理性設計提高奧氏嗜熱鹽絲菌精氨酸脫亞胺酶的熱穩(wěn)定性

王文玉，張濤

(江南大學， 食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

瓜氨酸是一種天然的非蛋白質(zhì)α-氨基酸，存在于植物[1]、哺乳動物[2]和微生物[3]中。作為一種重要的功能性氨基酸，其在人體代謝中參與“NO循環(huán)”生成重要的信號分子NO[4]；另一方面，還參與“尿素循環(huán)”消除增加中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙的有害氨[5]。研究表明，瓜氨酸不被肝臟或腸道精氨酸酶分解，并能繞過肝臟攝取和降解[6]，同時還是精氨酸酶的抑制劑[7]，因此，瓜氨酸在提高精氨酸的生物利用度和NO產(chǎn)量方面比精氨酸更加有效[8]，被應用于治療代謝綜合征[9]、心血管疾病[10]、勃起功能障礙[11]以及提高運動表現(xiàn)力[7]和抗氧化[12]等方面，作為一種有吸引力的藥物營養(yǎng)素，瓜氨酸能潛在的解決許多與生活方式或者與年齡有關(guān)的疾病，故被廣泛應用于食品、醫(yī)藥和保健品領(lǐng)域。

目前，瓜氨酸可通過天然植物提取、化學合成、微生物發(fā)酵和微生物酶法等方法進行生產(chǎn)[13]。酶法轉(zhuǎn)化因條件溫和、轉(zhuǎn)化率高、環(huán)境友好和下游分離純化簡便等優(yōu)勢而成為研究熱點[14]。精氨酸脫亞胺酶(arginine deiminase，ADI, EC 3.5.3.6)作為生產(chǎn)瓜氨酸的關(guān)鍵酶，不可逆地催化精氨酸水解為瓜氨酸和氨，至今，已有許多不同微生物來源的ADI被報道，包括支原體(Mycoplasmaarginini)、乳酸球菌(Lactococcuslactisssp.Lactis)、鹽桿菌(Halobacteriumsalinarium)、惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)、煙曲霉(Aspergillusfumigatus)、變形假單胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)等[3]。大多ADI的最適溫度在37～60 ℃，來源于L.lactissubsp.lactis的ADI最穩(wěn)定，在50 ℃的半衰期為90 min[15]；而來源于L.lactis的突變體酶活力最高，為195.7 U/mg[14]。應用ADI進行瓜氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)不僅希望ADI具有較高的催化活力進行高效轉(zhuǎn)化；還希望ADI有較好的熱穩(wěn)定性適配工業(yè)生產(chǎn)需要，因為反應在較高溫度下進行可以增加底物的溶解度和生物利用度、提高反應速度、減少中溫菌污染[16]。除了用于制備瓜氨酸，由于ADI具備消耗精氨酸的能力，還用于治療外源性精氨酸依耐性癌細胞，如肝癌、黑色素瘤等營養(yǎng)缺陷型癌細胞，但在臨床應用上也存在半衰期短和免疫原性等問題[17]。

為了獲得具有目的性質(zhì)的酶，除了進行新酶篩選外，對現(xiàn)存的酶進行蛋白質(zhì)工程改造也是一種有效的手段。蛋白質(zhì)工程是一種基于重組DNA技術(shù)進而改變蛋白質(zhì)氨基酸序列的方法，能改造天然酶使其具有所需功能[18]。近年來，出現(xiàn)的許多酶工程策略，包括定向進化、理性設計、計算機輔助設計等方式，其中使用計算機輔助酶的理性設計是研究的一大熱點[19]。ADI的定向進化研究較多，鮮少利用理性設計改善其熱穩(wěn)定性的報道，CAI等[13]利用HoTMuSiC預測的氨基酸溫度因子(B-factor)進行了來源于EnterococcusfaecalisSK23.001的ADI定點突變，得到的2個單點突變體F269Y以及G292P在45 ℃下的半衰期較原始酶分別提高了3.4倍和5.6倍，雙點組合突變體F269Y/G292P半衰期提高了5.9倍。HotSpot Wizard網(wǎng)頁服務器可自動識別熱點用于提高酶的穩(wěn)定性、催化活性和底物特異性的非保守氨基酸，這些氨基酸可分為基于序列的保守但不相同的殘基和共同進化殘基以及基于三維結(jié)構(gòu)的熱點，已成功應用于許多酶的改造[20]。在前期研究中，本實驗室克隆表達了來源于奧氏嗜熱鹽絲菌的精氨酸脫亞胺酶(H-ADI)，通過酶學性質(zhì)鑒定后發(fā)現(xiàn)該酶的熱穩(wěn)定性有待進一步提升，因此，本研究基于三維結(jié)構(gòu)分析和HotSpot Wizard在線服務器，對來源于奧氏嗜熱鹽絲菌的H-ADI進行熱穩(wěn)定性改造，并將突變體應用于瓜氨酸的實際生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)及帶有目的基因的重組質(zhì)粒pET-28a(+)-H-ADI均保藏于本實驗室。

