鉤藤管家基因篩選及生物堿合成相關基因的表達分析

穆德添 萬凌云 章瑤 韋樹根 陸英 付金娥 田藝 潘麗梅 唐其

（1. 湖南農業(yè)大學園藝學院, 長沙 410128；2. 廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，南寧 510023）

鉤藤是茜草科植物鉤藤Uncaria rhynchophylla（Miq.）Miq.ex Havil、大葉鉤藤Uncaria macrophyllaWall.、毛鉤藤Uncaria hirsutaHavil.、華鉤藤Uncaria sinensis（Oliv.）Havil.或無柄果鉤藤Uncaria sessilifructusRoxb.的干燥帶鉤莖枝［1］，為我國傳統(tǒng)的大宗中藥材。鉤藤中含有生物堿、黃酮、三萜等活性成分［2］，能夠治療阿爾茲海癥、高血壓、心率失調等癥［3-5］，有重要的藥用價值。目前，鉤藤是“鉤藤片”“天麻鉤藤顆?！薄懊}君安”等諸多著名中成藥的主要原料藥和中藥配方的常用藥，鉤藤的市場需求現已呈逐年遞增的趨勢。鉤藤的研究目前集中于鉤藤的藥理藥效［6］、有效成分的分離與鑒定［7-8］等方面，而對于鉤藤中次生代謝產物的生物合成分子機制的研究甚少。闡明鉤藤生物堿生物合成途徑，梳理與解析途徑中相關基因的分子調控機制，將為鉤藤的開發(fā)與利用或分子育種奠定基礎。

實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）是目前基因表達水平檢測的最常用方法。因其靈敏度高、特異性強、操作簡單，在當前生物學研究中發(fā)揮著重要的作用［9］。然而，其結果的準確性和可靠性取決于RNA 的質量、反轉錄效率、引物的特異性以及管家基因的穩(wěn)定性［10-11］。開展基因表達研究是發(fā)掘功能基因的重要手段之一，研究基因表達水平往往需要篩選出特定條件下最佳內參基因［12］。表達穩(wěn)定的管家基因，往往被用于RT-qPCR分析的看家基因。植物RT-qPCR 中常用的管家基因包含18S 核糖RNA（18S）、3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）、α 微管蛋白基因（TUA）、β 微管蛋白基因（TUB）、延伸因子基因（EF1-α）、肌動蛋白基因（Actin）、S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶（SAM）等。在諸多研究中發(fā)現，不同植物間管家基因的表達穩(wěn)定性也不同。如涂冬萍［13］等研究發(fā)現18S是在不同時期的有籽和無籽羅漢果果實中均穩(wěn)定表達的內參基因；楊婷［14］等研究發(fā)現ACT7和PP2A是鐵十字海棠斑葉發(fā)育過程中最適的內參基因；郭茜茜［15］通過實驗發(fā)現GAPDH是鉤藤蒴果中表達穩(wěn)定性最高的基因。目前，還未見鉤藤不同部位管家基因篩選的研究，因此選擇合適的內參基因進行校準對目的基因表達模式分析具有重要的作用。

鉤藤中的生物堿類型主要為萜類吲哚生物堿（terpenoid indole alkaloids, TIAs），其中最主要的為鉤藤堿及異鉤藤堿。鉤藤生物堿在植物中含量較低，通過傳統(tǒng)的育種來進行遺傳改良周期長、成本高。闡明鉤藤生物堿生物合成途徑，獲得控制其生物堿含量的關鍵酶基因，通過分子育種或者合成生物學手段實現鉤藤有效成分的綠色生物制造是其新的途徑。吲哚類生物堿的生物合成涉及多條代謝途徑。來自非甲羥戊酸路徑（“non-mevalonate” pathway,MEP/DOXP pathway）的異戊烯二磷酸（isopentenyl diphosphate, IPP）［16-17］， 經 由 環(huán) 烯 醚 萜 途 徑（iridoid pathway）的香葉醇-10 羥化酶（geraniol-10-hydroxylase, G10H）、馬錢子酸甲基化酶（loganic acid methyltransferase, LAMT）和開環(huán)馬錢子苷合成酶（secologanin synthase, SLS）等酶催化，生成開環(huán)馬錢子苷（又稱開聯(lián)番木鱉苷）（secologanin）［18-21］。再和色胺途徑的終產物色胺（tryptamine）經由異胡豆苷合成酶（strictosidine synthase, STR）催化作用形成異胡豆苷（strictosidine）［22］，再進入TIAs 生物合成路徑，這個過程中涉及到酶的編碼基因稱為參與TIAs 合成的“上游途徑基因”。

