冬眠動物冬眠適應(yīng)性的分子調(diào)控機(jī)制研究進(jìn)展

張繼輝,趙丹丹

(蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品科學(xué)與生物工程學(xué)院,蕪湖生命與健康工程研究中心,安徽 蕪湖 241003)

1 冬眠物種的轉(zhuǎn)錄組研究進(jìn)展

1.1 轉(zhuǎn)錄組

轉(zhuǎn)錄組指某一生理?xiàng)l件下的某一特定組織或細(xì)胞中全部轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合.一般認(rèn)為主要由核糖體RNA (80%-90%,rRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA (5%-15%,tRNA)、mRNA (2%) 和一小部分非編碼RNA (1%,ncRNA) 比如lncRNA和miRNA等組成[1].轉(zhuǎn)錄組的典型特點(diǎn)是具有時(shí)空性,即在特定的細(xì)胞或者組織的不同發(fā)育階段,其轉(zhuǎn)錄組也不同,同一組織中不同細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)錄組也不完全相同[2].在不同物種的不同組織中開展轉(zhuǎn)錄組研究,有利于了解特定組織或細(xì)胞在不同時(shí)期時(shí)的分子間相互作用.

1.2 冬眠物種轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究進(jìn)展

通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法已經(jīng)確定了十三紋地松鼠棕色脂肪組織和白色脂肪組織[3]、骨髓[4]、大腦皮層和下丘腦區(qū)域[5]以及骨骼肌和心臟[6]在不同活動狀態(tài)以及不同活動季節(jié)下的基因表達(dá).采用抑制消減法雜交技術(shù)和斑點(diǎn)雜交技術(shù),對馬鐵菊頭蝠 (Rhinolophusferrumequinum) 冬眠和覺醒狀態(tài)大腦中的差異表達(dá)基因進(jìn)行了系統(tǒng)的研究,發(fā)現(xiàn)冬眠狀態(tài)表達(dá)上調(diào)的基因有41個(gè),其中已知基因17個(gè),生物信息學(xué)分析表明,主要的上調(diào)基因可能負(fù)責(zé)基因表達(dá)的調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和神經(jīng)保護(hù)、細(xì)胞周期和凋亡的調(diào)控、神經(jīng)元的生長和細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn).同樣在馬鐵菊頭蝠中,通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對冬眠和活動狀態(tài)大腦中的差異基因進(jìn)行了全面研究,鑒定了1573個(gè)差異表達(dá)基因,發(fā)現(xiàn)差異基因在代謝抑制、細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)和氧化應(yīng)激等GO條目中顯著富集,表明神經(jīng)保護(hù)策略可能在冬眠控制機(jī)制中發(fā)揮重要作用[7].在侏儒狐猴 (Cheirogaleuscrossleyi) 中,比較兩種活躍狀態(tài)和一種休眠狀態(tài)時(shí)的白色脂肪組織 (white adipose tissue) 中差異表達(dá)基因時(shí),鑒定了90個(gè)具有可變表達(dá)模式的候選基因,這些與代謝途徑、攝食行為和晝夜節(jié)律有關(guān)的基因,可能與季節(jié)生理狀態(tài)的變化相關(guān),對維持動物的健康至關(guān)重要,因?yàn)閯游锾幵诙弑硇偷耐瑫r(shí)也經(jīng)歷了長時(shí)間的代謝抑制[8].在馬達(dá)加斯加島,使用標(biāo)記重補(bǔ)技術(shù)來跟蹤相同的野生侏儒狐猴,通過RNA-seq技術(shù)比較了白色脂肪組織在3種不同生理狀態(tài)下的基因表達(dá)譜,指出丙酮酸脫氫酶激酶同工酶4 (pyruvate dehydrogenase kinase 4) 在食物嚴(yán)重匱乏時(shí),調(diào)節(jié)燃料的經(jīng)濟(jì)性轉(zhuǎn)變中發(fā)揮關(guān)鍵作用[9].Fedorov等利用cDNA探針芯片技術(shù)來檢測黑熊冬季冬眠期間與夏季活動期間心臟和肝臟中基因的表達(dá)差異,鑒定了心臟中245個(gè)基因和肝臟中319個(gè)基因在冬季和夏季之間表達(dá)差異,其中有24個(gè)基因同時(shí)在心臟和肝臟中表達(dá)顯著升高,這些基因主要參與脂質(zhì)分解代謝和蛋白質(zhì)生物合成,其中包括RNA結(jié)合蛋白基序3 (RNA binding motif protein 3),可在輕度低溫下增強(qiáng)蛋白質(zhì)合成,這可能與熊冬眠期間長時(shí)間低代謝和休眠期間心肌和肌肉萎縮的適應(yīng)性機(jī)制有關(guān)[10].Nespolo等通過高通量測序技術(shù) (RNA-seq) 比較了冬眠和活躍狀態(tài)下的南美有袋動物 (Dromiciopsgliroides) 的大腦、肝臟和骨骼肌組織中的基因表達(dá),并確定冬眠是否誘導(dǎo)了組織特異性的差異基因表達(dá),這些差異表達(dá)基因編碼的蛋白質(zhì)反映冬眠期間的多種代謝變化,如防止肌肉廢用性萎縮、碳水化合物向脂質(zhì)代謝轉(zhuǎn)換、抗氧化保護(hù)和修復(fù)受損DNA等[11].

