：a.反應(yīng)條件溫和，不涉及高溫加熱，很大程度上保護(hù)了酪蛋白的天然結(jié)構(gòu)；b.特異性高，專一催化酰基轉(zhuǎn)移的反應(yīng)，產(chǎn)物單純；c.安全性高，不會(huì)發(fā)生降解重排而產(chǎn)生有害副產(chǎn)物，如AGEs。

已有多項(xiàng)研究在低溫條件下、短時(shí)間內(nèi)利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶對(duì)酪蛋白進(jìn)行專一性修飾，制備了殼寡糖-酪蛋白復(fù)合物[24?26]。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化酪蛋白中的谷氨酰胺殘基與殼聚糖上的氨基發(fā)生?；D(zhuǎn)移反應(yīng)，使得酪蛋白與殼聚糖交聯(lián)。但該種方法會(huì)不可避免地讓酪蛋白分子內(nèi)或分子間發(fā)生反應(yīng)形成異肽鍵。故轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化蛋白質(zhì)糖基化的研究目前仍處于基礎(chǔ)研究階段，還未大規(guī)模推廣。值得注意的是，此法僅限于殼寡糖與酪蛋白的交聯(lián)，因?yàn)樯形窗l(fā)現(xiàn)其它具有伯胺活性的糖類對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行糖基化改性。

1.3 非共價(jià)連接糖基化反應(yīng)

不論是非酶法糖基化還是酶法糖基化，糖鏈均以共價(jià)鍵連接到酪蛋白的ε-氨基或α-氨基上。物理相互作用則可以使二者通過非共價(jià)鍵相互交聯(lián)形成復(fù)合物，其接枝度、物化性質(zhì)、生理功能等特性與共價(jià)連接的糖基化復(fù)合物存在一定差異。

劉郁琪[27]將酪蛋白與不同酯化度的果膠溶液混合反應(yīng)，酸性滴定制備出可溶性復(fù)合物，分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果證實(shí)，靜電相互作用力主導(dǎo)了酪蛋白與果膠的結(jié)合。但該研究并未具體指出靜電作用力結(jié)合而成的酪蛋白糖基化復(fù)合物與共價(jià)連接糖基化產(chǎn)物的特性差異及功能差異，這一方面還有待更多研究闡明。

1.4 糖基化反應(yīng)的影響因素

關(guān)于影響因素，目前探討得最多的酪蛋白糖基化反應(yīng)是美拉德反應(yīng)。其影響反應(yīng)的因素有很多，包括底物類別、反應(yīng)環(huán)境（溫度、pH、水分活度、含氧量）、催化劑及抑制劑（金屬、反應(yīng)抑制劑）等[28?29]。其中，在底物類別相同的情況下，反應(yīng)時(shí)間是影響反應(yīng)過程和蛋白質(zhì)糖基化程度的最關(guān)鍵的因素[30]。控制以上條件可以防止糖基化反應(yīng)發(fā)展到更高級(jí)的階段，從而防止有害成分AGEs的形成[31]。

1.4.1 底物類別 底物類別是影響酪蛋白糖基化的首要因素。醛糖中分子質(zhì)量較小的葡萄糖更容易與酪蛋白發(fā)生糖基化，且醛糖的糖基化程度顯著高于酮糖[3]。一般情況下，不同糖類反應(yīng)的簡(jiǎn)易性可以歸結(jié)為[32]：a.酮糖<醛糖；b.多糖<雙糖<己糖<戊糖<丁糖<丙糖。所以，還原糖種類是影響酪蛋白糖基化生成熒光性AGEs最重要的影響因素，其次為時(shí)間、溫度[11]。故選擇合適的糖基種類是高效生產(chǎn)安全的糖基化酪蛋白的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。