本課題組完成了鉤藤的基因組測序，發(fā)現了大量鉤藤TIAs 生物合成途徑的基因?；诨蚪M和轉錄組數據篩選出鉤藤12 個候選管家基因，利用不同部位的鉤藤材料鑒定這些候選管家基因的穩(wěn)定性。進而利用篩選出的最適管家基因分析TIAs 合成相關的“上游途徑基因”表達模式，為后續(xù)鉤藤生物堿合成的關鍵酶基因功能驗證和TIAs 生物合成途徑的闡明奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

于湖南農業(yè)大學國家中藥材生產（湖南）技術中心剪取鉤藤不同部位（根、莖鉤、葉片、蒴果）植物材料，經廣西藥用植物園韋樹根研究員鑒定為鉤藤Uncaria rhynchophylla（Miq.）Miq.ex Havil。剪取后的材料用滅菌水洗凈，吸干水分后，各組織迅速切片，液氮速凍，保存于-80℃冰箱備用。用于含量檢測的鉤藤樣品，經過60℃烘干后粉碎，過60目篩，備用。

1.2 方法

1.2.1 基于LC-MS 技術的鉤藤生物堿含量的測定 稱取鉤藤干燥粉末1 g，加入50 mL 質量濃度為80%的甲醇，稱定錐形瓶總質量，置于50℃超聲提取40 min，提取完畢后用提取液補充至超聲前錐形瓶總質量，搖勻后取溶液過0.22 μm 有機濾膜，液相小瓶備用。采用Agilent 6530 LC-MS 系統(tǒng)（Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA）開展定量分析。分離條件使用反相色譜柱（SB C18柱, 2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm, Agilent Technologies），0.1%甲 酸 水（A相）和0.1%甲酸乙腈（B 相）為溶劑體系，采用合適的梯度洗脫：0-20 min, 10%-70% B，流速為0.15 mL/min。色譜柱恒溫35℃，進樣量0.2 μL。測定得到不同濃度條件下鉤藤生物堿標準物質的質譜響應峰面積，制備標準曲線，對不同部位中鉤藤生物堿成分進行定量分析。

1.2.2 鉤藤不同部位總RNA 的提取和cDNA 的合成 選取鉤藤不同部位的植物材料，各取50-100 mg 樣品浸潤于液氮中，充分研磨后利用多糖多酚植物RNA 提取試劑盒進行總RNA 提取。采用微量分光光度計測定總RNA 的純度和濃度。使用1%瓊脂糖凝膠電泳儀檢測總RNA 的完整性。用600 ng RNA 進行cDNA 第一條鏈的合成，操作步驟參照PrimerScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒（TaKaRa，日本）說明書，產物放置-20℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 管家基因和鉤藤生物堿合成相關基因的篩選及引物設計 基于鉤藤基因組數據庫篩選12 個候選管家基因分別為18S、GAPDH、Actin6、EF1-β、TUB、CYP、EF1-α、PAL、RNA L13、SAM、cdc73、TUA。另外，基于“基因組+全長轉錄組+代謝組”共表達分析方法篩選鉤藤生物堿生物合成途徑中的“上游途徑基因”，分別為G8H、8-HGO、IS、CYP76A26、7-DLGT、7-DLH、LAMT、SLS、AS、AnPRT、IGPS、TSA、TSB、TDC、STR。使用Primer 5 軟件設計熒光定量引物（表1，表2）并由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 鉤藤生物堿上游合成途徑中關鍵酶基因RT-qPCR 的引物序列Table 1 Primer sequences for key genes in U. rhynchophylla alkaloids upstream synthesis pathway for RT-qPCR