液體LB培養(yǎng)基(g/L)：氯化鈉10、胰蛋白胨10、酵母提取物5，調(diào)節(jié)pH至7.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。

蛋白分子質(zhì)量標準、上樣緩沖液(5×)、分離膠緩沖液、濃縮膠緩沖液，雅酶(上海)生物醫(yī)藥科技公司；核酸染料(4S Green Plus)、IPTG、咪唑(C3H4N2)、瓊脂糖，生工生物(上海)工程有限公司；核酸Marker、2×PrimeSTAR Max Premix、Q.cut Dpn I、Q.cut Buffer(10×)、限制性內(nèi)切酶，寶生物(TaKaRa)有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，諾唯贊(南京)生物科技有限公司；Ni-NTA親和層析填料，通用電氣醫(yī)療(GE Healthcare)公司；其他分析純及以上試劑，國藥集團化學有限公司。

1.2 儀器與設備

Aminex HPX-87column型蛋白電泳儀、T100型PCR儀，德國Eppendorf有限公司；DYY-68型蛋白電泳儀，美國Bio-Rad公司；ZCZY-CS8型恒溫培養(yǎng)搖床、DNP-9082型恒溫培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；GI54DWS型立式高壓滅菌鍋，廈門致微儀器有限公司；高效液相色譜系統(tǒng)、VWD檢測器，美國Agilent公司；Nano DSC差式掃描量熱儀，美國Waters公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 精氨酸脫亞胺酶的同源建模及突變位點選擇

奧氏嗜熱鹽絲菌來源的H-ADI的NCBI登錄號為WP_012635610.1，選取氨基酸同源性大于30%且已解析晶體結(jié)構(gòu)的蛋白序列作為模板提高建模的準確性。應用SWISS-MODEL在線建模服務器對來源于奧氏嗜熱鹽絲菌的H-ADI進行三維結(jié)構(gòu)預測，使用PROCHECK服務器檢測模型質(zhì)量。此外，將H-ADI的蛋白序列提交至HotSpot Wizard在線服務器進行預測，再結(jié)合結(jié)構(gòu)分析之后，選擇了G65N、E81D、F111L、N142L、T180Y、V187T、A190P、T215Y、A231L、Q255M這10突變位點。采用簡便的QuikChangeTM法進行定點突變，引物序列如表1所示。

表1 突變位點引物設計

1.3.2 突變菌株構(gòu)建

以實驗室前期構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET-28a(+)-H-ADI為模板，進行全質(zhì)粒PCR擴增，PCR反應體系為模板質(zhì)粒1 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，Primer STAR Max 25 μL，ddH2O 20 μL。

PCR條件設置：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)30次；72 ℃繼續(xù)延伸3 min；4 ℃保存。擴增產(chǎn)物在37 ℃條件下用DpnⅠ消化2 h去除甲基化的模板質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coliDH5α進行質(zhì)粒擴增，卡那霉素抗性固體平板進行陽性轉(zhuǎn)化子篩選，測序成功的突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達宿主E.coliBL21(DE3)獲得突變重組菌株。

1.3.3 突變體的純化表達

挑取在卡那霉素抗性(Kan 50 μg/mL)固體平板生長的野生型和突變型E.coliBL21(DE3)工程菌株單菌落于5 mL液體培養(yǎng)基，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)12 h后按2%的接種量轉(zhuǎn)接至200 mL液體培養(yǎng)基(Kan 50 μg/mL)，在37 ℃，200 r/min培養(yǎng)至OD600值為0.5～0.6，添加終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，在28 ℃，200 r/min下培養(yǎng)6 h誘導目的蛋白表達，于6 000 r/min，4 ℃離心5 min收集菌體。

