芒柄花素對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響及其機制

盧迎宏 王丹 井海云 王夢超 包曉青

(鄭州大學附屬鄭州中心醫(yī)院心血管內科，河南 鄭州 450007)

心血管疾病在全球范圍內均具有較高的病死率，其中急性心肌梗死發(fā)病極其兇險，多數(shù)患者預后不良〔1〕。目前主要通過溶栓、經皮冠狀動脈介入等手段恢復血流，但臨床觀察發(fā)現(xiàn)，心肌缺血后再恢復灌注時，部分患者表現(xiàn)出心肌缺血癥狀加重，甚至出現(xiàn)大面積壞死的現(xiàn)象，即心肌缺血再灌注損傷〔2〕。因此，減少心肌缺血再灌注損傷是臨床醫(yī)學亟待解決的重難點。芒柄花素是從黃芪、狼麻植物的根中分離提取的一種異黃酮類化合物，又稱刺芒柄花素、芒柄花黃素，具有抗腫瘤、降血脂、抗心律不齊、抗菌、解痙攣、抗脂質過氧化、雌性激素等多種藥理活性〔3，4〕。研究表明，芒柄花素能改善糖尿病小鼠心肌損傷〔5〕。但芒柄花素是否可以保護心肌缺血再灌注損傷尚不清楚。本研究通過建立心肌缺血再灌注損傷大鼠模型，觀察芒柄花素對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響，并分析其可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康SPF級雄性SD大鼠60只，6～8周齡，體重180～220 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物合格證號：SCXK(滬)2019-0120，各項動物操作均符合3R原則。

1.2藥品與主要試劑 芒柄花素(純度>98%，北京寰宇科創(chuàng)生物科技發(fā)展有限公司)，維拉帕米(鹽酸維拉帕米片，天津市中央藥業(yè)有限公司)，磷酸肌酸激酶同工酶(CK-Mb)、肌紅蛋白(Mb)、心肌肌鈣蛋白(cTn)I、腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6、IL-1β酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，蘇木素-伊紅(HE)染液(上海碧云天生物技術有限公司)，超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物歧化酶(GSH-Px)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，蛋白激酶B(Akt)、磷酸化(p)-Akt、細胞內核因子E2相關因子(Nrf)2、p-Nrf2及血紅素加氧酶(HO)-1抗體(美國Cell Signaling Technology公司)。

1.3心肌缺血再灌注損傷模型的制備〔6〕采用左冠狀動脈前降支結扎法構建心肌缺血再灌注損傷大鼠模型，具體操作如下：腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，連接動物呼吸機和心電監(jiān)護儀，胸骨左緣3～4肋間開口，暴露心臟，于肺動脈圓錐左緣與左心耳下緣2 mm處進針，再經淺層心肌穿出，結扎左冠狀動脈前降支30 min，當心電監(jiān)護儀顯示ST段抬高和或T波高聳，且觀察到縫線遠心端心外膜顏色發(fā)絳，提示心肌缺血成功。再松開縫線120 min，若心電監(jiān)護儀顯示ST段下降>50%，心外膜顏色復原，提示心肌缺血再灌注損傷大鼠模型復制成功。

1.4分組與給藥 60只SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、芒柄花素低、中、高劑量組及維拉帕米組(陽性對照)，每組10只。除假手術組外，其余各組均構建心肌缺血再灌注損傷大鼠模型，假手術組僅暴露心臟、穿線，但不結扎。芒柄花素低、中、高劑量組分別灌胃10、20、40 mg/kg芒柄花素〔7〕，維拉帕米組灌胃20 mg/kg維拉帕米〔8〕，1次/d，連續(xù)給藥4 w，假手術組和模型組以等體積生理鹽水替代。末次給藥24 h后，斷頭法處死大鼠，迅速分離心肌組織，部分固定于4%多聚甲醛液中，剩余凍存于液氮中待測。