表2 鉤藤12 個候選管家基因RT-qPCR 的引物序列和擴增系數Table 2 Primer sequence and amplification parameters for 12 candidate reference genes of U. rhynchophylla in RT-qPCR

1.2.4 候選管家基因引物特異性測定和RT-qPCR 反應 將不同部位樣品的 cDNA 模板原液等量混合，依次稀釋5 倍，設置5 個濃度梯度，分別為模板原液的50、5-1、5-2、5-3、5-4倍。通過RT-qPCR 反應，獲得每個管家基因在不同梯度下的Ct 值，生成標準曲線，計算斜率（k）、線性相關系數（R2）、以及利用公式E=（10-1/k-1）×100%計算管家基因的擴增效率。

使 用qTower3G 實 時 熒 光 定 量PCR 儀（analytikjena 公司，德國）進行 qPCR 反應，20 μL反應體系：2X SYBR GreenPro TaqHS premix 10 μL（Vazyme，中國），cDNA 2 μL,上下游引物各0.4 μL，RNase free water 7.2 μL。cDNA 模板是原液稀釋6 倍，擴增反應程序為：95℃，30 s；95℃，5 s；60℃，30 s；共40 個循環(huán)，每個樣品進行3 次重復檢測，反應結束后由軟件生成熔解曲線。根據熔解曲線判斷引物的擴增特異性，并且對熒光定量PCR 所得到的數據進行整理，獲得12 個候選管家基因的Ct 值，并用2-△△Ct分析定量結果。

1.2.5 管家基因穩(wěn)定性評價 使用GeNorm［23］、Normfinder［24］和BestKeeper［25］3 個軟件及△Ct 程序［26］和RefFinder 在線網站［27］分析候選管家基因在鉤藤不同部位的表達穩(wěn)定性。GeNorm 和Normfinder 軟件使用前，需將Ct 值轉化為Q 值［28］再進行后續(xù)分析。轉化公式：Q=2Ctmin-Ctsample（Ctsample為候選管家基因在不同實驗組中的Ct 值，Ctmin為候選管家基因在所有實驗組中最小Ct 值）。BestKeeper 和△Ct 可對候選管家基因的Ct 值直接計算分析。根據以上軟件程序的分析結果結合RefFinder 在線網站（http://blooge.cn/RefFinder/）對12 個候選管家基因的穩(wěn)定性進行綜合評估，篩選出在鉤藤不同部位中最優(yōu)的管家基因。根據篩選出的管家基因，對鉤藤生物堿合成上游途徑（吲哚途徑和環(huán)烯醚萜苷類途徑）中的關鍵酶基因在鉤藤不同部位進行表達分析，每個樣品進行3 次技術重復并利用IBM SPSS Statistic 22 軟件進行差異顯著性分析。

2 結果

2.1 鉤藤生物堿含量分析

鉤藤堿和異鉤藤堿在鉤藤蒴果和莖鉤中含量較高，在葉片含量較低，幾乎不在根中積累（圖1）。

圖1 鉤藤不同部位中鉤藤堿（A）和異鉤藤堿（B）的含量Fig. 1 Rhynchophylline and isorhynchophylline contents from U. rhynchophylla different issues

2.2 樣品總RNA質量檢測引物特異性分析

使用1%的瓊脂糖電泳對提取的總RNA 進行完整性檢測。結果表明，鉤藤4 個部位的總RNA 提取完整性較好，28S、18S 和5S 條帶清晰明亮（圖2）。進一步使用超微量分光光度計檢測RNA 濃度和純度，結果顯示，4 個部位（根、莖鉤、葉片、蒴果）的 總RNA 濃 度 分 別 為159.0 ng/μL、111.1 ng/μL、469.1 ng/μL、110.0 ng/μL，所 有 樣 品 的OD260/280在1.90-2.10 范圍內，OD260/230在1.80-1.90 區(qū)間。以上結果表明，樣品總RNA 的完整性較好，純度高，可用于后續(xù)實驗。

