綠帶妒尺蛾對寄主的趨性選擇及寄主植物葉片的化學成分分析

杜 燚，楊衛(wèi)誠，何琴琴，翁 濤，肖佳興，楊 姣

（1.貴州師范大學 生命科學學院 貴州師范大學喀斯特洞穴研究中心，貴州 貴陽 550025；2.貴州赤水桫欏國家級自然保護區(qū)管理局，貴州 赤水 564700）

在昆蟲與植物的關(guān)系中，植物化學成分、形態(tài)特征和各種環(huán)境因子等影響著昆蟲對寄主選擇，其中寄主植物釋放的揮發(fā)性物質(zhì)起著關(guān)鍵的作用[1]。植物的特異性化學物質(zhì)誘導昆蟲產(chǎn)生多種行為，如寄主定向、產(chǎn)卵行為、取食行為等[2]。研究植食性昆蟲對寄主植物氣味的趨性有助于了解植食性昆蟲寄主選擇的機制[3]，探索新的害蟲防控措施，在利用天然活性物質(zhì)、抗蟲育種和生物防治中具有積極意義[4]。大量文獻報道：昆蟲利用植物所釋放的化學信號物質(zhì)進行寄主定向。如馬鈴薯甲蟲Leptinotarsa decemlineata依靠馬鈴薯Solanum tuberosum葉片氣味產(chǎn)生定向選擇[5]，十字花科Brassicaceae所釋放的芥子油對小菜蛾P(guān)lutella xylostella具有吸引作用[6]，寄主白菜Brassica pekinensis氣味對桃蚜Myzus persicae有明顯的引誘作用[7]，煙草甲Lasioderma serricorne對不同辣椒Capsicum annuum揮發(fā)物表現(xiàn)出極顯著的趨向作用[8]。根據(jù)纓翅目Thysanoptera薊馬科Thripidae昆蟲借助植物氣味尋找寄主的特性，將煙堿乙酸酯和苯甲醛混合在一起制成誘芯在田間使用，能夠準確預(yù)測花薊馬的發(fā)生及為害時期，并且能大量誘殺薊馬成蟲[9]。天牛科Cerambycidae、郭公甲科Cleroidea、象甲科Curculionidae和小蠹蟲科Scolytidae的昆蟲能被松針葉的揮發(fā)物α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯和莰烯所引誘[10]。但有關(guān)寄主植物氣味是否對綠帶妒尺蛾P(guān)hthonoloba viridifasciata存在引誘作用還未見報道。

綠帶妒尺蛾隸屬于鱗翅目Lepidoptera尺蛾科Geometridae，是桫欏Alsophila spinulosa和小黑桫欏Alsophila metteniana的食葉昆蟲之一[11]。在貴州赤水桫欏國家級自然保護區(qū)內(nèi)1 a發(fā)生4～5代，幼蟲以取食嫩葉為主，蟲害暴發(fā)期，可將嫩葉和成葉取食殆盡，嚴重影響了桫欏的正常發(fā)育和繁殖[12]。桫欏和小黑桫欏隸屬于桫欏科Cyatheaceae桫欏屬Alsophila蕨類植物，其中桫欏是世界瀕危植物[13?14]、中國二級珍惜保護植物[15]。目前桫欏和小黑桫欏對綠帶妒尺蛾有效防治研究較少。避免使用化學農(nóng)藥帶來的問題，尋找綠色的防控措施對促進有害生物的可持續(xù)控制意義重大[16]。研究綠帶妒尺蛾幼蟲對桫欏和小黑桫欏的趨向行為和寄主植物葉片的化學成分，能為桫欏和小黑桫欏的蟲害防控篩選合適的引誘劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