為了說明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)對(duì)反應(yīng)時(shí)間的影響，Akio等[33]和Nakamura等[34]分別研究了α-酪蛋白和溶菌酶與半乳甘露聚糖形成共軛物的時(shí)間。α-酪蛋白是一種具有柔性結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，很容易與糖類形成共軛物，結(jié)果顯示，α-酪蛋白的四個(gè)賴氨酸殘基與多糖反應(yīng)只需不到24 h。相反，溶菌酶作為一種球狀蛋白，形成共軛物的速度很慢。兩周之后，僅有兩個(gè)賴氨酸殘基與多糖連接。糖基化反應(yīng)底物有糖基與蛋白質(zhì)，二者種類不同均會(huì)影響糖基化進(jìn)程。酪蛋白具有的柔性結(jié)構(gòu)使其較容易發(fā)生糖基化反應(yīng)，是糖基化底物的優(yōu)良選擇。同時(shí)產(chǎn)品研發(fā)還需要根據(jù)改性需求及糖基化程度選擇合適的糖基種類，以制備出高質(zhì)量的酪蛋白改性產(chǎn)品。

1.4.2 水分活度 由于反應(yīng)物在水環(huán)境中的稀釋效應(yīng)，通常，糖基化反應(yīng)在干熱條件下進(jìn)行的速度比在水環(huán)境中進(jìn)行的速度更快。且有研究表明，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在溶液中加熱或在干燥狀態(tài)下加熱時(shí)，β-乳球蛋白的乳糖化位點(diǎn)不同。在溶液中加熱時(shí)，47Lys[35]和100Lys[36]優(yōu)先被乳糖糖基化，而47Lys和91Lys在干燥狀態(tài)下加熱時(shí)被乳糖糖基化[37]。即水分活度還影響著糖基化反應(yīng)的部位特異性，不同的反應(yīng)位點(diǎn)是否會(huì)影響酪蛋白的改性結(jié)果是值得思考的。

1.4.3 金屬、反應(yīng)抑制劑 金屬離子和反應(yīng)抑制劑對(duì)糖基化反應(yīng)的影響也不容忽視。硫酸鋅和氯化銅可以促進(jìn)木糖和酪蛋白水解物的糖基化反應(yīng)[15]，且木糖糖基化顯著提高了酪蛋白水解物的抗氧化活性，提高程度具有硫酸鋅和氯化銅的濃度依賴性。雖然該研究選用了二價(jià)和三價(jià)金屬離子，但只有Zn2+、Cu3+的數(shù)據(jù)，不足以說明所有的金屬離子是否會(huì)有相似的促進(jìn)作用，需要更多其他離子如Fe3+、Na+的研究。Akillioglu等[21]首次對(duì)卵清蛋白的葡萄糖糖基化動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果表明，鈣和單寧酸的存在均顯著抑制了干燥狀態(tài)下卵清蛋白-葡萄糖產(chǎn)物的形成。此外，鈣在干燥狀態(tài)和溶液條件下都會(huì)以混合非競(jìng)爭(zhēng)方式抑制糖基化反應(yīng)，而單寧酸僅在干燥狀態(tài)下以純非競(jìng)爭(zhēng)方式抑制糖基化反應(yīng)。

研究顯示，大豆異黃酮可以作為糖基化反應(yīng)抑制劑顯著抑制糖鏈與大豆蛋白的結(jié)合[38]。今后還需要進(jìn)一步研究分析大豆異黃酮或是其他多酚類物質(zhì)是否會(huì)影響酪蛋白糖基化反應(yīng)進(jìn)程，因?yàn)楝F(xiàn)有研究尚未發(fā)掘其對(duì)大豆蛋白的抑制機(jī)制。

2 糖基化酪蛋白的體外功能探究

糖基化反應(yīng)已被證明可以從多方面影響酪蛋白的功能活性（圖2），本文主要從體外功能與體內(nèi)活性展開討論。

圖2 糖基化酪蛋白功能活性變化趨勢(shì)Fig.2 Changes in the functional properties of glycosylated casein