圖2 鉤藤不同部位總RNA 瓊脂糖凝膠電泳Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of total RNA from different tissues of U. rhynchophylla

2.3 候選管家基因的RT-qPCR引物特異性分析

以5 個濃度梯度的cDNA 為模板，對12 個候選管家基因的引物進行RT-qPCR 反應，利用下機數據繪制每個管家基因的標準曲線。結果表明，12 個管家基因的相關系數R2均在0.99 以上，各引物的擴增效率介于0.87%-1.09%之間，說明cDNA 模板量與對應的Ct 值呈現較好的線性關系，且12 個候選管家基因的熔解曲線均為單一熔解峰，曲線平滑，不存在引物二聚體（圖3），表明引物特異性強，同一樣品重復性好，可進行后續(xù)實驗。

圖3 12 個候選管家基因的RT-qPCR 引物的熔解曲線Fig. 3 RT-qPCR melting curves of 12 candidate house-keeping genes

2.4 候選管家基因表達豐度分析

Ct 值可直接反應基因的表達豐度，Ct 值越小則表明該基因的表達豐度越高。由圖4 可知，在鉤藤4 個部位中，12 個候選管家基因的Ct 值都處于15.09-28.70 之間，表明表達豐度比較適中。18S的Ct 值最小，介于15.09-16.15 之間，表明其基因表達豐度最高。GAPDH的Ct 值最大，處于24.55-28.70之間，表明其基因表達豐度最低。

圖4 12 個管家基因的Ct 值分布箱線圖Fig. 4 Ct value distribution box-plot of 12 house-keeping genes

2.5 候選管家基因在鉤藤不同部位中表達穩(wěn)定性分析

2.5.1 GeNorm 分析 將候選管家基因的原始Ct 值根據公式轉化為相對表達量Q，再利用GeNorm 軟件計算12 個候選管家基因表達穩(wěn)定值M，通過M值來評估各個管家基因在鉤藤不同部位的表達穩(wěn)定性，M值越小表明候選管家基因的穩(wěn)定性越高，反之越低。軟件默認M值<1.5，表明基因相對穩(wěn)定。GeNorm 軟件分析結果顯示（圖5），在鉤藤4 個部位中，12 個候選管家基因的穩(wěn)定性排序為CYP=EF1-α>EF1-β>cdc73>18S>SAM>TUB>PAL>Acti n6>GAPDH>RNA L13>TUA。除RNA L13和TUA外，其余候選管家基因的M值都小于1.5，說明RNA L13和TUA表達穩(wěn)定性差，不適合作為內參基因。而在不同部位中CYP和EF1-α 的M值最小，其表達最穩(wěn)定。

圖5 12 個候選內參基因的GeNorm 分析Fig. 5 GeNorm analysis of 12 candidate reference genes

GeNorm 軟件還可以通過計算變異值（Vn/n+1）來確定合適的內參基因數目。當Vn/n+1 <0.15 時，n個管家基因達到最適基因數目，反之則需要n+1 個。如圖6 所示，V3/4的比值小于0.15，表明對于鉤藤不同部位的最適管家基因數目為3 個。

圖6 GeNorm 管家基因標準化因子配對變異值分析（Vn/n+1）Fig. 6 Standardization factor paired variation（Vn/n+1）analysis of house-keeping genes according to GeNorm

