噬菌體防控沙門氏菌生物被膜的研究進(jìn)展

李曉宇，遲新月，王林會(huì)，馬永生，魏炳棟，王麗麗，張慧君，孫曉雯，李仕彬，李紀(jì)彬，徐永平*

1(大連理工大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連，116024)2(大連賽姆生物工程技術(shù)有限公司，遼寧 大連，116620)3(大連海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連，116023)4(吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧分院，吉林 公主嶺，136100)

沙門氏菌(Salmonellaspp.)屬于腸桿菌科、革蘭氏陰性兼性厭氧菌，血清型共有2 600多種，是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致食源性疾病的重要病原菌之一。沙門氏菌極易污染水源、動(dòng)物性食品(如肉蛋奶等)、生鮮果蔬等，嚴(yán)重威脅公共健康和食品安全?？梢鸬氖澄镏卸局饕憩F(xiàn)為傷寒、急性腸胃炎和敗血癥等，一旦進(jìn)入血液，會(huì)導(dǎo)致系統(tǒng)性炎癥甚至死亡。在歐盟，沙門氏菌近年來一直是危害僅次于空腸彎曲桿菌的第二大常見人畜共患病致病菌[1]。在美國(guó)，沙門氏菌每年導(dǎo)致約135萬例疾病、26 500例住院治療和420例死亡[2]。我國(guó)在2020年共計(jì)爆發(fā)286起沙門氏菌食物中毒事件，造成3 446人次患病，占細(xì)菌性食物中毒的首位[3]。

食品受致病菌污染的途徑很多，其中交叉污染尤其是固體食品與食品加工接觸面之間的接觸污染是食品加工業(yè)中污染率最高的污染途徑。沙門氏菌可以黏附于不同的食品加工接觸面如不銹鋼、玻璃、鋁箔、聚乙烯和聚氟乙烯等，產(chǎn)生大量的多聚物基質(zhì)包裹在自身菌體外，形成生物被膜(biofilm)保護(hù)細(xì)菌在惡劣條件下生存并轉(zhuǎn)移到新環(huán)境，加速細(xì)菌的交叉污染[4]。多種食品生產(chǎn)線的加工接觸面中已檢測(cè)到沙門氏菌生物被膜的存在，并引發(fā)多起食物中毒事件。與浮游菌相比，生物被膜能夠大大提高致病菌對(duì)各種化學(xué)殺菌劑和環(huán)境變化的耐受性，這使得即使在食品加工過程中經(jīng)過嚴(yán)格的清洗消毒程序也難以有效將其去除，從而造成持續(xù)污染[5]。因此，控制食品中沙門氏菌的污染，特別是防止其形成生物被膜交叉污染食品，成為食品工業(yè)面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。

食品工業(yè)中控制的傳統(tǒng)方法主要是熱殺菌(高壓蒸汽滅菌、微波加熱等)和化學(xué)消毒(二氧化氯、過氧乙酸、季銨鹽類等)[6-7]。然而熱殺菌會(huì)影響食品的感官和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值；化學(xué)消毒存在腐蝕食品加工設(shè)備、易使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性、消毒劑殘留等食品安全問題。因此，亟待開發(fā)針對(duì)食源性致病菌生物被膜控制和清除的新型策略。

噬菌體(bacteriophage)是細(xì)菌的天敵，與化學(xué)消毒劑相比，具有特異性強(qiáng)、自我增殖快、安全性高、研發(fā)時(shí)間短等突出優(yōu)勢(shì)[8]。自2006年以來，已陸續(xù)有多款噬菌體產(chǎn)品作為食品生物防控劑獲得美國(guó)食品藥物管理局 (Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)，用于控制禽類、肉制品和其他食品中的單增李斯特菌、沙門氏菌等食源性致病菌污染[9]。這些進(jìn)展突出了噬菌體控制食源性致病菌的巨大潛力，并證明了噬菌體在保障食品安全方面的可行性。近年來，隨著對(duì)噬菌體研究的深入，研究人員發(fā)現(xiàn)噬菌體及其衍生物不僅可以有效抑制生物被膜的形成，而且可以破壞已形成的生物被膜。本文針對(duì)沙門氏菌生物被膜的危害，綜述了國(guó)內(nèi)外應(yīng)用噬菌體破解沙門氏菌生物被膜的研究進(jìn)展，詳細(xì)地闡述了噬菌體的作用機(jī)制及應(yīng)用現(xiàn)狀，并對(duì)其未來研究方向進(jìn)行了展望。旨在為沙門氏菌生物被膜的有效控制提供新的思路，為噬菌體的進(jìn)一步開發(fā)與應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 沙門氏菌的生物被膜