2.1 糖基化對(duì)酪蛋白凝膠特性的影響

蛋白質(zhì)凝膠是一種重要的食品體系，由于其具備良好的質(zhì)構(gòu)與感官特性，還常常作為一種智能的活性物質(zhì)包埋載體，實(shí)現(xiàn)物質(zhì)在體內(nèi)的可控釋放。蛋白質(zhì)凝膠已在食品、化妝品及其它相關(guān)的化工領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。酪蛋白水凝膠能夠?qū)Χ喾N材料如鈦、木頭、塑料、玻璃、橡膠和皮膚等產(chǎn)生強(qiáng)力粘結(jié)作用[39]。現(xiàn)有研究顯示糖基化修飾將會(huì)對(duì)酪蛋白的凝膠性能產(chǎn)生明顯影響。

研究結(jié)果顯示，殼寡糖與葡萄糖形成的酪蛋白糖基化復(fù)合物的膠凝時(shí)間縮短[25,40]、凝膠強(qiáng)度增加、凝膠持水性增加[18]，這可能與凝膠結(jié)構(gòu)變?yōu)榫o密有關(guān)。葛偉等[18]指出超聲輔助美拉德反應(yīng)可以顯著提高酪蛋白的凝膠強(qiáng)度（1.16倍）和持水性（1.39倍）；Bi等[7]通過同樣方法得到的糖基化酪蛋白具有最高的持水能力67.81%±1.72%，凝膠強(qiáng)度165.05±2.72 g。超聲預(yù)處理使得酪蛋白糖基化復(fù)合物空隙小而密，尺寸更均勻，引起的酪蛋白結(jié)構(gòu)變化包括疏水基團(tuán)暴露以及β-折疊結(jié)構(gòu)增加[7]。值得注意的是，凝膠強(qiáng)度會(huì)隨著超聲波的預(yù)處理時(shí)間延長而降低，因?yàn)殚L時(shí)間超聲波處理會(huì)使酪蛋白變性而難以形成凝膠。

酪蛋白糖基化復(fù)合物持水性的提高以及凝膠強(qiáng)度的增加得益于凝膠微觀結(jié)構(gòu)的顯著變化[40]，糖基化反應(yīng)時(shí)間越長，越有利于酪蛋白凝膠結(jié)構(gòu)趨于緊密。合適的糖基種類（殼寡糖、葡萄糖等）對(duì)酪蛋白膠凝也十分重要，而其它糖基種類（如乳糖、木糖、果糖等）對(duì)酪蛋白凝膠性質(zhì)影響的研究數(shù)據(jù)尚少。

2.2 糖基化對(duì)酪蛋白乳化性的影響

關(guān)于酪蛋白糖基化后乳化活性、乳化穩(wěn)定性變化的研究結(jié)果有較多出入。徐世濤[3]、葛偉[18]等認(rèn)為葡萄糖-酪蛋白糖基化復(fù)合物的乳化活性有所提高，而崔心禹[23]、宋春麗[40]、樊永康[41]等認(rèn)為殼寡糖-酪蛋白糖基化復(fù)合物的乳化活性呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。研究結(jié)果不一致可能是歸結(jié)于糖基的種類不同，即葡萄糖糖基化有潛力提升酪蛋白的乳化活性，而殼寡糖糖基化則會(huì)降低酪蛋白的乳化活性，這一結(jié)果也將為今后酪蛋白的糖基化改性方向起到一定指導(dǎo)性作用。

而葡萄糖、D-果糖、麥芽糊精、麥芽糖、葡聚糖、β-環(huán)糊精、乳糖、殼寡糖均會(huì)使酪蛋白的乳化穩(wěn)定性提高，其中酪蛋白-葡聚糖40000復(fù)合物的乳化穩(wěn)定性較酪蛋白提高85.91%[3]。但宋春麗等[40]研究結(jié)果顯示殼寡糖糖基化會(huì)使酪蛋白乳化穩(wěn)定性降低，這與實(shí)驗(yàn)方法相同的崔心禹[23]、樊永康[41]等的研究結(jié)果相悖。這可能是由于前者所用糖基化方法為酶法，容易導(dǎo)致酪蛋白分子間交聯(lián)，影響酪蛋白糖基化復(fù)合物的乳化穩(wěn)定性。未來研究可以考慮在分子水平探究其影響機(jī)制，從結(jié)合鍵類型、酪蛋白結(jié)構(gòu)的變化等角度討論糖基化對(duì)酪蛋白乳化性質(zhì)的影響。