15 mL細胞裂解液(50 mmol/L Na2HPO4·12H2O-NaH2PO4·2H2O，100 mmol/L NaCl，pH 7.0)重懸菌體后置于冰盒中，在超聲破碎機(功率200 W，開1 s停2 s)持續(xù)破碎20 min，然后于4 ℃，8 000 r/min離心5 min收集上清液，即粗酶液；將粗酶液上樣Ni-NTA親和層析柱后用上樣緩沖液液(50 mmol/L Na2HPO4·12H2O-NaH2PO4·2H2O，500 mmol/L NaCl，pH 7.0)除去未結(jié)合的蛋白，再用雜蛋白洗脫液(50 mmol/L Na2HPO4·12H2O-NaH2PO4·2H2O，500 mmol/L NaCl，50 mmol/L咪唑，pH 7.0)去除結(jié)合較弱的雜蛋白，最后用洗脫緩沖液(50 mmol/L Na2HPO4·12H2O-NaH2PO4·2H2O，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑，pH 7.0)洗脫得到目的蛋白。分離純化后的酶溶液置于透析袋中于4 ℃條件下透析3次，透析液隔6 h更換1次。首先在50 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.0，含10 mmol/L EDTA·2Na)中透析1次去除金屬離子，再在50 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.0)透析2次。

采用SDS-PAGE測定蛋白亞基分子質(zhì)量和純度；此外，采用Lowry法測定突變體酶的蛋白濃度，使其在后續(xù)實驗中保持添加量相同。

1.3.4 酶活力測定

酶反應體系：總體積為1 mL，500 μL 100 g/LL-精氨酸(pH 6.5)，0.05 mg重組酶，剩余體積用50 mmol/L pH 6.5的磷酸鹽緩沖液補足。反應體系放入55 ℃恒溫水浴鍋反應10 min，轉(zhuǎn)化完成后迅速將其沸水浴10 min。滅活后的反應液置于12 000 r/min下離心5 min，取適量上清液進行產(chǎn)物瓜氨酸的濃度測定。

酶活定義(1 U)：在反應測定條件下，以L-精氨酸作為底物，每分鐘水解催化精氨酸生成1 μmol瓜氨酸所需的酶量。

參照JIANG等[21]的檢測方法對產(chǎn)物瓜氨酸進行測定。

1.3.5 重組酶的熱穩(wěn)定性研究

將酶液分別在45、50、55 ℃ 3個溫度下恒溫水浴，每間隔30 min取出相應體積保溫后的酶液按1.3.4中的條件測定其殘余酶活力，將未經(jīng)保溫(0 h)的H-ADI重組酶的酶活力設定為100%。

1.3.6 重組酶的變性溫度測定

將酶液質(zhì)量濃度稀釋至1 mg/mL，在0.84×105Pa條件下對酶液和透析液脫氣處理10 min，加入樣品，注意不要引入氣泡，設定設備運行參數(shù)為在10～100 ℃掃描且以1 ℃/min的速率進行程序升溫，壓力為0.3 MPa。測定結(jié)果使用Nano-Analyze進行處理和分析，采用Two-State Scaled模型對其進行擬合后得到重組酶Tm值。

1.3.7 重組酶的結(jié)構(gòu)分析

同源建模后的三維結(jié)構(gòu)采用Pymol進行可視化，DNAMAN軟件用于核酸和蛋白序列比對。

1.3.8 重組酶的分子動力學模擬

在軟件Gromacs中能量最小化后，在328 K以15 ns的速率展開分子動力學模擬，并采用gmx rmsf程序計算模擬過程中原子偏離平衡位置的均漲落方根(root mean square fluctuation，RMSF)，進而了解突變氨基酸對蛋白結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的影響。

1.3.9 瓜氨酸的生產(chǎn)

以100 g/L的精氨酸為底物(pH 6.5)，加入5 g/L誘導后的濕菌體，在55 ℃下進行轉(zhuǎn)化生產(chǎn)，定時取樣測定產(chǎn)物瓜氨酸的含量。

1.3.10 數(shù)據(jù)處理分析

每個實驗均設置3個平行反應，所有測量數(shù)據(jù)使用Excel和Origin進行處理分析和圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變位點選擇及突變體構(gòu)建