1.1 沙門氏菌生物被膜主要結(jié)構(gòu)成分

生物被膜中的細(xì)菌嵌入在自產(chǎn)的胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)基質(zhì)中，使其免受紫外線輻射、高鹽度、高壓、極端溫度與pH、抗生素和營(yíng)養(yǎng)不良等極端環(huán)境的侵害[10]。EPS的組成取決于物種和環(huán)境條件，通常由多糖、蛋白質(zhì)及核酸等組成[11]。卷曲菌毛、纖維素和細(xì)胞表面蛋白BapA是沙門氏菌生物被膜的主要基質(zhì)成分，并且對(duì)生物被膜的形成以及在各種生物和非生物表面存活至關(guān)重要[12-13]。

卷曲菌毛是淀粉樣纖維，與表面黏附、細(xì)胞聚集、環(huán)境持久性和生物被膜形成等有關(guān)，是沙門氏菌細(xì)胞外基質(zhì)中主要蛋白質(zhì)成分[12]。參與生物被膜形成的另一種蛋白質(zhì)是Ⅰ型菌毛，是最常見的黏附細(xì)胞器，決定著生物被膜形成時(shí)最初的黏附，并且是重要的毒力因子[14]。除此之外，LATASA等[15]報(bào)道BapA是腸炎沙門氏菌形成生物被膜所需的一種細(xì)胞表面蛋白，bapA的缺失會(huì)導(dǎo)致生物被膜形成能力的喪失，而bapA的過度表達(dá)使生物被膜的形成增加。通過CsgD的作用，bapA的表達(dá)與卷曲和纖維素的表達(dá)相協(xié)調(diào)，卷曲菌毛的過度生產(chǎn)可以彌補(bǔ)bapA缺陷株的生物被膜形成障礙[15]。

纖維素是沙門氏菌EPS胞外多糖組分中的一種重要物質(zhì)，負(fù)責(zé)黏性結(jié)構(gòu)和細(xì)胞間遠(yuǎn)程的相互作用。塑料上生物被膜的持久性也受纖維素的影響，當(dāng)腸炎沙門氏菌菌落在沒有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的塑料上培養(yǎng)數(shù)月時(shí)，野生株的存活率比纖維素和菌毛缺陷的突變體高[16]。有研究報(bào)告了鼠傷寒沙門氏菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生纖維素，并且阻止纖維素的合成會(huì)增加細(xì)菌毒性[17]。這現(xiàn)象表明，纖維素是減弱沙門氏菌毒力的決定性因素。

除上述的基質(zhì)成分外，胞外DNA(eDNA)也在生物被膜的形成中起關(guān)鍵作用，包括為固著細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)與能量促進(jìn)生物被膜形成、促進(jìn)細(xì)胞水平基因轉(zhuǎn)移(horizontal gene transfer，HGT)和為生物被膜結(jié)構(gòu)提供穩(wěn)定性[18]，WANG等[19]首次發(fā)現(xiàn)沙門氏菌生物被膜中存在eDNA，這導(dǎo)致沙門氏菌在聚苯乙烯和玻璃上生物被膜的形成較少，但對(duì)預(yù)先建立在聚苯乙烯和玻璃表面上的生物被膜結(jié)構(gòu)沒有顯著影響。

1.2 細(xì)菌生物被膜的生命周期

細(xì)菌生物被膜的發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的、動(dòng)態(tài)并且循環(huán)的過程，主要包括3個(gè)階段：附著/黏附、成熟和分散(圖1)[20-21]。附著可以進(jìn)一步分為初始可逆附著和不可逆附著兩個(gè)階段，在附著過程中，鞭毛和Ⅳ型菌毛發(fā)揮著重要的作用，并且細(xì)菌在不可逆附著階段可以承受更強(qiáng)的物理或化學(xué)剪切力。生物被膜的第一層形成后，隨著細(xì)菌的增殖以及對(duì)流體中其他細(xì)菌的大量招募，細(xì)菌分泌越來越多的EPS，生物被膜也由一層發(fā)展為多層的成熟生物被膜。生物被膜成熟后，由于缺乏營(yíng)養(yǎng)和細(xì)菌間競(jìng)爭(zhēng)激烈等原因，最終導(dǎo)致生物被膜中的一部分發(fā)生分散，浮游細(xì)菌的釋放促進(jìn)了其他表面新生物被膜的產(chǎn)生[22]。生物被膜循環(huán)往復(fù)的生命周期是其難以根除的一大原因，且生物被膜在不同生長(zhǎng)階段對(duì)抗菌劑的耐受程度也不同，成熟的生物被膜更難被清除，因此預(yù)防生物被膜的形成變得更為重要。