隨著高通量測序技術(shù)的進(jìn)步,轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)也逐漸被用來研究爬行動物的冬眠生理變化.本團(tuán)隊(duì)之前已經(jīng)利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對冬眠和活動的揚(yáng)子鱷心臟、骨骼肌和腎臟的基因表達(dá)差異進(jìn)行了全面的調(diào)查,總共發(fā)現(xiàn)了4780個(gè)基因在揚(yáng)子鱷活動期和冬眠期之間的差異表達(dá),部分差異表達(dá)基因在冬眠期表達(dá)升高,對提高胰島素敏感性、糖脂代謝以及保護(hù)細(xì)胞免受低溫和缺氧的傷害中起重要作用[12].Capraro等使用mRNA-seq分析了澳洲鬃獅蜥 (Pogonavitticeps) 3種組織內(nèi)的基因表達(dá),樣本來自冬眠后期、覺醒后2 d和覺醒后2個(gè)月的動物的大腦、心臟和骨骼肌[13].他們發(fā)現(xiàn)腦組織中差異表達(dá)基因有4264個(gè),心臟種差異表達(dá)基因5340個(gè),骨骼肌種差異表達(dá)基因5587個(gè).3種組織中共表達(dá)的差異基因有2482個(gè),差異基因的組織特異性分析顯示在所有組織中都有豐富的保護(hù)機(jī)制,包括大腦中的神經(jīng)保護(hù)通路、心臟中的心肌肥厚過程和骨骼肌萎縮的保護(hù)通路.在所有組織中,冬眠期間均誘導(dǎo)了應(yīng)激反應(yīng)通路,并在轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控.Lin等對揚(yáng)子鱷的多個(gè)組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析,探討揚(yáng)子鱷冬眠的機(jī)理,發(fā)現(xiàn)甲狀腺激素的生物合成、營養(yǎng)吸收和代謝、肌肉收縮、尿排泄和免疫功能通路在冬眠過程中整體下調(diào)[14].

2 非編碼RNA在冬眠物種中的研究

2.1 非編碼RNA的介紹

基因組中編碼蛋白質(zhì)的基因外顯子僅占基因組的1.5%,如果考慮非編碼區(qū),該比例也只會增加到2%[15].大量研究顯示,基因組的非蛋白質(zhì)編碼部分對機(jī)體的正常發(fā)育、生理適應(yīng)和疾病等具有至關(guān)重要的功能[16,17].近年來非編碼RNA (non-coding RNA,ncRNAs) 在組織和細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制已經(jīng)被廣泛研究[18,19].非編碼RNA主要包括長度大于200 bp的長鏈非編碼RNA和長度小于200 bp的短鏈非編碼RNA,具體的有l(wèi)ncRNA,miRNAs和circRNAs,以及經(jīng)典的tRNA,rRNA和 snoRNAs等等[16,20].