綠帶妒尺蛾幼蟲采自貴州赤水桫欏國家級自然保護區(qū)。將野外在桫欏上采集到的初孵幼蟲放置于SPX型智能生化培養(yǎng)箱(SPX-280，寧波江南儀器廠)內(nèi)飼喂成2齡幼蟲，飼養(yǎng)條件：溫度(26±1) ℃，相對濕度為 (70±10)%，光周期為 14 h 光照/10 h 黑暗 (7:00—20:00為光照期，20:00—7:00為黑暗期)。預(yù)實驗表明：初孵幼蟲活動能力弱，而幼蟲蟲齡越大，由于取食經(jīng)歷會形成記憶對飼養(yǎng)植物偏愛，故選擇2齡幼蟲進行饑餓處理(24 h)作為待測幼蟲。

1.2 材料

直徑12.0 cm的培養(yǎng)皿、直徑1.5 cm的打孔器、綠色濾紙、鑷子、圓形濾紙、養(yǎng)蟲盒(長14.3 cm×寬 8.5 cm×高 4.0 cm)、黑色塑料薄膜、正己烷有機溶劑 (天津市科密歐化學試劑有限公司)、HP6890/5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀GC/MS(美國安捷倫公司)、150 mL錐形瓶、膠頭滴管等。

1.3 供試植物

采樣點位于貴州赤水桫欏國家級自然保護區(qū)內(nèi)大水溝 (28°25′10.69″N，106°01′14.85″E)，海拔為 614 m。供試植物為桫欏、小黑桫欏、中華復葉耳蕨Arachniodes chinensis和腎蕨Nephrolepis auriculata。將野外采集到的當年生新鮮葉片帶回室內(nèi)低溫保存，測定前將4種蕨類植物嫩葉用蒸餾水沖洗干凈后，打孔器制作成1.5 cm大小的植物葉碟。對照為非寄主植物中華復葉耳蕨和腎蕨，以及綠色葉碟(外形與桫欏和小黑桫欏葉碟大小相同的綠色濾紙)。

1.4 方法

1.4.1 綠帶妒尺蛾幼蟲對植物葉碟與綠色葉碟的趨性選擇 光照和黑暗條件下，桫欏和小黑桫欏葉碟分別與綠色葉碟組合，各取2片葉碟共4個處理，1次1頭，每處理重復測定60頭。

1.4.2 綠帶妒尺蛾幼蟲對不同蕨類植物的趨性選擇 黑暗條件下，桫欏和小黑桫欏分別與腎蕨和中華復葉耳蕨組合，共4個處理，1次1頭，每處理重復測定50頭；桫欏和小黑桫欏配對，各取2片葉碟，1次1頭，重復測定65頭。

1.4.3 綠帶妒尺蛾幼蟲在4種蕨類植物共存時的趨性選擇 黑暗條件下，4種蕨類植物共存時，各取2片葉碟，“十字”交叉等距離放置于培養(yǎng)皿底部邊緣，共1個處理，1次1頭，重復測定120頭。

1.5 生物測定

利用培養(yǎng)皿[17]測定綠帶妒尺蛾幼蟲對不同葉碟的選擇頻次。選用直徑為12.0 cm的培養(yǎng)皿，在底部鋪墊相同直徑的圓形濾紙，測定前在濾紙上均勻噴灑少量蒸餾水保濕。將制作好的葉碟(圖1)放置，以“十”字交叉排列等距離放在培養(yǎng)皿的底部邊緣。放置完成后，在培養(yǎng)皿中央接入1頭已饑餓的綠帶妒尺蛾幼蟲，以幼蟲接觸葉碟并停留(3 min)作為選擇的標準(一直停留在待選擇區(qū)域的幼蟲則記為無效選擇，不計數(shù))，每頭觀察15 min，記錄觀察幼蟲對不同葉碟的趨向選擇情況，每次測定結(jié)束后更換新的試蟲，并清理培養(yǎng)皿中的實驗材料，蒸餾水清洗干燥后用于下次測定[18]。