產(chǎn)品開發(fā)方面，張鐵華等[42]利用低聚木糖-酪蛋白開發(fā)了一種乳化性能好、穩(wěn)定性高、蛋白含量高、色澤風(fēng)味良好天然大分子乳化劑。目前關(guān)于糖基化酪蛋白的產(chǎn)品研發(fā)較少，未來研究可考慮將前人科研成果轉(zhuǎn)化，推動(dòng)食品工業(yè)化發(fā)展。

2.3 糖基化對(duì)酪蛋白其他特性的影響

糖基化酪蛋白的理化特性研究并不止于上述研究較為廣泛的方面，還有學(xué)者提出了新的視角，如樊永康等[41]指出殼寡糖-酪蛋白復(fù)合物的熱穩(wěn)定性得到了增強(qiáng)；王小鵬等[24]經(jīng)過體外模擬消化發(fā)現(xiàn)酪蛋白-殼寡糖的水解度和三氯乙酸可溶性氮均低于酪蛋白，增多了消化物中的大分子肽段的數(shù)量。表明酶法糖基化一定程度上降低了酪蛋白的體外消化能力。崔心禹[23]、樊永康[41]等均認(rèn)為酪蛋白與殼寡糖交聯(lián)之后，酪蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)更為有序。這是由于酪蛋白本身的二級(jí)結(jié)構(gòu)比較松散，糖基化后會(huì)在分子內(nèi)部形成共價(jià)鍵，增加分子內(nèi)部的空間位阻，使分子結(jié)構(gòu)更為緊湊，這與酪蛋白糖基化復(fù)合物凝膠強(qiáng)度、持水性等凝膠特性的增強(qiáng)是一致的。宋春麗等[22]指出不同反應(yīng)時(shí)間下糖基化產(chǎn)物的表觀黏度均有顯著提高，表現(xiàn)出剪切稀釋的特性，且產(chǎn)物分散液由類固體性質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)轭惲黧w性質(zhì)。綜上可以看出酪蛋白經(jīng)糖基化后，結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變，進(jìn)而導(dǎo)致穩(wěn)定性、表觀黏度等理化特性產(chǎn)生不同程度變化。

酪蛋白作為生物活性肽在生物體內(nèi)發(fā)揮著巨大的作用，如營養(yǎng)供給、抗氧化、提高免疫活性等。近年來已有大量研究證據(jù)表明，糖基化可以從多個(gè)方面改變酪蛋白的體內(nèi)活性。

3 糖基化酪蛋白的體內(nèi)活性探究

3.1 糖基化對(duì)酪蛋白抗氧化性的影響

過量的活性氧會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激，并會(huì)攻擊細(xì)胞的生物分子，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid，DNA）。這種氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的損傷會(huì)破壞細(xì)胞膜的完整性以及損害細(xì)胞功能，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。

人體攝入酪蛋白后經(jīng)過胃蛋白酶、胰蛋白酶等蛋白水解酶產(chǎn)生酪蛋白酶解物進(jìn)行消化吸收[43]。探究人體吸收形式的酪蛋白酶解物能否通過糖基化改性是具有重要生理意義的。趙玉濱等[44]將酪蛋白酶解產(chǎn)物分別與葡萄糖、木糖、果糖進(jìn)行糖基化改性，發(fā)現(xiàn)在pH7.0時(shí)，木糖、果糖糖基化產(chǎn)物羥基自由基清除率達(dá)到最大，三種糖的糖基化使得酪蛋白酶解產(chǎn)物的抗氧化活性均高于未經(jīng)處理的酶解產(chǎn)物。通過清除1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl Free Radical，DPPH）自由基活性、還原能力、Fe2+螯合活性和卵磷脂氧化實(shí)驗(yàn)考察酪蛋白酶解產(chǎn)物各組分的抗氧化活性，也可以發(fā)現(xiàn)不同相對(duì)分子質(zhì)量的糖基化產(chǎn)物具有顯著不同的抗氧化活性[45]。現(xiàn)有研究已證實(shí)可以通過糖基化改性增強(qiáng)酪蛋白酶解物的抗氧化性，有望進(jìn)一步通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

