食品中菌落總數(shù)檢測能力驗證的結果分析與質(zhì)量控制

李文綺，谷天雨，李自芹

（1.石河子質(zhì)量與計量檢測所，新疆 石河子 832000；2.新疆生產(chǎn)建設兵團質(zhì)量技術評價中心，新疆 烏魯木齊 830000；3.新疆農(nóng)墾科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，新疆 石河子 832000）

能力驗證是考核實驗室檢測能力的有效手段，通常預先制定好相應的計劃和實施方案，利用試驗室間比對或者測量審核，以評價各參加者的能力[1-2]。

菌落總數(shù)（Aerobic plate count），是指待檢樣品經(jīng)過一定的處理（通常是采用無菌磷酸鹽緩沖液或無菌生理鹽水進行10倍梯度稀釋），在特定的環(huán)境條件中進行培養(yǎng)后，1 g或1 mL樣品中形成的細菌菌落總數(shù)量[3]，是一個統(tǒng)稱，包含各種各樣的細菌。當食品中的細菌超標，就會危害人體的健康，因此在食品檢驗中，菌落總數(shù)通常是非常重要的微生物指標，其準確測定和計數(shù)對把控食品安全質(zhì)量具有重要的意義。于2020年和2021年參加由中國檢驗檢疫科學研究院測試評價中心組織的食品中菌落總數(shù)的檢測能力驗證，現(xiàn)將連續(xù)2年的試驗操作和結果及由此獲得的經(jīng)驗總結分享如下。

1 材料與方法

1.1 測試樣品

能力驗證測試樣品見表1。

表1 能力驗證測試樣品

1.2 儀器與試劑

JE3002型電子天平（0.01 g），上海浦春計量儀器有限公司產(chǎn)品；YXQ-LS-50SⅡ型和YXQ-LS-70A型立式壓力蒸汽滅菌器2臺、BSC-1300ⅡA-B3型生物安全柜、BSP-150型生化培養(yǎng)箱，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠產(chǎn)品；DZKW-D-6型電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司產(chǎn)品；Talboys型旋渦混合器，美國公司產(chǎn)品；PHS-3C型酸度計，上海儀電科學儀器股份有限公司產(chǎn)品。

0.85%的無菌生理鹽水（氯化鈉AR），天津市致遠化學試劑有限公司提供；平板計數(shù)瓊脂（BR），北京奧博星生物技術有限責任公司提供。

1.3 檢驗方法

依據(jù)GB 4789.2—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定》[3]和測試樣附帶的參試指導書（ACAS-PT917（2020）乳粉中菌落總數(shù)的檢測能力驗證參試指導書、ACAS-PT1081（2021）食品中菌落總數(shù)的檢測能力驗證參試指導書）的要求進行檢測。

1.4 檢驗步驟

1.4.1 樣品接受與制備

（1）樣品接受。實驗室應隨時關注能力驗證樣品寄送情況，及時接受。接到樣品后，建議立即進行檢驗。如不能立即檢測，應嚴格按照參試指導書的要求先行保存（2020年乳粉樣品要求的保存溫度2～6℃，2021年食品樣品要求的保存溫度2～8℃），防止樣品中原有微生物的狀況發(fā)生變化[4]。

（2）樣品制備。能力驗證的樣品一般包裝于真空西林瓶內(nèi)，應小心開啟。開啟后，立即加入5 mL稀釋液（0.85%的無菌生理鹽水）進行再水化，待凍干樣品充分溶解后，用無菌移液管吸出放入無菌瓶中，再反復多次用稀釋液清洗西林瓶內(nèi)壁和瓶蓋，稀釋液一并轉(zhuǎn)入無菌瓶中，確保瓶內(nèi)待測樣品盡可能被全部轉(zhuǎn)入?yún)⒃囍笇付w積的稀釋液中（文中2次能力驗證均為60 mL）。最終的混合液即為待測樣品原液，將該樣品原液置于旋渦混合器上充分混勻待用（從冰箱中取出的樣品應先恢復至室溫再進行上述操作）。