圖1 綠帶妒尺蛾幼蟲趨向選擇裝置Figure 1 Selection device for larvae of P.viridifasciata

整個實驗在室內(nèi)進行，測定時間為13:00—17:00。黑暗條件將培養(yǎng)皿用黑色塑料薄膜遮蓋。

1.6 桫欏和小黑桫欏揮發(fā)物化學成分分析

1.6.1 樣品制定 稱取 5 g 桫欏和小黑桫欏新鮮嫩葉，分別放置于 150 mL 錐形瓶中。用膠頭滴管提取10 mL的正己烷加入瓶中浸濕葉片，同時每間隔5 min振蕩1次，30 min后加入2 mL的正己烷(分3次潤洗)經(jīng)無水硫酸鈉過濾，獲得粗提物。重復3次。放入?20 ℃的冰箱內(nèi)密封低溫保存。進樣前，用99.99%的高純氮氣濃縮至1 mL。

1.6.2 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù) (GC-MS)分析 使用 HP6890/5975C 氣質(zhì)聯(lián)用儀 GC/MS(美國安捷倫公司)對2種桫欏植物嫩葉粗提物樣品進行化學成分分析。色譜柱為Agilent HP-5MS(60 m×0.25 mm×0.25 μm)彈性石英毛細管柱，初始溫度 70 ℃(保留 2 min)，以 5 ℃·min?1升溫至 110 ℃，再以 10 ℃·min?1升溫至310 ℃，運行時間為45 min；汽化室溫度為250 ℃；載氣為高純氦氣(99.999%)；柱前壓為0.127 5 MPa，載氣流量為1.0 mL·min?1，不分流，溶劑延遲時間為6 min。離子源為電子轟擊離子源(EI)，離子源溫度為230 ℃；四極桿溫度為150 ℃；電子能量為70 eV；發(fā)射電流為34.6 μA；倍增器電壓為1 729V；接口溫度為280 ℃；質(zhì)量范圍為29～500。

1.7 數(shù)據(jù)處理

用Excel統(tǒng)計數(shù)據(jù)，用R語言進行數(shù)據(jù)分析，使用卡方檢驗比較綠帶妒尺蛾幼蟲對不同處理的趨性選擇，用Origin 2021作圖。對總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜計算機數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對Nist17和Wiley275標準質(zhì)譜數(shù)據(jù)，用峰面積歸一化法測定了各化學成分的相對含量。選擇率=(選擇蟲數(shù)/測試蟲總數(shù))×100%[10]

2 結(jié)果與分析

2.1 綠帶妒尺蛾幼蟲對植物葉碟的趨性選擇

如表1所示：無論在光照或黑暗條件下，綠帶妒尺蛾幼蟲對2種蕨類植物葉碟的選擇頻次均極顯著大于對綠色葉碟的選擇頻次(P＜0.01)，說明寄主植物氣味可對綠帶妒尺蛾幼蟲產(chǎn)生引誘作用。光照環(huán)境下對桫欏和小黑桫欏的選擇率略低于黑暗環(huán)境下的選擇率，可能是在視覺作用下，綠帶妒尺蛾幼蟲被外形相似的綠色葉碟所“蒙騙”，導致光照條件下選擇綠色葉碟的頻次略大于在黑暗下的選擇頻次，視覺可能在寄主選擇中也發(fā)揮著一定得作用。

表1 綠帶妒尺蛾幼蟲對桫欏和小黑桫欏葉碟的趨性選擇Table 1 Selection frequencies of P.viridifasciata larvae towards A.spinulosa and A.metteniana leaf discs respectively

2.2 綠帶妒尺蛾幼蟲對不同蕨類植物的趨性選擇

由表2顯示：黑暗條件下，綠帶妒尺蛾幼蟲對桫欏分別與中華復葉耳蕨、腎蕨組合，小黑桫欏分別與中華復葉耳蕨、腎蕨組合的趨性選擇均差異極顯著(P＜0.01)，說明綠帶妒尺蛾幼蟲能依靠寄主植物氣味信息準確識別寄主。綠帶妒尺蛾幼蟲對桫欏和小黑桫欏的選擇頻次無顯著差異(P＞0.05)，說明2種植物的氣味都可以對綠帶妒尺蛾幼蟲產(chǎn)生一定的吸引作用。

