液相色譜測(cè)定飼料中嘔吐毒素的不確定度分析

楊麗軍，夏 楠，方申超，徐 迪，張冬冬

（1.蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院，安徽 蕪湖 241000；2.蕪湖市農(nóng)產(chǎn)品食品檢測(cè)中心，安徽 蕪湖 241000）

嘔吐毒素，又稱(chēng)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON），可由漆班菌屬、鐮刀霉菌屬等真菌產(chǎn)生[1-2]。嘔吐毒素具備高的細(xì)胞毒性和免疫抑制性，會(huì)使豬的造血系統(tǒng)遭受損害并造成死亡[3-4]，故已嚴(yán)格控制使用。在GB/T 30956—2014標(biāo)準(zhǔn)中指出，豬飼料嘔吐毒素的含量不能超過(guò)1.0 mg/kg[5]。所以，在日常生活中任何可能含有嘔吐毒素的物品都應(yīng)該被準(zhǔn)確測(cè)定。

不確定度是對(duì)結(jié)果的合理表征[6]，觀(guān)察被測(cè)量值的分散性與測(cè)量結(jié)果的可用性，是表示檢測(cè)值是否準(zhǔn)確的重要參數(shù)[7-10]，所以實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行權(quán)威認(rèn)可前均需進(jìn)行不確定度評(píng)定。李萬(wàn)鵬等人[11]、陳曦等人[12]曾對(duì)飼料、參類(lèi)等食品中赭曲霉毒素和人參皂苷等不同參數(shù)的測(cè)定進(jìn)行不確定度評(píng)定，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生不確定度的主要來(lái)源有分析儀器、回收率等。

目前，我國(guó)測(cè)定嘔吐毒素的方法包括高效液相色譜法（HPLC）、膠體金快速試紙條法、衰減全反射-傅立葉紅外光譜法（ATR-FTIR）、酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）等[13-16]。但因高效液相色譜法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確且儀器操作簡(jiǎn)單并可重復(fù)使用，所以試驗(yàn)利用高效液相色譜法測(cè)定飼料中的嘔吐毒素。

GB/T 30956—2014中介紹了免疫親和柱-高效液相色譜法測(cè)定飼料中嘔吐毒素含量的方法，以此方法為基礎(chǔ)并根據(jù)Robertson M，Kuang Y C等人[17-18]對(duì)不確定度的研究，進(jìn)行不確定度評(píng)定，以此為同行業(yè)研究者提供理論支持。

1 試劑與儀器

1.1 試驗(yàn)試劑

嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（質(zhì)量濃度50μg/mL），青島普瑞邦生物工程有限公司提供；蒸餾水；聚乙二醇，海安石油化工廠(chǎng)提供；鹽酸，伊犁新天煤化工有限責(zé)任公司提供；氫氧化鈉，天津市福晨化學(xué)試劑廠(chǎng)提供；甲醇（色譜純），綠環(huán)化工廠(chǎng)提供。

1.2 試驗(yàn)儀器

電子天平（感量0.01 mg），上海韜易實(shí)業(yè)有限公司產(chǎn)品；LC/20A型高效液相色譜儀、C18型色譜柱（150 mm×4.6 mm，5μm），島津公司產(chǎn)品；嘔吐毒素免疫親和柱，北京華安麥科生物技術(shù)有限技術(shù)產(chǎn)品；離心機(jī)，日本HITACHI公司產(chǎn)品；振蕩器，TAITEC實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司產(chǎn)品。

2 試驗(yàn)方法

參照GB/T 30956—2014對(duì)飼料中嘔吐毒素的含量測(cè)定方法進(jìn)行[19-21]。因?yàn)檎麴s水的安全性大且無(wú)特殊氣味，所以試驗(yàn)用水均為蒸餾水。再利用免疫親和柱對(duì)液體進(jìn)行凈化，最后洗脫、檢測(cè)。

2.1 樣品處理

從飼料袋中取出飼料粉碎，用間距1 mm分樣篩篩出較細(xì)飼料，稱(chēng)取10.0 g飼料放置在50 mL離心管中，加入PEG 2.0 g，蒸餾水50 mL，置于200～300 r/min的振蕩器中劇烈振蕩20 min，再在離心機(jī)中以轉(zhuǎn)速8 000 r/min處理5 min，從而提取飼料中的嘔吐毒素。取上清液，用0.01 mol/L HCl或0.01 mol/L NaOH調(diào)節(jié)上清液pH值為6～8，用以進(jìn)行下一步凈化。

2.2 樣品凈化

嘔吐毒素免疫親和柱可特異性吸附液體中的嘔吐毒素：將嘔吐毒素免疫親和柱插在氣控操作架的注射器上，將10.0 mL的醫(yī)用注射器連接在親和柱上，調(diào)節(jié)開(kāi)關(guān)使親和柱保護(hù)液以約1 d/s的流速全部通過(guò)免疫親和柱。吸取2.5 mL上述上清液注入醫(yī)用注射器中，直至上清液全部通過(guò)，用20.0 mL蒸餾水洗滌免疫親和柱，流速約為1 d/s或2 d/s，直到蒸餾水全部通過(guò)。將親和柱從操作架取下、吹干。