2.5.2 NormFinder 分析 與GeNorm 軟件分析方法類似，將候選管家基因的原始Ct 值根據公式轉化為相對表達量Q，再利用該軟件計算12 個候選管家基因表達穩(wěn)定值M，表達穩(wěn)定值M與管家基因的表達穩(wěn)定性呈負相關，即表達穩(wěn)定值M越小，管家基因的表達穩(wěn)定性越高，越適合作為管家基因。分析結果表明（圖7），12 個候選內參基因表達穩(wěn)定性依 次 為：SAM>18S>cdc73>EF1-β>PAL>TUB>CYP>Actin6>EF1-α>GAPDH> RNA L13>TUA， 即SAM的M值最小，為0.385，穩(wěn)定性最高；TUA的M值最大，為2.848，穩(wěn)定性最差。

圖7 12 個候選管家基因的NormFinder 穩(wěn)定性分析Fig. 7 NormFinder stability analysis of 12 candidate housekeeping genes

2.5.3 BestKeeper 分 析 BestKeeper 軟 件 不 同 于GeNorm 和NormFinder 軟件，可直接利用RT-qPCR獲得的Ct 值進行分析，計算Ct 值得到的標準偏差（SD）和變異系數（CV），從而判斷候選管家基因的表達穩(wěn)定性。該軟件以SD=1 為閾值，若SD>1,則表明該基因表達不穩(wěn)定，不適合作為管家基因。反之，SD 越小，說明基因表達越穩(wěn)定；CV 則反映出管家基因在不同部位中的表達水平變異程度，CV 越小，變異越小，越穩(wěn)定。由表3 可知，SD 從小到大 依 次 為18S

表3 BestKeeper 分析12 個候選內參基因表達的穩(wěn)定性Table 3 Expression stabilities of 12 candidate reference genes analyzed by BestKeeper

2.5.4 △Ct 分析 通過計算12 個候選管家基因的Ct 的平均標準偏差，來評估基因的表達穩(wěn)定性。平均標準偏差越小，基因表達越穩(wěn)定。△Ct 分析結果表明（圖8），在鉤藤4 個部位中，12 個候選管家基因的穩(wěn)定性依次為SAM>18S>EF1-β>cd-c73>CYP>PAL>TUB>EF1-α> Actin6> GAPDH> RNA L13>TUA。即SAM基因的平均標準偏差最小，該基因表達最穩(wěn)定。而TUA基因表達穩(wěn)定性最差。

圖8 12 個候選管家基因的△Ct 穩(wěn)定性分析Fig. 8 △Ct stability analysis of 12 candidate house-keeping genes

2.5.5 管家基因穩(wěn)定性綜合分析 RefFinder 分析是根據每個候選管家基因在各程序中的結果分配適當的權重，然后通過計算所有算法的穩(wěn)定值權重的幾何平均值進行整體排序的穩(wěn)定性綜合評價的方法。RefFinder 分析方法避免了單個算法的片面性，能全面地分析候選管家基因的表達穩(wěn)定性。通過RefFinder 計算出的穩(wěn)定值，來評估基因的表達穩(wěn)定性，穩(wěn)定值越小，管家基因的穩(wěn)定性越好。RefFinder 分析結果顯示，在鉤藤不同部位中管家基因的穩(wěn)定性依次為SAM（3.08）>18S（3.16）>cdc73（4.76）>EF1-β（5.02）>CYP（6.00）>TUB（6.22）>PAL（6.86）>EF1-α（7.12）>TUB（7.44）>Actin6（7.96）>RNA L13（8.68）>GAPDH（9.12）>TUA（12.0）。因此，結合以上所有分析方法，在鉤藤不同部位中，SAM的穩(wěn)定值最高，其穩(wěn)定性具有普適性，適合作為鉤藤不同部位的管家基因。