圖1 細(xì)菌生物被膜形成過程

2 噬菌體防控沙門氏菌生物被膜的研究現(xiàn)狀

2.1 噬菌體的生命周期

噬菌體是一種感染細(xì)菌的高特異性病毒，由蛋白質(zhì)和核酸組成，其生命周期可分為兩大類(圖2)：裂解周期和溶原周期[23-24]。在裂解周期中，感染過程始于噬菌體尾部蛋白不可逆的附著在細(xì)菌細(xì)胞表面的受體上，一旦噬菌體DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞，就會(huì)合成特定的酶來驅(qū)動(dòng)宿主細(xì)胞產(chǎn)生新的噬菌體顆粒和細(xì)胞裂解所需的蛋白質(zhì)。最終發(fā)生細(xì)胞裂解、子代噬菌體釋放和鄰近易感細(xì)胞感染。當(dāng)噬菌體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并未發(fā)生裂解，而是作為前噬菌體持續(xù)存在于宿主細(xì)胞基因組中，此時(shí)噬菌體進(jìn)入了溶原周期。但不同的環(huán)境信號(hào)會(huì)導(dǎo)致進(jìn)入溶原周期的噬菌體回到裂解周期。

圖2 噬菌體的生命周期

2.2 噬菌體作用于生物被膜的機(jī)制

自然界中生物被膜普遍存在，基質(zhì)中的細(xì)菌與噬菌體之間的相互作用頻繁進(jìn)行，近十余年來相關(guān)研究論文的數(shù)量逐漸上升[25]。噬菌體與生物被膜內(nèi)細(xì)菌的作用不同于抗生素與消毒劑，這種差異背后有多種機(jī)制[26]：(1)當(dāng)裂解性噬菌體在入侵宿主細(xì)胞后，釋放子代噬菌體，導(dǎo)致該部位噬菌體數(shù)量增加，通過基質(zhì)擴(kuò)散并消滅產(chǎn)生EPS的細(xì)菌；(2)生物被膜內(nèi)持久性細(xì)胞可以被噬菌體感染，這些噬菌體即使不復(fù)制，也可以留在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)直到他們被重新激活，然后開始進(jìn)入裂解周期，最終裂解宿主；(3)噬菌體產(chǎn)生的多糖解聚酶，可以特異性識(shí)別、結(jié)合和消化宿主細(xì)胞的EPS，破壞生物被膜結(jié)構(gòu)促進(jìn)噬菌體滲透到內(nèi)層侵染細(xì)菌[27]。

目前已有研究團(tuán)隊(duì)鑒定出160個(gè)解聚酶，并且發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)解聚酶編碼在噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白(尾部纖維、基板或頸部)的開放閱讀框中，或與之非常接近，因此被認(rèn)為是結(jié)構(gòu)蛋白[27]。根據(jù)解聚酶的作用機(jī)制可將其分為兩類：水解酶和裂解酶，這兩種酶都可使多糖分解為可溶性低聚糖，并破壞碳水化合物屏障[28]。噬菌體編碼的內(nèi)溶素(endolysin)屬于解聚酶的一種，它在噬菌體復(fù)制后期以水解酶的方式切割肽聚糖導(dǎo)致細(xì)胞破裂并釋放子代噬菌體，可作為抗菌劑使用[29-30]。圖3是噬菌體T5內(nèi)溶素作用于大腸桿菌細(xì)胞壁的過程，該過程涉及4種特異性蛋白質(zhì)的協(xié)同作用：穿孔素(holin)形成內(nèi)膜孔提供進(jìn)入周質(zhì)的通道；內(nèi)溶素降解細(xì)胞壁的肽聚糖；兩個(gè)跨膜蛋白i-spanin和o-spanin協(xié)助噬菌體蛋白在周質(zhì)中相互作用，在裂解的最后階段使內(nèi)外膜融合[31]。目前，已有很多研究表明內(nèi)溶素具有良好的抗菌和抗生物被膜活性[32]。

IM-內(nèi)膜；OM-外膜；PG-肽聚糖層

2.3 噬菌體及內(nèi)溶素防控沙門生物被膜的應(yīng)用效果

已有的研究表明，單一噬菌體、混合噬菌體或噬菌體與其他防控措施聯(lián)合使用，均對(duì)沙門氏菌生物被膜有一定的消除或抑制生長(zhǎng)效果(表1～表3)?？傮w來看，與清除生物被膜相比，噬菌體在抑制生物被膜的形成方面效果更佳。GONZLEZ等[33]研究表明，噬菌體在生物被膜內(nèi)的擴(kuò)散受膜內(nèi)生物量、菌株對(duì)噬菌體的敏感性、噬菌體濃度、以及膜內(nèi)噬菌體滅活酶的影響。除此之外，生物被膜的生長(zhǎng)時(shí)間也會(huì)影響噬菌體的作用效果。VIDAKOVIC等[34]發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)48 h的生物被膜可被噬菌體迅速清除，而生長(zhǎng)超過60 h后，噬菌體僅在生物被膜邊緣侵染，難以擴(kuò)散到生物被膜內(nèi)部，這主要?dú)w因于成熟生物被膜基質(zhì)中卷曲菌毛的保護(hù)作用。