Hwa等[46]指出糖基化后，酪蛋白的還原能力即清除DPPH自由基的能力顯著提高。有研究從細(xì)胞水平驗(yàn)證了酪蛋白糖基化產(chǎn)物的抗氧化活性，Jing等[14]指出葡萄糖-酪蛋白和果糖-酪蛋白可顯著降低Int-407細(xì)胞的抗氧化性超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽還原酶的活性，但是不會(huì)影響Caco-2細(xì)胞的抗氧化酶狀態(tài)。這個(gè)結(jié)果表明了酪蛋白的糖基化產(chǎn)物具有一定的細(xì)胞毒性，細(xì)胞毒性的程度因糖鏈種類以及細(xì)胞種類而不同。Oh等[47]用四甲基偶氮唑鹽比色法，發(fā)現(xiàn)糖基化產(chǎn)物抑制了HepG2細(xì)胞中還原型谷胱甘肽濃度的耗竭。HepG2細(xì)胞系是一種人肝癌細(xì)胞系，適合用于肝細(xì)胞代謝方面的研究。它保留了許多正常人類肝細(xì)胞特有的特殊功能[48]?，F(xiàn)有細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果局限于酪蛋白的抗氧化效果與指標(biāo)，缺乏糖基化對(duì)酪蛋白改性的具體機(jī)制（如影響二級(jí)結(jié)構(gòu)或三級(jí)結(jié)構(gòu)等）探究及改性后的酪蛋白糖基化復(fù)合物降低細(xì)胞抗氧化酶水平的通路機(jī)制探討。

3.2 糖基化對(duì)酪蛋白免疫原性的影響

在近些年，牛奶在一些西方國家的銷售量呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。除了個(gè)體的飲食習(xí)慣差異外，還有一個(gè)主要的因素是乳及乳制品容易造成食用者胃腸不適，嚴(yán)重者會(huì)休克甚至死亡?，F(xiàn)有研究結(jié)果表明糖基化改性并不能降低牛奶中酪蛋白的致敏性，反之還會(huì)增強(qiáng)其免疫原性及免疫反應(yīng)性。

楊崢[49]、夏薇等[20]研究了低聚半乳糖糖基化對(duì)重要過敏原αs1-酪蛋白的性質(zhì)影響，體外試驗(yàn)結(jié)果表明糖基化產(chǎn)物的抗原抗體結(jié)合常數(shù)較αs1-酪蛋白提高了3.7倍，即低聚半乳糖糖基化顯著提高了αs1-酪蛋白的免疫反應(yīng)性，進(jìn)一步地，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了糖基化產(chǎn)物可以顯著提高BALB/c小鼠血清中的特異性IgG水平，暗示了糖基化可以提高αs1-酪蛋白的免疫原性。但現(xiàn)在酪蛋白糖基化的反應(yīng)糖類探究限于低聚半乳糖，其他糖類是否會(huì)對(duì)酪蛋白的免疫原性產(chǎn)生相同影響以及增強(qiáng)其免疫原性的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

3.3 糖基化對(duì)酪蛋白免疫活性的影響

蛋白質(zhì)是機(jī)體免疫系統(tǒng)運(yùn)作和產(chǎn)生免疫應(yīng)答的物質(zhì)基礎(chǔ)與重要媒介，可以有效提高機(jī)體免疫應(yīng)答和特異性抗體的水平[50?51]，在促進(jìn)免疫器官發(fā)育、脾淋巴細(xì)胞增殖、降低遲發(fā)性過敏反應(yīng)發(fā)病率等方面均具有積極作用。