1.4.2 樣品稀釋

用滅菌的移液管吸取上述樣品原液25 mL置于0.85%滅菌生理鹽水225 mL中，旋渦混勻，制成10-1的樣品勻液，再吸取10-1的樣品勻液1 mL，加入到9 mL滅菌生理鹽水中（移液管切勿觸碰稀釋液面），旋渦混勻。重復上述操作，逐級稀釋成10倍系列梯度的樣品勻液（每遞增稀釋1次，都要更換無菌移液管）?？紤]到能力驗證樣品的復雜性，2次試驗均設置9個梯度，即原液、10-1～10-8。

1.4.3 樣品取樣及培養(yǎng)

各稀釋梯度（包括樣品原液）各取1 mL樣液加入到90 mm無菌平皿內(nèi)，每個稀釋度至少接2個平皿，操作時間允許的話可接4個平皿。同時，做3組空白對照（無菌室環(huán)境監(jiān)測、生理鹽水空白對照、平板計數(shù)瓊脂空白對照）各2個平皿。加好樣液后，及時將置于46℃（溫度過高會影響細菌生長，過低瓊脂易凝固）恒溫水浴鍋的瓊脂培養(yǎng)基取18～20 mL傾注到90 mm的平皿中[5]，并順時針、逆時針轉(zhuǎn)動平皿，使樣液和培養(yǎng)基充分混勻，待瓊脂凝固后再覆蓋一層約4 mL培養(yǎng)基（防止菌落蔓延、造成計數(shù)不準）。待完全凝固后，將培養(yǎng)皿倒置于36±1℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.4.4 菌落計數(shù)

當平板上菌落大量生長時即可進行觀察，選擇典型的菌落計數(shù)。菌落數(shù)小于300 CFU的平板均應記錄具體的數(shù)量，大于300 CFU的可不記詳細的數(shù)量，以多不可計表示。每個稀釋度的菌落在計數(shù)時，綜合考慮其他稀釋梯度的菌落數(shù)，菌落生長的個數(shù)應與稀釋度大小呈反比，理論上每個稀釋度的菌落數(shù)應接近10倍的關系，若不符合上述規(guī)律，且差異比較大，在計算時，應剔除異常的平板，采用其他稀釋度的2個平板平均計數(shù)。詳細的計數(shù)規(guī)則參見GB 4789.2的要求[3]。

2 結果與分析

2.1 樣品檢測結果分析

2020年的乳粉樣品，2個測試樣可計數(shù)的稀釋梯度為10-1，10-2，10-3，只有稀釋梯度10-1，10-2的平皿，菌落數(shù)在30～300 CFU，故選擇這2個稀釋度的平皿菌落數(shù)進行計算。

2021年的食品樣品，21-A211樣可計數(shù)的稀釋梯度為10-2，10-3，10-4；21-D656樣可計數(shù)的稀釋梯度為10-3，10-4。同樣，選取菌落數(shù)在30～300 CFU的平板計數(shù)，則21-A211樣以稀釋梯度10-2的平皿，21-D656樣以稀釋梯度10-3的平皿菌落數(shù)進行計算。

連續(xù)2年的樣品菌落總數(shù)檢測結果見表2。

表2 連續(xù)2年的樣品菌落總數(shù)檢測結果

2.2 能力驗證結果分析

能力驗證的結果通常采用Z值（由能力驗證的指定值和能力評定標準差計算實驗室偏倚的標準化度量[6）]進行評價。當時，表示檢測結果滿意；時，表示檢測結果可疑；時，表示檢測結果不滿意。

菌落總數(shù)的檢測能力評價結果見表3。

表3 菌落總數(shù)的檢測能力評價結果

2.3 菌落總數(shù)檢測的影響因素和質(zhì)量控制分析

2020年的2個樣品的檢測結果均偏小，經(jīng)過分析，主要存在以下幾個方面的原因：①倒平板時未進行覆蓋，菌落生長過程中出現(xiàn)蔓延，計數(shù)時存在較大的誤差。②計數(shù)時對蔓延的菌落計數(shù)不規(guī)范，造成數(shù)值偏小。③對標準理解不透。雖然選取了菌落數(shù)在30～300 CFU范圍的平板，但是疏忽了一個重要的附加條件——無蔓延菌落生長，導致計算公式選用錯誤，結果偏低。在對能力驗證不滿意結果認真分析之后，再次申報了2021年該項目的能力驗證，并取得了滿意的結果。

