北京市場飼料原料及全價飼料中蠟樣芽孢桿菌、煙曲霉菌和3種霉菌毒素情況調查

陳亞軍，李 芳，王 韞，董 清，袁雪霞，黃 芳

（1.北京市大興區(qū)畜牧水產(chǎn)技術推廣站，北京 102600；2.北京市通州區(qū)動物疫病預防控制中心，北京 101101；3.保定職業(yè)技術學院，河北保定 071000）

俄羅斯、烏克蘭是全球兩大重要糧食出口國，出口額占世界市場總量的12%（鐘鈺等，2022）。俄烏對國際市場影響嚴重，我們只能從美國進口飼料原料，但今年美國出現(xiàn)了嘔吐毒素蔓延的早期跡象。嘔吐毒素（DON）對人畜健康有很大影響，低劑量攝入會造成食欲下降、生長緩慢、發(fā)育不良和病死率升高等現(xiàn)象；大量或長期攝入會發(fā)生急性中毒、嘔吐、直腸出血和腹瀉（帕孜來提·依明，2018）。

了解我國飼料行業(yè)已經(jīng)出現(xiàn)的霉菌感染變得十分重要，因此，我們檢測了本基地飼料原料及儲藏期不同的全價飼料中嘔吐毒素、煙曲霉毒素和玉米赤霉烯酮、蠟樣芽孢桿菌和煙曲霉菌的污染情況。

1 試驗設計

對場內所有的飼料原料、外購全價飼料及自制全價飼料進行抽樣，檢測樣品在高溫高濕的環(huán)境下飼料中蠟樣芽孢桿菌、煙曲霉菌以及嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、煙曲霉毒素的含量。

2 材料

2.1 飼料樣品 飼料原料：采集麥麩、豆粕、仔豬預混料、玉米、中豬預混料、乳豬濃縮料、仔豬用枯草芽孢桿菌、中豬用畜禽生物復合預混料-活力素、中豬用枯草芽孢桿菌飼料原料共9種，每種2個重復，共計18個。

自制全價料：哺乳仔豬料、斷奶仔豬料和育肥豬料，從制成后第0、5、10、15天，采集2個樣品，共計24個。

外購全價料：妊娠母豬料、哺乳母豬料、育肥豬飼料，從進入豬舍后第0、5、10、15天，采集2個樣品，共計24個。

2.2 試劑與試劑盒 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、MYP培養(yǎng)基、沙堡羅培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基均購自北京奧博星生物技術有限公司。嘔吐毒素（DON）ELISA檢測試劑盒、玉米赤霉烯酮（ZEN）ELISA檢測試劑盒和煙曲霉毒素（FB）ELISA檢測試劑盒均購自濱州綠都生物技術有限公司。

3 方法

3.1 飼料原料和全價料樣品的采集 按照試驗設計采集樣品，用密封袋封口標記后低溫迅速送往實驗室，放入4℃的冰箱保存。

3.2 蠟樣芽孢桿菌、煙曲霉菌分離和培養(yǎng) 蠟樣芽孢桿菌計數(shù)：取25 g樣品，用磷酸鹽緩沖液按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6梯 度 稀 釋，按GB/T4789.2-2010要求，取每個梯度0.1 mL樣品稀釋液加入培養(yǎng)皿中，加入50～60℃未凝固MYP培養(yǎng)基。凝固后，將培養(yǎng)皿置37℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱培養(yǎng)12～24 h。將可疑菌落進行菌落形成單位計數(shù)。蠟樣芽孢桿菌在此培養(yǎng)基上菌落為粉紅色，挑取可疑菌落5個做鑒定試驗，根據(jù)證實的蠟樣芽孢桿菌的菌落數(shù)計算該平板上的菌落數(shù)。

煙曲霉菌培養(yǎng)和計數(shù)：按照GB4789.15-2010方 法，采 用PDA培 養(yǎng) 基，按1∶10，1∶102，1∶103，1∶104，1∶105梯度，各吸取1 mL菌液加入滅菌的PDA平板中，每個稀釋度做2個重復，置于27～29℃霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后計數(shù)。

3.3 毒素含量檢測 按照ELISA試劑盒說明書檢測嘔吐毒素、煙曲霉毒素、玉米赤霉烯酮的含量。以標準品百分吸光率為縱坐標，以DON標準品濃度的半對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖，計算樣本中DON的實際濃度。

4 結果

4.1 飼料原料中蠟樣芽孢桿菌、煙曲霉菌及3種霉菌毒素含量檢測 9種飼料原料中，蠟樣芽孢桿菌檢出率100%，其中乳豬濃縮料超過國家細菌允許量標準（國標（G13078-2017））。煙曲霉菌的檢出率100%，中豬預混料超過國家霉菌允許量（國標（G13078-2017））。ZEN檢出率33.3%，超標率22.2%；DON檢出率88.9%，超標率22.2%；FB檢出率88.9%，但不超標。其中玉米和中豬用枯草芽孢桿菌ZEN檢出值較高，玉米、仔豬用枯草芽孢桿菌和中豬用枯草芽孢桿菌DON檢出值較高；中豬預混料、乳豬濃縮料、仔豬用枯草芽孢桿菌FB檢出值最高；麥麩、豆粕、仔豬預混料、中豬預混料、乳豬濃縮料中ZEN檢出值為0，仔豬預混料中DON檢出值為0，玉米中FB檢出值為0；仔豬預混料中3種霉菌毒素的檢出率都比較低。