2.2 miRNA對冬眠物種基因表達(dá)的調(diào)控

miRNA的平均長度在18～26 nt之間,是一種內(nèi)源性非編碼小RNA,作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子,據(jù)報(bào)道主要位于動物、植物和真菌基因組的非編碼區(qū)[21].Bigger等人指出,在低溫、缺食和缺氧等條件下,miRNA可以參與調(diào)控機(jī)體內(nèi)多種生理變化,暗示miRNA在冬眠適應(yīng)性的分子調(diào)控中起作用[22,23].miRNAs對哺乳動物冬眠的調(diào)節(jié)已經(jīng)在許多物種中進(jìn)行了探索.例如,通過比較10個(gè)miRNAs在常溫蝙蝠和冬眠蝙蝠中的表達(dá),結(jié)果顯示,與常溫對照相比,在冬眠蝙蝠的胸肌中,觀察到8個(gè)成熟miRNAs的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)顯著增加,包括miR-29b,miR-1a-1,miR-181b,miR-15a,miR-206,miR-20a和miR-128-1.這些miRNA已經(jīng)被證實(shí)或被預(yù)測會影響多種肌肉特異性因子,包括肌生成抑制素、FoxO3a、HDAC4和SMAD7,并且可能參與了蝙蝠冬眠期間胸肌質(zhì)量和功能的保存[24].同樣利用RT-PCR技術(shù)在蝙蝠腦組織中發(fā)現(xiàn)8種microRNAs (miR-21、-29b、-103、-107、-124a、-132、-183和-501) 在冬眠狀態(tài)下表達(dá)增加,提示冬眠期間與神經(jīng)元分化和適應(yīng)性神經(jīng)保護(hù)相關(guān)的腦功能可能受到miRNA的控制[25].通過RNA-seq測序技術(shù),對冬眠蝙蝠 (Myotisricketti) 的大腦和白色脂肪組織中的miRNA進(jìn)行了基因組分析,196個(gè)miRNA 被鑒定獲得 (包括77個(gè)新的蝙蝠特異性miRNA),其中49個(gè)miRNA在冬眠期間表現(xiàn)出顯著差異,其中33個(gè)在大腦中表達(dá),25個(gè)在WAT中表達(dá),提示冬眠期間大腦和脂肪組織中的一些生理通路被激活[26].冬眠期北極黃鼠的肝臟中miR-320、mir-378表達(dá)下調(diào)[27],并探究了他們在冬眠中的潛在作用,指出miR-320和miR-378可以抑制冬眠期細(xì)胞的生長.在地松鼠肝臟、心臟和骨骼肌組織中通過qRT-PCR檢測出冬眠肝臟中,miR-29a、miR-152、miR-195、miR-223和miR-486表達(dá)上調(diào),而在冬眠骨骼肌組織樣本中,miR-378表達(dá)下調(diào),其中miR-195靶點(diǎn)基因編碼的脂肪酸合酶 (fatty acid synthase,FAS),在冬眠的地松鼠肝臟中下調(diào),為冬眠動物體內(nèi)脂肪酸穩(wěn)態(tài)的潛在調(diào)控提供了線索[28].在非哺乳動物中,低溫照射下的差異miRNA的表達(dá)也可以在玉黍螺和錦龜中觀察到[29,30].在寒冷條件下,在林蛙 (Ranasylvatica) 的肝臟和骨骼肌中,miR-21在凍結(jié)期間明顯增加了1.5倍和1.3倍,在凍結(jié)期間的肝臟中,miR-16轉(zhuǎn)錄也顯著升高1.5倍,而在骨骼肌中則下降50%[31],這表明miRNA在兩棲冬眠的抗凍能力的適應(yīng)性調(diào)節(jié)中起作用.Lin等使用揚(yáng)子鱷脂肪、大腦、心臟、小腸、肌肉和性腺組織進(jìn)行了sRNA-seq,以識別季節(jié)偏性差異表達(dá)的miRNA.一些在其他冬眠動物中發(fā)揮作用的與冬眠相關(guān)的miRNA在揚(yáng)子鱷中也有發(fā)現(xiàn),例如,miR-103、miR-124 (腦) 和miR-206 (骨骼肌) 在冬眠鱷魚中上調(diào);同時(shí)還發(fā)現(xiàn)了新的與冬眠相聯(lián)系的miRNA,例如,在冬眠期間,miR-10b在小腸和脂肪組織中表達(dá)上調(diào),而在大腦、心臟、肌肉和卵巢中表達(dá)下調(diào)[14].