微生物能力驗證一般不指定方法，要求各實驗室優(yōu)先選擇常用的檢測方法。

測試樣品不同于平時的檢驗樣品，具有復雜性。因此在具體的操作過程中每一個環(huán)節(jié)都要考慮到，尤其是微生物能力驗證樣品，其微生物多樣的特性決定了很難進行多次重復試驗，基本都是一次試驗報送結果，這就要求從檢驗準備到試驗結束的每一個環(huán)節(jié)都不能疏忽。嚴格按照國標方法及能力驗證參試指導書的要求操作至關重要，同時要對試驗過程每個可能存在的風險因素進行把控。

2.3.1 人員的控制

能力驗證的操作人員一定是實驗室檢測該項目的人員，要求具備相應的微生物學知識，具有一定的操作能力，熟練掌握授權范圍內(nèi)的各類檢測項目和參數(shù)，能獨立完成下達的能力驗證項目。不能請其他機構該方面的專家或者是實驗室該工作崗位以外的人員承擔此項工作，即使能力驗證最終的結果為滿意，對檢測式驗的外部質(zhì)量控制沒有任何意義，更不能體現(xiàn)出實驗室真實的檢測能力。

2.3.2 環(huán)境的控制

報名參加能力驗證計劃后，要隨時關注能力驗證組織者寄發(fā)測試樣品的動態(tài)，提前對微生物實驗室、生物安全柜進行空氣潔凈度監(jiān)測，主要是沉降菌、浮游菌、懸浮粒子等參數(shù)，確保微生物實驗室符合萬級要求，生物安全柜符合百級要求，方可開展檢測工作。無菌室的推薦溫度為20℃，相對濕度為40%～60%[8]。

2.3.3 檢測方法的控制

微生物能力驗證一般要求各實驗室優(yōu)先選擇常用的檢測方法。通常檢驗人員對相關的檢測方法都能熟練操作，但是有一個常被忽視的點就是能力驗證參試指導書，其對樣品的處理有詳細的規(guī)定，是檢測方法至關重要的一部分。接到能力驗證樣品的第一時間，一定要認真閱讀參試指導書，按照相關要求處理樣品，同時充分理解標準規(guī)定的檢測方法，才能確保后續(xù)試驗順利進行。

2.3.4 儀器設備及試劑的控制

（1）儀器設備。試驗涉及的儀器設備均應有效溯源（檢定或者校準），同時相關的檢驗人員對所用設備進行計量確認、確保儀器的各項參數(shù)滿足試驗的要求。

（2）耗材及試劑。所用的耗材及試劑均應按要求進行滅菌處理（同時監(jiān)測滅菌效果），確保無菌狀態(tài)。最重要是培養(yǎng)基的制備，平板計數(shù)瓊脂（PCA培養(yǎng)基）一般要求的pH值在7.0±0.2，一定要對pH值進行監(jiān)測，配置時先煮沸溶解，調(diào)pH值到指定的范圍內(nèi)，分裝試管或錐形瓶，于121℃下高壓滅菌15 min后備用。

2.3.5 試驗操作環(huán)節(jié)的控制

無菌操作：嚴格按照無菌操作要求進行試驗，試驗開始前，應對微生物實驗室、生物安全柜紫外滅菌30 min換氣后，試驗人員穿戴好衣、帽、口罩、手套、鞋套，方可進入實驗室。能力驗證樣品中含有活的微生物（可能含有致病菌），整個試驗操作應在生物安全柜中進行。試驗過程中，取用東西后，隨時用75%乙醇噴灑雙手，以免污染樣品。