表2 綠帶妒尺蛾幼蟲在不同蕨類植物比較時的選擇頻次Table 2 Selection frequencies of P.viridifasciata larvae towards combinations of different ferns

2.3 綠帶妒尺蛾幼蟲在4種蕨類植物共存時的趨性選擇

如表3所示：黑暗條件下，在4種蕨類葉碟共存時，綠帶妒尺蛾幼蟲對不同蕨類葉碟的選擇頻次差異顯著(P＜0.05)，其中對桫欏的選擇頻次最高，占總頻次的38.3%。這說明在多植物環(huán)境下，綠帶妒尺蛾幼蟲可以準確判斷最適宜的寄主植物，桫欏葉片所釋放的揮發(fā)物對綠帶妒尺蛾幼蟲的定向選擇具有更強烈的引誘作用。

表3 綠帶妒尺蛾幼蟲在 4 種蕨類植物共存條件下的選擇反應(yīng)Table 3 Selection responses of P.viridifasciata larvae towards different ferns presented together

2.4 桫欏和小黑桫欏植物化學成分

通過GC-MS分析得到桫欏和小黑桫欏嫩葉浸提物的總離子流圖TIC(圖2)。初步確定2種桫欏的化學組分主要是烴類、醇類、醛類等，共檢測出34種化合物。其中桫欏的化合物成分有23種，小黑桫欏的化合物成分有19種，同時2種桫欏共有物質(zhì)有8種。由表4可知：2種桫欏的主要成分為烴類，桫欏中相對含量最高的是二十五烷(7.75%)，小黑桫欏相對含量最高的是正二十七烷(8.84%)。其次是醇類，桫欏有5種，小黑桫欏2種，桫欏和小黑桫欏共有γ-谷甾醇、豆甾烷醇，γ-谷甾醇(5.25%)和豆甾烷醇(8.21%)在小黑桫欏的揮發(fā)性成分中所占比例要高于桫欏，而葉醇(3.04%)僅在桫欏中存在。醛類、有機酸類、脂類、胺類在桫欏和小黑桫欏中的相對含量均相對較低，對甲氧基肉桂酸辛酯在桫欏中的相對含量僅有0.35%，庚醛在小黑桫欏中的相對含量僅為0.1%。說明在化合物組成上，桫欏和小黑桫欏既存在相似性，同時也具有一定的差異性。

表4 寄主植物葉片浸提物成分分析Table 4 Analysis of chemical compounds of leaf extractive substances from host plants

圖2 桫欏和小黑桫欏嫩葉浸提物總離子流圖Figure 2 Total ion current diagram of the young leaves of A.spinulosa and A.metteniana

3 討論

植物揮發(fā)性物質(zhì)是一類組成復雜、分子量為100～200的混合物質(zhì)，主要包括烷烴類、醇類、醛類、酸類等，并以一定的比例組成植物獨有的化學指紋圖譜對植食性昆蟲產(chǎn)生嗅覺刺激[19]。本研究發(fā)現(xiàn)：桫欏和小黑桫欏葉片具有相似的化學指紋圖譜，化合物成分組成都以烴類為主，其次是醇類、醛類、酸類、脂類等。植物揮發(fā)物在植食性昆蟲寄主選擇中發(fā)揮著重要作用[20]。植食性昆蟲依據(jù)植物揮發(fā)物對特定植物進行定向選擇，最終識別寄主植物進行取食或產(chǎn)卵[21]。本研究發(fā)現(xiàn)：在光照和黑暗環(huán)境下，桫欏和小黑桫欏分別與綠色葉碟組合時，綠帶妒尺蛾幼蟲對桫欏和小黑桫欏有明顯的趨向選擇，可見桫欏和小黑桫欏釋放的氣味對綠帶妒尺蛾幼蟲有引誘作用。植食性昆蟲在寄主選擇時，視覺和嗅覺發(fā)揮著重要作用[22]。如蘋果實蠅Rhagoletis pomonella尋找寄主植物時，嗅覺會與視覺相互作用[23]。在光照條件下，寄主植物和綠色葉碟共存時，盡管外形相似，綠帶妒尺蛾幼蟲依然可以準確選擇寄主植物。