2.3 lncRNA對冬眠物種基因表達(dá)的調(diào)控

長鏈非編碼RNA(lncRNA) 最早是1988年在小鼠中被發(fā)現(xiàn)的,H19被鑒定為肝臟發(fā)育過程中一種沒有大的開放閱讀框 (ORF) 的RNA,而是零散的小ORF,這些ORF不具有進(jìn)化保守性,不能在體內(nèi)被翻譯,也不能產(chǎn)生可檢測的多肽[32].lncRNA的主要特點(diǎn)是沒有編碼功能,沒有大的開放閱讀框,一般長度大于200 nt[33].最開始研究者認(rèn)為lncRNA在生物體內(nèi)沒有生物學(xué)功能,僅僅基因轉(zhuǎn)錄過程中產(chǎn)生的“噪音”[34].然而,隨著高通量測序大規(guī)模的篩選,越來越多的lncRNA被發(fā)現(xiàn),其生物學(xué)功能也逐漸被解析,如lncRNA可能在多細(xì)胞生物發(fā)育過程中,調(diào)控細(xì)胞分化的多樣性[35];哺乳動物lncRNAs的表達(dá)比mRNAs表現(xiàn)出更大的組織特異性,這表明lncRNA可能參與了組織特異性調(diào)控[36].

許多研究討論了lncRNA在動物冬眠時(shí)表達(dá)異常,但對lncRNA基因差異表達(dá)中的調(diào)控機(jī)制的研究還很少.最初的報(bào)道發(fā)現(xiàn)冬眠紋黃鼠心臟和白色脂肪組織中,在不同階段lncRNA metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1 (MALAT1) 表達(dá)波動很大,尤其在10月份表達(dá)量最高[37],MALAT1在哺乳動物中高度保守,已知其可以參與RNA剪接的調(diào)控[38].有研究表明在冬眠小棕蝠骨骼肌中的lncRNA,反義缺氧誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子(antisense hypoxia-inducible transcription factor,aHIF) 表達(dá)下調(diào)[39].aHIF與缺氧誘導(dǎo)因子 (hypoxia inducible factor 1 subunit alpha,hif-α) 的3’ UTR互補(bǔ),與hif-α mRNA結(jié)合從而促進(jìn)其降解[40],而hif-α蛋白的數(shù)量和活性在冬眠期間升高,aHIF的減少可能與這些變化有關(guān)[41].在十三紋地松鼠中,與活動期常溫個(gè)體相比,lncRNA taurine-upregulated gene 1 (TUG1) 在冬眠期的骨骼肌中上調(diào)[42].TUG1可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡[43,44],并可以預(yù)防小鼠冷誘導(dǎo)導(dǎo)致的組織損傷[45].TUG1還可以功能性地調(diào)節(jié)線粒體的生物發(fā)生[46],并可能在應(yīng)對環(huán)境壓力方面發(fā)揮額外作用.TUG1被認(rèn)為通過充當(dāng)miR-144的誘餌并通過競爭抑制降低熱休克因子2 (heat shock factor 2,HSF2) 的表達(dá),HSF2是一種促進(jìn)熱休克蛋白表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子[47].TUG1和其他lncRNAs在動物冬眠中的作用還需要進(jìn)一步的研究來確定.