為了探究糖基化酪蛋白復(fù)合物對(duì)機(jī)體免疫狀況是否有改善作用，現(xiàn)已有體內(nèi)外的研究數(shù)據(jù)。有趣的是，乳糖化酪蛋白會(huì)降低酪蛋白水解物的體外免疫活性，而殼寡糖化酪蛋白可以增強(qiáng)酪蛋白水解物的體外免疫調(diào)節(jié)能力，激活淋巴細(xì)胞、免疫細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等細(xì)胞[52]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，酪蛋白酶解產(chǎn)物及糖基化酪蛋白酶解產(chǎn)物均可以顯著改善小鼠的免疫狀況[8]，血清生化指標(biāo)提高，免疫器官指數(shù)、免疫球蛋白質(zhì)量濃度、脾淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)、自然殺傷細(xì)胞活力等指標(biāo)均有顯著的提升趨勢(shì)。但是酪蛋白酶解產(chǎn)物比糖基化酪蛋白酶解產(chǎn)物顯示出了更好的免疫提升活性，即酪蛋白經(jīng)美拉德反應(yīng)與乳糖發(fā)生糖基化后可能會(huì)降低蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物的免疫活性。這可能與乳糖化酪蛋白水解物種賴氨酸的丟失有關(guān)[52]，因?yàn)樵诜治霭被岷繒r(shí)，僅發(fā)現(xiàn)乳糖化酪蛋白水解物中賴氨酸、組氨酸、酪氨酸和纈氨酸含量的減少，而殼寡糖化酪蛋白水解物無此現(xiàn)象。

腸道屏障與免疫系統(tǒng)的平衡息息相關(guān)，在抵抗外來抗原入侵方面起到非常重要的作用。朱必洋[26]指出殼寡糖—酪蛋白磷酸肽能維持回腸絨毛的結(jié)構(gòu)完整性和正常的結(jié)構(gòu)形態(tài)，且有效發(fā)揮益生元作用，促進(jìn)丁酸等短鏈脂肪酸的合成，維護(hù)腸道健康。但該研究并未設(shè)置酪蛋白磷酸肽的對(duì)照組，故無法評(píng)估殼寡糖化對(duì)酪蛋白磷酸肽免疫活性的影響趨勢(shì)。

3.4 糖基化對(duì)酪蛋白緩釋包埋物的影響

許多小分子或礦物質(zhì)在體內(nèi)的可控釋放需要載體遞送，日前對(duì)于智能化載體的研究熱度不減，不少研究人員也探討了糖基化酪蛋白作為遞送載體的潛力。樊永康等[53]指出經(jīng)過殼寡糖糖基化之后能顯著提高酪蛋白對(duì)槲皮素的包埋效果及保護(hù)效果，同時(shí)還可以保持和/或提高槲皮素的穩(wěn)定性和水溶性，有望作為其他的多酚類物質(zhì)的優(yōu)質(zhì)載體。

酪蛋白糖基化產(chǎn)物對(duì)色素的負(fù)載能力也較為可觀，劉郁琪[27]發(fā)現(xiàn)果膠—酪蛋白對(duì)姜黃素的負(fù)載率最大可達(dá)96%，可實(shí)現(xiàn)緩釋姜黃素的緩釋，同時(shí)顯著提高姜黃素的生物利用率，從31.6%提高至79.1%。閔敏[54]指出卡拉膠—酪蛋白與羧甲基殼聚糖—酪蛋白可以包埋辣椒紅素，有效防止胃蛋白酶消化辣椒紅色素，并使其在腸道中迅速釋放。其中，酪蛋白糖基化后提高包埋物質(zhì)的生物利用率的功能還有進(jìn)一步探討的必要，其作用是歸因于包埋物質(zhì)的緩釋還是由于糖基化酪蛋白復(fù)合物作用于小腸吸收細(xì)胞，或是其他途徑，還需要新的研究數(shù)據(jù)補(bǔ)充。