表1 飼料原料中蠟樣芽孢桿菌、煙曲霉菌及3種霉菌毒素含量

4.2 全價料中蠟樣芽孢桿菌、煙曲霉菌及3種霉菌毒素含量 將自制仔豬全價料、自制中豬全價料、自制乳豬全價料、外購中豬全價料、外購妊娠乳豬全價料、外購哺乳母豬全價料室溫（溫度25～27℃，濕度60%～70%）條件下儲存，第0、5、10、15天進行監(jiān)測，以確定不同生長階段豬只飼料中蠟樣芽孢桿菌、煙曲霉菌、DON、FB和ZEN的污染特點及其規(guī)律。

4.2.1 自制仔豬全價料中蠟樣芽孢桿菌、煙曲霉菌數(shù)量及DON、FB和ZEN含量 隨著儲存時間的不斷延長，自制仔豬全價料中蠟樣芽孢桿菌檢出量呈上升趨勢。整個儲藏過程中均能檢測到較高水平的煙曲霉菌污染，第10天開始呈下降趨勢。

隨著儲存天數(shù)的不斷增加，ZEN檢出量逐漸升高，DON檢出量呈上升趨勢，F(xiàn)B檢出量一直維持在較高水平，受儲存天數(shù)的影響不大。但所有霉菌和毒素含量均低于國家標準。

4.2.2 自制中豬全價料中蠟樣芽孢桿菌、煙曲霉菌數(shù)量及DON、FB和ZEN含量 儲藏前期（0～10 d），樣品中蠟樣芽孢桿菌的檢出量呈上升趨勢，第15天的檢測量有所下降，但仍維持在較高水平。煙曲霉菌、DON、FB均在第5天檢出量最高，隨后呈現(xiàn)下降趨勢。ZEN含量先緩慢上升，在第10天陡然上升，并維持在較高水平。

表2 全價料中蠟樣芽孢桿菌、煙曲霉菌數(shù)量及DON、FB和ZEN含量

4.2.3 外購中豬全價料中蠟樣芽孢桿菌、煙曲霉菌數(shù)量及DON、FB和ZEN含量 除第15天，外購中豬全價料均未檢出蠟樣芽孢桿菌和煙曲霉菌污染，檢出量分別為3×103和4×102。第10天檢出ZEN；僅在第0天檢出FB；DON含量呈現(xiàn)下降趨勢，在第15天略有上升。

4.2.4 自制乳豬全價料中蠟樣芽孢桿菌、煙曲霉菌數(shù)量及DON、FB和ZEN含量 自制乳豬全價第10和15天檢出蠟樣芽孢桿菌污染，檢出量分別為4×104、5.8×104。整個檢測過程中，煙曲霉菌載量均維持在較高水平。ZEN含量雖呈下降趨勢，但檢測時間內的含量均超過國家標準；DON含量相對檢出量也較高，在第10天達到檢測峰值；FB含量第0天檢出量為0，第15天檢測值突然攀升達到最高值。

4.2.5 外購妊娠母豬全價料中蠟樣芽孢桿菌、煙曲霉菌數(shù)量及DON、FB和ZEN含量 外購妊娠母豬全價料重蠟樣芽孢桿菌的污染持續(xù)存在，且在第5天達到峰值。僅第15天檢出1×102的煙曲霉菌。DON和FB含量在第0、5天均未檢出，ZEN在第10天檢出值達到最高值并超標，F(xiàn)B的檢出量仍然維持在較低水平；DON含量在第0、5天基本相同，在第10天出現(xiàn)檢測峰值。

4.2.6 外購哺乳母豬全價料中蠟樣芽孢桿菌、煙曲霉菌數(shù)量及DON、FB和ZEN含量 樣品中蠟樣芽孢桿菌的檢出量有上升趨勢，第5、10天的檢出量分別為2×102、1.1×102，第15天出現(xiàn)檢出峰值，檢出量為3.4×102；未發(fā)現(xiàn)煙曲霉菌污染。DON、ZEN和FB均在第10天出現(xiàn)檢測峰值。

4.3 蠟樣芽孢桿菌及DON、FB和ZEN的檢出率 由表3可知，隨著儲藏時間的不斷延長，不同生長階段的豬飼料中蠟樣芽孢桿菌的檢出量均有所升高，但煙曲霉菌的檢出量呈現(xiàn)出較為明顯的下降趨勢。而且3種毒素動態(tài)檢測結果顯示，自制飼料中污染DON、FB和ZEN的程度均高于外購成品飼料，同時較高的檢出量也可提示DON、FB和ZEN污染嚴重。

表3 蠟樣芽孢桿菌及DON、FB和ZEN的檢出率 %

5 討論

目前我國養(yǎng)殖行業(yè)對霉菌毒素的危害意識不夠，沒有進行污染物含量的檢測，而且我國只有部分配合飼料（如豬、禽及犢牛飼料嘔吐毒素的限量標準），未制定飼料原料（除DDGS外）中嘔吐毒素限量標準（崔華等，2020）。被污染的飼料中氨基酸含量會受到影響，從而降低了飼料的營養(yǎng)價值（閆珊珊等，2020）。而且嘔吐毒素等多種毒素疊加增加了毒素的細胞毒性，可引發(fā)豬胃潰瘍的慢性疾?。ㄍ鯐悦舻龋?021）。

王新（2019）用酶聯(lián)免疫法對2016～2018年河北、內蒙古等6省飼料嘔吐毒素污染情況進行了調查，結果顯示，我國玉米中嘔吐毒素污染處于中等污染程度，這表明華北地區(qū)的飼料被污染情況十分嚴重。徐詠寧等（2020）研究表明，夏秋季節(jié)高溫高濕環(huán)境易于蠟樣芽孢桿菌、煙曲霉菌等的滋生，因此，儲存過程中應注意環(huán)境控制。

6 結論

綜上所述，華北地區(qū)的飼料被真菌及毒素嚴重污染，應盡快制定飼料原料毒素污染限量，從而保證養(yǎng)殖業(yè)的正常發(fā)展。