3 DNA甲基化在冬眠物種中的研究

3.1 DNA甲基化的形成

DNA甲基化是目前研究的最多且最為深入的一種表觀遺傳學(xué)因素,在1975年首次被研究者發(fā)現(xiàn),也是脊椎動物遺傳過程中的主要調(diào)控因素[48,49].DNA甲基化修飾是有S-腺苷甲硫氨酸提供甲基,以共價(jià)鍵的形式與胞嘧啶核苷酸的5號碳原子結(jié)合,形成5-甲基胞嘧啶,這種修飾方式廣泛且穩(wěn)定存在于動植物以及真菌體內(nèi)[50].在動物體內(nèi),DNA甲基化修飾主要發(fā)生在CpG豐富的區(qū)域,即CpG島.CpG島在基因組中的分布不均勻,其中在基因的啟動子區(qū)富含數(shù)量較多的CpG島,但通常啟動子區(qū)的CpG位點(diǎn)保持低甲基化狀態(tài).甲基CpG結(jié)合區(qū)域蛋白阻礙轉(zhuǎn)錄因子和RNA聚合酶與模板鏈的結(jié)合以便抑制基因轉(zhuǎn)錄,影響對應(yīng)的基因表達(dá)水平,最終導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生相應(yīng)的生理功能變化.重要的是CpG島區(qū)域內(nèi)的胞嘧啶甲基化起到強(qiáng)烈抑制基因轉(zhuǎn)錄的作用,能導(dǎo)致長期的等位基因沉默,如X染色體失活[51].近年來,DNA甲基化研究越來越深入,基因編碼區(qū)的DNA甲基化對基因表達(dá)的調(diào)控也逐漸被解析,與啟動子區(qū)域DNA甲基化對基因表達(dá)調(diào)控有顯著差別.編碼區(qū)的DNA甲基化不僅可以抑制基因表達(dá),有些區(qū)域的甲基化同時(shí)可以促進(jìn)基因的表達(dá)[52].

3.2 DNA甲基化在冬眠物種中的研究

DNA甲基化在動物冬眠中的作用研究的還不是很多.在十三紋地松鼠中,棕色脂肪組織的全基因組甲基化顯示在冬眠期間個(gè)體與常溫個(gè)體對照相比,整體DNA甲基化增加了1.7倍[53].此外,在金花鼠肝臟中發(fā)現(xiàn)休眠特異性蛋白27 (hibernation-associated plasma protein HP-27-like,HP-27) 基因表現(xiàn)出特異的轉(zhuǎn)錄表達(dá),分析原因發(fā)現(xiàn),在肝臟組織中HP-27基因的啟動子區(qū)域CG位點(diǎn)的甲基化水平很低,從而有利于刺激因子-1 (upstream transcription factor 1,USF1) 在啟動子區(qū)域與之結(jié)合,進(jìn)而促進(jìn)了HP-27基因的表達(dá)[54];而在腎臟和心臟中,HP-27啟動子區(qū)CpG島發(fā)生高甲基化修飾,從而阻礙了USF1的結(jié)合,HP-27轉(zhuǎn)錄被抑制.通過評估十三紋地松鼠冬眠后肝臟和骨骼肌中DNA甲基化的整體變化,以及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶 (DNA methyltransferases,DNMT1/3B) 和甲基結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白 (methyl binding domain proteins,MBDs) 的表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)肌肉在麻木期整體DNA甲基化減少,而DNMTs和MBDs在這兩個(gè)組織中均有顯著變化.結(jié)果顯示在冬眠期間,基因組DNA甲基化是動態(tài)的,與冬眠表型相適應(yīng)[55].揚(yáng)子鱷的多個(gè)組織全基因組甲基化結(jié)果顯示冬眠相關(guān)基因不僅直接受到DNA甲基化的調(diào)控,還受到甲基化依賴的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控[14].

4 結(jié) 語

冬眠研究一直是近些年的研究熱點(diǎn),冬眠動物冬眠期間生理指標(biāo)和基因表達(dá)均出現(xiàn)劇烈變化,探究冬眠物種季節(jié)性生理變化的基因表達(dá)變化以及基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò),不僅對揭示冬眠動物如何度過寒冷不進(jìn)食的冬天很重要,而且對部分臨床疾病治療帶來一些新的思路.