2.3 樣品洗脫

液體排干后，將1.0 mL的甲醇注入親和柱中，精確地把嘔吐毒素從親和柱上洗脫下來(lái)，流速約為1 d/s，所有的洗脫液收集在干凈的玻璃管中，并在50～60℃加熱條件下用氮?dú)獯抵粮稍?，殘留物?mL流動(dòng)相復(fù)溶，并用0.22μm的有機(jī)濾膜過(guò)濾至樣品瓶中，上液相色譜進(jìn)行分析。

2.4 嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

試驗(yàn)使用質(zhì)量濃度為50μg/mL嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入流動(dòng)相稀釋為0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，5.0μg/mL，用作試驗(yàn)的6個(gè)標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2.5 液相色譜條件

C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；液相色譜檢測(cè)器：熒光檢測(cè)器；流動(dòng)相：甲醇-水（20∶80）；柱溫：25℃；流動(dòng)相流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20μL；定量利用的是曲線(xiàn)的峰面積，定性利用的是保留時(shí)間[22]。

2.6 樣品測(cè)定

飼料測(cè)定液和6支標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)液相色譜進(jìn)行分析，可得嘔吐毒素質(zhì)量濃度，在此基礎(chǔ)上求得豬飼料中嘔吐毒素的最終含量。

2.7 嘔吐毒素含量的計(jì)算公式

式中：X——飼料中嘔吐毒素含量，mg/kg；

p——飼料測(cè)定液中嘔吐毒素質(zhì)量濃度，μg/mL；

V——飼料測(cè)定液最終定容體積，mL；

m——飼料稱(chēng)樣量，g；

V1——提取液體積，mL；

V2——用于凈化的溶液體積，mL。

3 結(jié)果與分析

3.1 不確定度來(lái)源分析

根據(jù)檢測(cè)過(guò)程及嘔吐毒素含量計(jì)算公式分析，認(rèn)定嘔吐毒素含量的不確定度來(lái)源主要是標(biāo)準(zhǔn)品工作液及配置、稱(chēng)量飼料、飼料均勻性、處理過(guò)程的飼料回收率、測(cè)量重復(fù)性、體積量取、定容和分析儀器引入的不確定度。

3.2 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量的分析

3.2.1標(biāo)準(zhǔn)品工作液及配置引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

（1）標(biāo)準(zhǔn)品濃度引入的不確定度。不同廠(chǎng)家生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度或純度會(huì)有一些差異，因此由此所帶來(lái)的不確定度也不同。該方法使用的是嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)證書(shū)上會(huì)標(biāo)明嘔吐毒素的濃度及誤差。查找標(biāo)準(zhǔn)證書(shū)可知其純度為0.996，最大允許誤差為±0.004，按均勻分布計(jì)算，則濃度帶來(lái)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度U(c)和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel(c)分別為：

（2）標(biāo)準(zhǔn)工作液配置引入的不確定度。在配置標(biāo)準(zhǔn)工作液過(guò)程中，使用的移液槍和容器等均存在誤差。根據(jù)《化學(xué)分析中的不確定度的評(píng)估指南》（CNAS-GL06）[23]可分析不確定度來(lái)源，根據(jù)國(guó)家計(jì)量技術(shù)規(guī)范《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[24]可知誤差是怎樣表示的，從而根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)證書(shū)上的誤差計(jì)算出工作液配置過(guò)程中所用容器引入的不確定度。

在配置中間標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，使用到的移液槍量程分別為200μL，1 mL，容量瓶體積為10 mL。根據(jù)《常用玻璃量具檢定規(guī)程》和《移液槍檢定規(guī)程》[25-26]的要求，可知1 mL的移液槍?zhuān)淖畲笤试S誤差為±0.01 mL。按均勻分布計(jì)算，可得其產(chǎn)生的不確定度U(V3)和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel(V3)：

試驗(yàn)采用的10 mL容量瓶，由以上規(guī)程可知其最大允許誤差為±0.02 mL。按均勻分布計(jì)算，可得其產(chǎn)生的不確定度U(V4)和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel(V4)：

使用的200μL移液槍?zhuān)刹ＡЯ烤呤褂靡?guī)程可知其最大允許誤差為±3μL，按均勻分布計(jì)算，可得到其產(chǎn)生的不確定度U(V5)和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel(V5)：

在整個(gè)試驗(yàn)操作過(guò)程中，室溫變化會(huì)使液體體積發(fā)生變化，從而產(chǎn)生不確定度U(Vt)。因此計(jì)算室溫變化產(chǎn)生的不確定度，可通過(guò)估計(jì)室溫波動(dòng)范圍和此室溫下體積膨脹系數(shù)計(jì)算，因液體膨脹系數(shù)遠(yuǎn)大于玻璃，所以玻璃的膨脹系數(shù)可忽略不計(jì)。實(shí)驗(yàn)室溫度一般在±2℃范圍變動(dòng)[27-28]，溶劑以水為代表，液體膨脹系數(shù)在20℃時(shí)為a=2.1×10-4，則：