1.5觀察指標

1.5.1心肌損傷標志物 取心肌組織，以質量∶體積為1∶9添加預冷生理鹽水，制備心肌組織勻漿，5 000 r/min離心分離上清液，參照ELISA試劑盒說明書，檢測心肌損傷標志物CK-Mb、Mb及cTnI含量。

1.5.2心肌組織病理損傷 取固定的心肌組織，制備4 μm石蠟切片，脫蠟、水化后，進行常規(guī)HE染色，脫水、透明、封片，光鏡下觀察大鼠心肌組織病理損傷情況。

1.5.3炎癥因子 取心肌組織，以質量∶體積比為1∶9添加預冷生理鹽水，制備心肌組織勻漿，5 000 r/min離心分離上清液，參照ELISA試劑盒說明書，檢測心肌組織中炎癥因子TNF-α、IL-6及IL-1β含量。

1.5.4氧化應激標志物 以質量∶體積比為1∶9添加預冷生理鹽水，制備心肌組織勻漿，5 000 r/min離心分離上清液，根據(jù)生化試劑盒說明書，檢測氧化應激標志物SOD、MDA及GSH的含量。

1.5.5Akt/Nrf2/HO-1信號通路 取適量心肌組織，添加蛋白裂解液提取總蛋白，檢測蛋白濃度后，根據(jù)目標蛋白分子量大小選擇適宜的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)濃度，電泳至蛋白完全分離后再電轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，然后浸沒于含有5%脫脂奶粉的封閉液，室溫下反應2 h，接著置于一抗中4℃孵育過夜，分別添加Akt(1∶1 000)、p-Akt(1∶1 000)、Nrf2(1∶500)、p-Nrf2(1∶500)、HO-1(1∶2 000)及內參Actin(1∶1 000)，次日再添加辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔或羊抗鼠二抗(1∶8 000)，37℃反應1 h，最后進行化學發(fā)光顯影。以p-Akt/Akt、p-Nrf2/Nrf2表示其相對表達量，HO-1條帶灰度值與內參Actin條帶灰度值比值表示其相對表達量。

1.6統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1芒柄花素對心肌損傷標志物的影響 與假手術比較，模型組CK-Mb、Mb、cTnI均明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，維拉帕米組、芒柄花素中、高劑量組CK-Mb、Mb、cTnI均明顯降低(P<0.05)，且芒柄花素高劑量組與維拉帕米組上述指標的比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2芒柄花素對心肌炎癥因子水平的影響 與假手術比較，模型組TNF-α、IL-6、IL-1β明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，維拉帕米組、芒柄花素中、高劑量組TNF-α、IL-6、IL-1β均明顯降低(P<0.05)，且芒柄花素高劑量組與維拉帕米組上述指標的比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 芒柄花素對心肌損傷標志物及炎癥因子水平的影響

2.3芒柄花素對心肌病理損傷的影響 假手術組心肌細胞形態(tài)結構完整，排列整齊；模型組心肌細胞核溶解、固縮，肌纖維紊亂，炎性細胞浸潤明顯；芒柄花素低、中、高劑量組和維拉帕米組心肌損傷較模型組有明顯改善，炎性細胞浸潤減少。見圖1。

圖1 芒柄花素對心肌病理損傷的影響(HE染色，×200)

2.4芒柄花素對氧化應激標志物的影響 與假手術比較，模型組SOD、GSH-Px明顯降低，MDA明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，維拉帕米組、芒柄花素中、高劑量組SOD、GSH-Px明顯升高，MDA明顯降低(P<0.05)，且芒柄花素高劑量組與維拉帕米組上述指標比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

2.5芒柄花素對Akt/Nrf2/HO-1表達的影響 與假手術比較，模型組p-Akt/Akt、p-Nrf2/Nrf2、HO-1表達明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，維拉帕米組、芒柄花素中、高劑量組p-Akt/Akt、p-Nrf2/Nrf2、HO-1表達明顯升高(P<0.05)，且芒柄花素高劑量組與維拉帕米組上述指標比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2、圖2。