詳細的檢測步驟在1.4中已提及注意事項：①樣品處理中若遇到難以溶解的情況，應提前將稀釋液保溫到與培養(yǎng)基接近的溫度（一般為46±1℃），有利于凍干粉樣品更好溶解。②樣品轉(zhuǎn)移過程應盡可能完全，60 mL的稀釋液可分多次清洗西林瓶內(nèi)壁及瓶蓋。③能力驗證的樣品無法預估樣品污染的狀況，故不能依據(jù)標準只選2～3個適宜的稀釋梯度，應多制備幾個梯度，不要少于6個，每個稀釋度均做2個平皿。一是避免菌落數(shù)過多，稀釋越小難以計數(shù)，二是多個梯度的菌落生長狀況有利于發(fā)現(xiàn)規(guī)律（稀釋度越大，菌落數(shù)越少，反之亦然），選擇更適宜的梯度平板進行計數(shù)。④每個稀釋梯度，均應準確移取樣液和稀釋液，此為試驗操作的關鍵一步。⑤實驗室可根據(jù)情況，選擇0.85%生理鹽水或者磷酸鹽緩沖液（PBS）作為稀釋液，兩者都是為了給微生物細胞提供一個相對穩(wěn)定的滲透壓，防止細胞因滲透壓改變而破裂或脫水死亡。在選擇稀釋液時還有一個原則，就是盡量與樣品處理的60 mL溶液保持一致。⑥試驗中為防止稀釋液體積因高壓滅菌蒸發(fā)減小，應先滅菌，再進行分裝。⑦從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程應控制在15 min內(nèi)[9]（在理想的溫濕度和營養(yǎng)條件下，細菌20 min進行一次增殖）。

2.3.6 結果觀察與試驗數(shù)據(jù)的控制

（1）生長過快或過慢。菌落經(jīng)過36℃培養(yǎng)后，一般在46～50 h進行觀察，但是在實際操作過程中，培養(yǎng)24 h以后，菌落已能明顯計數(shù)，針對這種情況，應隔一段時間觀察菌落的生長情況，并做好記錄，防止過早計數(shù)，漏掉生長緩慢的菌落；也要防止過晚計數(shù)，以免菌落過度生長，相互覆蓋，影響計數(shù)結果。另一方面，也存在菌落緩慢生長的情況，最長的培養(yǎng)時間不應超過50 h，防止培養(yǎng)基缺水裂開造成計數(shù)不準。無論是菌落生長過多或是個體太小，在肉眼觀察的同時，借用放大鏡來輔助計數(shù)。

（2）蔓延生長。傾倒培養(yǎng)基時再覆蓋4 mL，能有效防止菌落蔓延。但有時覆蓋后仍會出現(xiàn)蔓延的情況，這個時候還是要采用上面的方法，在菌落已能明顯計數(shù)的時候，多觀察，多記錄。對不同時間段的菌落數(shù)進行記錄，選取相對穩(wěn)定的計數(shù)結果，避免后期菌落蔓延生長造成計數(shù)不準。

對于較大片狀和鏈狀的菌落，GB 4789.2已有詳細的計數(shù)處理。每個稀釋梯度的平皿只有計數(shù)準確了，才能選擇最適的計算方法，根據(jù)不同的情況選擇GB 4789.2—2016條款7.1中的6種方法進行計算，并報送結果。

3 結論

通過比較連續(xù)2年能力驗證的結果，分析不滿意、可疑結果的原因，并采取有效措施，通過再次的能力驗證并獲得滿意結果。文中各環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制點和注意事項均為多次試驗中積累，對于檢測機構開展同類試驗具有一定的指導意義。微生物檢測不同于其他的理化檢驗，日常檢驗中的樣品中很少有陽性菌，對于試驗操作人員來說，很多微生物檢驗，尤其是涉及致病菌的檢驗，往往進行到分離培養(yǎng)環(huán)節(jié)就結束，很少進行到鑒定環(huán)節(jié)。所以很多檢測機構都存在微生物檢驗人員雖然熟悉完整流程，卻很少能操作下來的問題。而解決這一問題，最有效的手段就是參加能力驗證。能力驗證大部分都是陽性樣品，能夠鍛煉和提升檢驗人員的技術水平；同時，能力驗證的結果可以作為體現(xiàn)實驗室檢測能力的有效證明，既可以為監(jiān)管機構評價和認可有能力的實驗室提供依據(jù)，又可以為客戶和其他利益共同體選擇合適的檢測機構提供參考。鼓勵各檢測機構積極參加能力驗證，通過能力驗證，可及時發(fā)現(xiàn)實驗室在各個環(huán)節(jié)存在的問題，是確保實驗室質(zhì)量體系持續(xù)有效的重要手段[10]。