表1 利用單一噬菌體防控沙門氏菌生物被膜的效果

目前針對(duì)單一噬菌體應(yīng)用中存在的宿主譜窄、細(xì)菌易產(chǎn)生抗性的局限性，采用噬菌體雞尾酒、噬菌體的內(nèi)溶素以及聯(lián)合其他防控措施防控沙門氏菌生物被膜的相關(guān)研究發(fā)展迅速，作用效果詳見表2和表3。相較于噬菌體單獨(dú)應(yīng)用，上述方法對(duì)生物被膜的清除率有明顯提升。例如YüKSEL等[35]將噬菌體P22與外膜通透劑EDTA和乳酸鏈球菌素(Nisin)進(jìn)行組合，在噬菌體效價(jià)較低時(shí)也可清除90%以上的生物被膜。內(nèi)溶素與微酸性次氯酸水的組合可去除鼠傷寒沙門氏菌生物被膜99%的活菌。需要指出的是，內(nèi)溶素使用前需用氯仿預(yù)處理菌液，以促進(jìn)內(nèi)溶素到達(dá)細(xì)菌的肽聚糖層，然而氯仿并不適用于食品工業(yè)的應(yīng)用。

表2 利用噬菌體混合液防控沙門氏菌生物被膜的效果

表3 噬菌體與其他防控措施聯(lián)用防控沙門氏菌生物被膜的效果

3 總結(jié)與展望

沙門氏菌在食品及其接觸表面形成的生物被膜污染對(duì)于食品工業(yè)構(gòu)成極大威脅，然而使用傳統(tǒng)的化學(xué)消毒劑難以有效將其完全去除而且極有可能誘發(fā)新的食品安全問題。本文系統(tǒng)綜述了噬菌體和其編碼的裂解酶破解沙門氏菌生物被膜的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)和巨大潛力，這無疑為解決沙門氏菌生物被膜的控制和清除提供了新的見解與思路。目前相關(guān)的研究在國(guó)外已經(jīng)較為火熱，而國(guó)內(nèi)對(duì)于噬菌體防控沙門氏菌生物被膜的研究尚處于起步階段。需要指出的是，應(yīng)用噬菌體防控生物被膜也有其限制性因素，如噬菌體裂解譜窄及細(xì)菌易產(chǎn)生抗性、生物被膜基質(zhì)的阻礙、基質(zhì)內(nèi)細(xì)菌多樣性等。因此，本文基于噬菌體防控沙門氏菌生物被膜的研究現(xiàn)狀，對(duì)其未來研究方向進(jìn)行以下幾點(diǎn)展望。

(1)拓寬噬菌體的宿主譜：噬菌體的高度專一性特點(diǎn)導(dǎo)致噬菌體的宿主譜窄，并且細(xì)菌容易對(duì)其產(chǎn)生抗性，這極大地限制了噬菌體的應(yīng)用。目前常見策略是開發(fā)噬菌體“雞尾酒”來拓寬噬菌體的宿主譜，但如何優(yōu)化噬菌體組合，降低噬菌體耐受的可能性和速度是研發(fā)的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。此外，還可以通過改變噬菌體尾絲蛋白的結(jié)構(gòu)構(gòu)建工程化噬菌體，從而擴(kuò)大噬菌體的宿主范圍。

(2)提高噬菌體制劑的穩(wěn)定性：食品加工過程中的外界條件，如pH、溫度以及抑制性化合物等會(huì)對(duì)噬菌體控制和清除生物被膜的效果產(chǎn)生影響。因此，開發(fā)可耐受外界環(huán)境因素的噬菌體及其裂解酶，對(duì)其實(shí)際的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用至關(guān)重要。

(3)噬菌體與其他控制策略聯(lián)合：生物被膜致密的EPS基質(zhì)會(huì)阻礙噬菌體對(duì)細(xì)菌受體的識(shí)別，被認(rèn)為是限制噬菌體擴(kuò)散到生物被膜中的主要障礙之一。目前使用噬菌體聯(lián)合其他控制策略作用沙門氏菌生物被膜已初顯成效，這種聯(lián)合作用方式能相互取長(zhǎng)補(bǔ)短，有望最大程度地提高噬菌體的作用效果，將是未來噬菌體清除生物被膜的重要研究方向之一。