朱必洋[26]通過酶法糖基化與非酶法糖基化制備了兩種殼寡糖—酪蛋白磷酸肽復(fù)合物作為鈣質(zhì)載體，發(fā)現(xiàn)兩種鈣遞送體系均能可以促進(jìn)Caco-2細(xì)胞對(duì)Ca2+的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收，體內(nèi)研究證明兩種鈣遞送體系均可顯著提高小鼠骨骼的抗疲勞能力，并降低其骨質(zhì)疏松的發(fā)生率，暗示了此載體對(duì)Ca2+的良好遞送能力，但該研究并未對(duì)釋放速度即載體智能化水平進(jìn)行評(píng)估，未來研究可著眼于糖基化酪蛋白的可控緩釋能力，減輕骨質(zhì)疏松患者長期頻繁用藥的不便。

基于以往研究結(jié)果，本文總結(jié)了不同方法及糖基種類對(duì)糖基化酪蛋白功能特性的影響（表1），為今后的研究提供系統(tǒng)性理論數(shù)據(jù)。

表1 不同方法及糖基種類對(duì)糖基化酪蛋白功能特性的影響Table 1 Functional effect of different methods and glycosyl types on casein glycosylation

4 結(jié)論與展望

酪蛋白是乳源的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)之一，在改善機(jī)體功能、調(diào)節(jié)食品質(zhì)地等方面具有重要意義。隨著酪蛋白制備加工和修飾研究的不斷深入，酪蛋白的應(yīng)用前景越來越廣闊。面對(duì)全球?qū)κ澄餇I養(yǎng)要求和感官品質(zhì)的提高，選擇合適的方法對(duì)酪蛋白進(jìn)行改性是非常必要的，對(duì)提高酪蛋白的商業(yè)價(jià)值有重要意義。本文綜述了酪蛋白糖基化方法及對(duì)其體內(nèi)外性質(zhì)的影響，闡明了酪蛋白糖基化復(fù)合物改性效果及可能的改性機(jī)制。糖基化的酪蛋白結(jié)構(gòu)趨于緊密，從而顯著提升凝膠、乳化等體外功能，更引人注意的是可以改變抗氧化性、免疫原性、改善機(jī)體免疫以及作為物質(zhì)載體等生理功能，但大都停留在效果層面，具體機(jī)制的深入研究尚少。糖基化在保持酪蛋白原有優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上，賦予了它更多的可能，也為人們更好地利用酪蛋白提供了一個(gè)新思路，酪蛋白糖基化產(chǎn)物也因其可獲得性與豐富的生物活性具有相當(dāng)?shù)纳鐣?huì)經(jīng)濟(jì)學(xué)意義。

但目前的研究結(jié)果均存在著一定的局限性，結(jié)合現(xiàn)實(shí)生產(chǎn)中存在的問題，未來的研究方向可以從這幾個(gè)方面進(jìn)行考慮：a.當(dāng)前研究大多著眼于糖基化對(duì)酪蛋白理化性質(zhì)及功能特性的體外研究，較少研究者采用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)評(píng)估糖基化對(duì)酪蛋白的營養(yǎng)利用度、毒理性的影響；b.美拉德反應(yīng)即非酶法糖基化容易產(chǎn)生不想要的副產(chǎn)物，且反應(yīng)條件對(duì)蛋白質(zhì)活性不太友好，需要開發(fā)新方法對(duì)美拉德反應(yīng)進(jìn)程進(jìn)行精準(zhǔn)阻斷，保證糖基化的程度的同時(shí)減少有害副產(chǎn)物的生成；c.酶法糖基化所用的酶制劑價(jià)格通常比較昂貴，增加了生產(chǎn)成本，不適于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)糖基化酪蛋白，有必要研發(fā)其他方法聯(lián)合使用，例如利用物理方法、微生物方法等，在保證糖基化交聯(lián)度的同時(shí)降低成本；d.較少研究指出糖基化對(duì)酪蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)、高級(jí)結(jié)構(gòu)的影響以及結(jié)構(gòu)變化與功能活性變化之間的關(guān)聯(lián)，未來可以探究糖基化酪蛋白功能活性改變的機(jī)制原理，有利于開發(fā)出具有獨(dú)特功能特性的酪蛋白產(chǎn)品。