植物揮發(fā)物作為引導植食性昆蟲的一種利他素，為植食性昆蟲—植物二級營養(yǎng)關(guān)系建立過程中的信息化學物[24]。植食性昆蟲憑借植物的化學圖譜識別寄主植物和非寄主植物[25]。在一定距離內(nèi)，昆蟲通過嗅覺感官感知濃度達到一定閾值水平的化合物組成所代表的植物信息[26]。本次研究表明：當寄主植物和非寄主植物對比時，綠帶妒尺蛾幼蟲可以準確識別寄主植物，說明幼蟲可被寄主植物所吸引[27]。如曹鳳勤等[28]研究B型粉虱Bemisia tabaci對不同植物揮發(fā)物的行為反應(yīng)結(jié)果表明：寄主植物揮發(fā)物對其有明顯引誘作用。黃胸薊馬Thrips hawaiiensis對寄主植物揮發(fā)物有特殊偏好[29]。荔枝Litchi chinensis葉片氣味對粗脛翠尺蛾Thalassodes immissaria具有導向作用[30]。當2種寄主植物對比時，綠帶妒尺蛾幼蟲對兩者的選擇并無差異，可能同為桫欏屬蕨類植物，兩者在化合物組成和含量上存在相似性。本研究通過GCMS分析桫欏和小黑桫欏葉片的化合物成分證實，2種桫欏共有8種化合物。

從進化的角度來看，昆蟲面臨著強大的選擇壓力，如在尋找寄主時，往往要面對復雜的氣味環(huán)境[31]。昆蟲的感覺系統(tǒng)和搜索機制已經(jīng)進化到處理復雜的化學物質(zhì)，從而有效地定位合適的宿主來最大化自身的適應(yīng)性[32]。如在6種植物共存時，煙葉蛾初孵幼蟲可準確識別最適宜寄主植物煙草Nicotiana tabacum[33]。本研究中，在4種蕨類都存在時，綠帶妒尺蛾幼蟲可準確識別最適宜寄主植物桫欏，說明對寄主氣味存在高度的特異性和敏感性[34]。在桫欏中存在的葉醇具有一定的青草氣味，同時也作為昆蟲警報、集合利用的信息素，并且還可作為防御、忌避、通信和環(huán)境安全的重要工具[35?36]，這可能是綠帶妒尺蛾幼蟲更趨向桫欏的原因之一。同時，在鱗翅目昆蟲中，由于幼蟲活動能力受限，主要依賴于成蟲對寄主植物的產(chǎn)卵選擇[37]，如產(chǎn)卵假說認為雌性成蟲更容易將卵產(chǎn)在有利于后代發(fā)育的寄主植物上[38]。田間采集情況發(fā)現(xiàn)，幼蟲主要集中分布在桫欏葉上，但成蟲具體如何產(chǎn)卵選擇，還需進一步研究。

4 結(jié)論

綠帶妒尺蛾幼蟲鑒別寄主植物和非寄主的能力較強，能被桫欏和小黑桫欏所吸引，同時桫欏釋放的揮發(fā)物對其具有更強烈的引誘作用。GC-MS結(jié)果顯示：在桫欏中存在的葉醇和壬醛有望作為綠帶妒尺蛾的引誘劑成分。