所以，標(biāo)準(zhǔn)工作液配置引入的不確定度Urel(V配置)為：

綜上可知，標(biāo)準(zhǔn)品工作液及配置引入的不確定度Urel標(biāo)準(zhǔn)品為：

3.2.2 樣品稱(chēng)量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

在樣品稱(chēng)量過(guò)程中需要使用電子天平，根據(jù)JJG 98—1990《非自動(dòng)天平檢定規(guī)程》，使用最大允許誤差為±0.01 g，感量為0.01 g的天平，不確定度按均勻分布計(jì)算，從而得到U(m)和Urel(m)分別為：

3.2.3 樣品均勻性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

從飼料樣品袋中取上下左右中間5個(gè)方位的樣品，測(cè)定其嘔吐毒素含量。測(cè)得嘔吐毒素的含量分別為0.768，0.702，0.782，0.803，0.786 mg/kg，這5個(gè)含量的平均值A(chǔ)為0.768 mg/kg，標(biāo)準(zhǔn)偏差SA為3.90%。由計(jì)算可得樣品均勻性引入的不確定度U(A)和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel(A)分別為：

3.2.4 樣品處理過(guò)程的回收率引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

取不含嘔吐毒素的空白豬飼料作為樣品，向樣品中添加一定含量的嘔吐毒素，通過(guò)測(cè)定嘔吐毒素的含量來(lái)計(jì)算回收率，再根據(jù)數(shù)學(xué)模型計(jì)算出回收率產(chǎn)生的不確定度。取5份10 g的飼料樣品，加入含量為1.0 mg/kg的嘔吐毒素。處理后測(cè)得嘔吐毒素含 量 分 別 為0.916，0.842，0.896，0.839，0.901，0.890 mg/kg；回收率分別為91.6%，84.2%，89.6%，83.9%，90.1%，89.0%。平均回收率R為88.1%，標(biāo)準(zhǔn)偏差SR為3.20%，回收率引入的不確定度U(R)和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel(R)分別為：

3.2.5 測(cè)量重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

稱(chēng)取一份10 g的空白飼料，加入含量為1.0 mg/kg的嘔吐毒素，重復(fù)測(cè)定6次嘔吐毒素含量，分別為0.916，0.923，0.916，0.916，0.905，0.921 mg/kg。平均值X=0.916 mg/kg，標(biāo)準(zhǔn)偏差SX為0.6%，U(X)和Urel(X)分別為：

3.2.6 體積量取引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

根據(jù)JJG 196—2006，可知50 mL量筒的最大允許誤差為±0.25 mL，U(V6)和Urel(V6)分別為：

根據(jù)JJG 646—2006，知5 mL移液槍的最大允許誤差為±0.025 mL，U(V7)和Urel(V7)分別為：

由體積量取引入的合成相對(duì)不確定度為：

3.2.7 定容引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

樣品洗脫階段，洗脫液用氮?dú)獯蹈桑昧砍? mL的移液槍往殘留物中準(zhǔn)確加入1 mL流動(dòng)相溶解定容。由前述規(guī)程可知此移液槍的最大允許誤差為±0.01。所以，在定容階段引入的不確定度U(V定容)和Urel(V定容)分別為：

3.2.8 分析儀器引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

試驗(yàn)所使用的分析儀器為L(zhǎng)C/20A高效液相色譜儀，其擴(kuò)展不確定度為10%，k=2（由山東省計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院出具的校準(zhǔn)證書(shū)），則由液相色譜儀引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度Urel(E)為：

3.3 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度的合成及擴(kuò)展

3.3.1 各相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量匯總

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量表見(jiàn)表1。

表1 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量表

依據(jù)表1數(shù)據(jù)，可計(jì)算其合成各相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

合成不確定度為：

3.3.2 擴(kuò)展不確定度

按k=2計(jì)算，其擴(kuò)展不確定為：

測(cè)得此品牌豬飼料中嘔吐毒素的結(jié)果表示為：

4 結(jié)論

采用液相色譜法測(cè)定豬飼料中的嘔吐毒素，當(dāng)飼料取樣量為10.0 g，k=2（95%置信度）測(cè)得的嘔吐毒素含量為0.768±0.0912 mg/kg。通過(guò)對(duì)各個(gè)不確定分量分析可以看出，標(biāo)準(zhǔn)品工作液及配置過(guò)程、體積量取過(guò)程和分析儀器是該方法不確定度的主要來(lái)源。通過(guò)評(píng)定試驗(yàn)過(guò)程的不確定度，可以有效地減少試驗(yàn)過(guò)程中的偏差，達(dá)到準(zhǔn)確檢測(cè)樣品結(jié)果的目的。