2.6 鉤藤生物堿上游途徑相關基因表達分析

通過“轉錄組+表達譜+含量”共表達關聯(lián)分析方法篩選大量候選基因，這種模式對于多基因或超基因家族候選序列的篩選具有很高的預見性，能夠大大縮小后續(xù)基因研究范圍。本課題組前期利用轉錄組數據發(fā)現了羅漢果甜苷V 生物合成通路中22 類基因，結合“轉錄組+表達譜+含量”共表達分析方法從80 條CYP450 和90 條UPDG 中篩選了可能參與羅漢果甜苷V 合成的7 個CYP450和5 個UDPG 候選酶基因［29］，其中各有1-2 個基因通過原核表達及酵母得到了驗證［30-31］，共表達模式篩選重點候選基因對于提高其他物種的超基因家族目的基因的篩選效率具有重大的參考價值。以STR 基因為例（圖9），總共從基因組中鑒定了22 條STR 候選基因，通過轉錄組、含量共表達分析，發(fā)現有3 條序列與鉤藤堿和異鉤藤堿含量聚為一類，從中挑選了g27792 基因作為重點序列進行了RT-qPCR 分析。本研究采用“基因組+轉錄組+代謝組”共表達關聯(lián)分析的方式，同時對途徑中其他基因進行篩選，這有效地縮小了基因功能驗證的范圍，提高了篩選效率。以SAM為管家基因，對鉤藤不同部位中的鉤藤生物堿上游途徑的關鍵酶基因進行了表達模式分析。結果（圖10）依次為環(huán)烯醚萜苷類途徑中的Geraniol 8-hydroxylase（G8H,g4369）、8-hydroxygeraniol dehydrogenase（8-HGO,g27625）、Irid-oid synthase（IS, g8955）、Nepetalactol monooxygenase（7-DLS/CYP76A2, g24241）、7-deoxyloganetic acid glucosyltransferase（7-DLGT/UGT78A5，g32889）、7-deoxyloganate 7-hydroxylase（7-DLH/CY-P2A224，g31614）、Loganate methyltransferase（LAMT，g36536）、Secologanin synthase（SLS/CYP72A1，g43641）；色胺途徑中的Anthranilate synthase（AS,g8946）、Anthranilate phosphoribosyltransferase（An-PRT, g21597）、Indole-3-glycerol phosphate synthase（IGPS, g14095）、Tryptophan synthase alpha chain（TSA，g3418）、Tryptophan synthase beta chain（TSB，g36741）、L-tryptophan decarboxylase（TDC，g28930）以及Strictosidine synthase（STR）在鉤藤4 個部位的表達量。

圖9 異胡豆苷合酶基因篩選熱圖Fig. 9 Screening heatmap of strictosidine synthase gene

圖10 以SAM 為管家基因時鉤藤生物堿生物合成上游途徑中關鍵酶基因表達模式分析Fig. 10 Expression analysis of upstream pathway genes involved in TIAs biosynthesis using SAM as house-keeping gene

G8H、8-HGO、IS、7-DLS、7-DLGT、7-DLH基因的表達模式基本一致，在莖鉤和葉片的表達量高，在根中的表達量最低。LAMT和SLS基因在葉片中的表達量明顯高于其他部位。實驗結果表明，AS、AnPRT、IGPS、TSA、TSB基因主要在蒴果中進行表達，其次是在莖鉤和葉片中表達，在根中表達最少；TDC基因主要在葉片中表達，在根中有微量表達，不在莖鉤和蒴果中表達；STR基因主要在蒴果中表達，其次在莖鉤中表達，在根中表達量最少，這與鉤藤堿和異鉤藤堿在鉤藤4 個部位中的含量變化呈現明顯相關性，說明STR基因作為鉤藤生物堿合成途徑中的關鍵酶基因，調控著鉤藤生物堿的含量。上游途徑的量直接或間接決定終產物的產量，酶反應速率又決定了代謝途徑的流量。