表2 芒柄花素對氧化應激標志物及Akt/Nrf2/HO-1表達的影響

1～6：假手術組、模型組、芒柄花素低劑量組、芒柄花素中劑量組、芒柄花素高劑量組、維拉帕米組圖2 各組Akt/Nrf2/HO-1表達

3 討 論

左冠狀動脈前降支結扎法是經典的心肌缺血再灌注損傷動物模型，CK-Mb、Mb、cTnI是反映心肌損傷的敏感指標〔9〕，本研究結果提示，芒柄花素可減輕心肌缺血再灌注損傷。目前，心肌缺血再灌注損傷的發(fā)病機制尚不完全明了，但炎癥因子在其發(fā)生發(fā)展過程中有關鍵作用，缺血損傷會刺激中性粒細胞、巨噬細胞等分泌大量的TNF-α、IL-6、IL-1β等促炎因子，這些炎性細胞及因子的聚集會引起血管堵塞。同時，TNF-α還可誘導細胞凋亡，介導過氧化物陰離子促進髓過氧化物酶的合成，從而放大炎癥反應，IL-6、IL-1β作為強效的促炎因子，持續(xù)升高會進一步加重迅疾損傷〔10，11〕。Yang等〔12〕研究顯示，芒柄花素可以過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)α依賴方式，抑制c-Jun氨基末端激酶(JNK)信號通路，減輕炎癥反應，改善肝臟膽汁淤積，從而保護肝損傷。本研究中芒柄花素可抑制TNF-α、IL-6、IL-1β的過度表達，提示芒柄花素減輕心肌缺血再灌注損傷可能與減輕炎癥反應有關。

同時，心肌發(fā)生缺血再灌注損傷時，會產生大量的活性氧，而心肌細胞中富含線粒體，是病理下活性氧的主要來源〔13〕。正常情況下，體內抗氧化和氧化水平處于動態(tài)平衡狀態(tài)，外界刺激引起心肌損傷后，體內分泌的SOD、GSH-Px等抗氧化酶不足以清除體內過多的氧自由基，脂質過氧化，導致氧化反應終末產物MDA明顯增加，加劇線粒體損傷〔14〕。本研究結果提示，芒柄花素可減輕氧化應激水平，保護心肌損傷，這與Li等〔15〕報道芒柄花素在創(chuàng)傷性腦損傷中的抗氧化應激作用相似。

磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/Akt通路是機體重要的信號轉導通路，多項研究結果均顯示，PI3K/Akt信號傳導通路在心肌缺血再灌注損傷過程中發(fā)揮著重要作用，且很多植物提取物可通過上調PI3K/Akt通路發(fā)揮保護心肌的作用〔16，17〕。同時，Akt的活化可增強下游Nrf2活性，促進抗氧化物質HO-1的表達，從而提升細胞的抗氧化作用〔18〕。Aladaileh等〔19〕研究指出，芒柄花素可保護甲氨蝶呤誘導的腎臟損傷，減輕大鼠氧化應激和炎癥反應水平，可能與上調Nrf2/HO-1通路有關。本研究發(fā)現(xiàn)，心肌缺血再灌注損傷大鼠中Akt/Nrf2/HO-1通路處于抑制狀態(tài)，芒柄花素給藥后可逆轉這種抑制，提示芒柄花素可能通過促進Akt/Nrf2/HO-1表達，起到保護心肌損傷的作用。

綜上，芒柄花素可保護大鼠心肌缺血再灌注損傷，減輕炎癥反應和氧化應激水平，可能與上調Akt/Nrf2/HO-1表達有關，并且以高劑量效果最好。芒柄花素作為一種來源廣泛的植物提取物，對心肌缺血再灌注損傷的保護作用將為心缺血性疾病的治療提供新思路，但其上下游具體調控機制仍有待深入研究。