3 討論

RT-qPCR 是分析基因表達模式的重要技術，也是藥用植物次生代謝產物合成調控研究中必不可少的實驗技術，而穩(wěn)定的管家基因是獲得準確實驗結果的重要前提。植物的管家基因大部分具有維持細胞生命活動的功能，比如TUA、TUB、β2-MG、β-Actin是構成細胞器骨架的重要成分，GADPH、SAM、G6DPH、EF-1β則是參與植物體基本生化代謝過程。同一個管家基因在不同的實驗條件、不同物種以及不同組織部位中穩(wěn)定性具有差異。因此，要根據實際情況篩選最佳的管家基因。如SAM基因是花葉唐竹4 種葉色中表達最穩(wěn)定的內參基因［32］；Actin和SAM則是研究赤霞珠葡萄發(fā)育后期基因表達的理想看家基因［33］；18S是在分析紫鴨跖草根系在不同銅濃度脅迫時表達最穩(wěn)定的管家基因［34］。

本研究選取了18S、SAM、CYP、EF1-β、cdc73、TUB、EF1-α、PAL、Actin6、RNA L13、GAPDH、TUA這12 個植物中常見的管家基因。通過GeNorm、NormFinder、BestKeeper、ΔCT 以及RefFinder 綜合評估候選管家基因分別在鉤藤根、莖鉤、葉片、蒴果中的穩(wěn)定性。根據管家基因篩選結果顯示，5 個軟件所得結果基本一致，但也存在一定的差異，這可能是軟件算法不同造成的。在鉤藤的不同部位中，GeNorm 分析得出，CYP和EF1-α的穩(wěn)定性最好；而NormFinder 和 ΔCT 分析中SAM均是表達最穩(wěn)定的管家基因；而在BestKeeper 分析中，18S的穩(wěn)定性最好，但SAM的SD、CV 值與18S差異不大，排名僅次于18S；通過RefFinder 綜合評估所有分析結果并進行穩(wěn)定性排名，SAM是鉤藤不同部位中最適的管家基因。綜合以上5 款軟件，SAM更適合作為鉤藤的管家基因。

鉤藤生物堿生物合成的上游途徑分為環(huán)烯醚萜苷類途徑和色胺途徑。在環(huán)烯醚萜苷類途徑中，在植物韌皮部表皮細胞中，G8H、8-HGO、IS、7-DLS、7-DLGT以及7-DLH參與了氧化、還原、糖基化及甲基化等反應，形成馬錢子酸［35］。本研究發(fā)現，這些基因主要在莖鉤和葉片中表達，可能是因為莖鉤和葉片中韌皮部組織發(fā)達有關。隨之馬錢子酸在某種尚未闡明的機制下被運送到葉面表皮細胞［36］，在LAMT 和SLS 的作用下生成斷馬錢子苷（secologanin），這與本研究的實驗結果LAMT和SLS基因在葉片中的表達量最高一致。在色胺途徑中，AS、AnPRT、IGPS、TSA、TSB基因主要在蒴果中進行表達，其次是在莖鉤和葉片中表達，在根中表達最少。Noé 等［37］完成了 TDC 的首次分離純化，該酶存在于植物細胞的細胞質中，只在葉片的上表皮細胞中表達，這與本實驗結果一致，TDC基因在葉片上大量表達，在莖鉤和蒴果中不表達。而STR基因主要在莖鉤中表達，其次是蒴果，根中的表達量最低。這與鉤藤堿和異鉤藤堿在蒴果和莖鉤中的含量高，葉片和根中含量低的趨勢一致，證明該基因很可能是參與鉤藤生物堿生物合成的STR候選基因。

4 結論

本研究選取了18S、SAM、CYP、EF1-β、cdc73、TUB、EF1-α、PAL、Actin6、RNA L13、GAPDH、TUA這12 個植物中常見的管家基因，通過GeNorm、NormFinder、BestKeeper、ΔCT 以及RefFinder 綜 合評估候選管家基因，最終篩選出SAM可作為鉤藤不同部位RT-qPCR 分析時最合適的管家基因。對鉤藤生物堿生物合成上游途徑中關鍵酶基因進行篩選，以SAM為看家基因對這些基因在鉤藤不同部位的表達模式進行分析，結果表明這些關鍵酶基因在鉤藤不同部位中的表達具有特異性，其變化趨勢與含量趨勢基本一致，可能參與鉤藤生物堿生物合成途徑。