選取已解析晶體結(jié)構(gòu)且氨基酸同源性最高(62.59%)的來源于Streptococcuspyogenes的ADI(PDB:4BOF)作為模板，得到了H-ADI的三維結(jié)構(gòu)，PROCHECK服務器檢測模型質(zhì)量，如圖1-a所示,拉氏構(gòu)象圖結(jié)果表明90.3%的氨基酸處于紅色的完全允許區(qū)，圖1-b Errat程序結(jié)果表明H-ADI三維結(jié)構(gòu)的總體質(zhì)量得分為92.327%，因此，該同源建模的結(jié)構(gòu)已經(jīng)比較接近其真實結(jié)構(gòu)。

a-拉氏構(gòu)象圖；b-Errat評價

HotSpot Wizard服務器能將輸入的序列與資源庫序列進行比對，由于酶在進化過程中也趨向于在同一位點保持相同的氨基酸，所以位于柔性區(qū)域或者最常出現(xiàn)在特定位置的非保守氨基酸可能會影響整個蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[20]。將獲得的三維結(jié)構(gòu)上傳到HotSpot Wizard在線服務器，識別與結(jié)構(gòu)靈活性、序列一致性或共進化相關(guān)的氨基酸殘基進行熱穩(wěn)定性突變熱點的預測；此外，將預測突變位點結(jié)合三維結(jié)構(gòu)過濾可能的有害位點。

以重組質(zhì)粒pET-28a(+)-H-ADI為模板，進行定點突變。將測序成功的突變體轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)，經(jīng)誘導表達和分離純化后，所有突變體酶均成功表達，在相同上樣量情況下條帶粗細無明顯差異，表明突變體的表達量基本一致；此外，條帶單一且與野生型一致，亞基大小在47 kDa。

2.2 突變體酶活力和變性溫度

測定突變酶的蛋白濃度后，添加與野生酶相同酶量進行酶活力測定；此外，將各個H-ADI的濃度稀釋到相同濃度進行差示掃描量熱分析(differential scanning calorimetry，DSC)測定進而確定其變性溫度，結(jié)果如表2所示。突變體E81D、F111L、N142L、T215Y以及Q255M相較野生型來說，酶活力都有小幅度提高，但是Tm值較野生酶分別下降了1.27、1.27、0.63、0.2、3.55 ℃；G65N、V187T和A231L的酶活力和變性溫度都沒有提高，只有T180Y和A190P的Tm值分別提高了2.5、1.96 ℃，其有序疊加組合突變體T180Y/A190P的Tm值提高了5.26 ℃，但三者的酶活力分別下降為野生酶的91.36%、80.53%和78.41%。

表2 H-ADI及其突變體的相對酶活和Tm值

2.3 正向突變體的熱穩(wěn)定性

對Tm值提高的2個單點及其組合突變進行最適溫度以及溫度穩(wěn)定性的測定，結(jié)果見圖2，單點突變體T180Y和A190P的最適溫度相比野生型沒有提高，而雙點組合突變體T180Y/A190P最適溫度提高了5 ℃，說明兩點疊加的效果存在加和效應。此外，在50 ℃條件下對這3個正向突變體的溫度穩(wěn)定性進行測定，相比于野生型在50 ℃保溫180 min后只有原始酶活力的25%，突變體在50 ℃保溫180 min后的殘余酶活力均有不同的提高，T180Y、A190P分別能保持55%、48%的相對酶活力，而雙點組合突變體能保持66.8%的酶活力，說明定點突變提升了H-ADI的熱穩(wěn)定性。

a-最適溫度；b-溫度穩(wěn)定性

2.4 精氨酸脫亞胺酶的分子動力學模擬

RMSF指的是原子在模擬體系中在平衡時間點偏離平均位置的幅度，代表原子自由運動的程度進而表征某個蛋白區(qū)域的柔性，RMSF數(shù)值越大代表該位置的氨基酸柔性越大，該區(qū)域的穩(wěn)定性越差[22]。借助同源建模獲得復合突變體T180Y/A190P的三維模擬結(jié)構(gòu)；將野生型H-ADI和突變體T180Y/A190P在328 K以15 ns的速率展開分子動力學模擬，整個軌跡的RMSF如圖3所示。野生型和突變型的大部分氨基酸RMSF值都小于0.4，但位于125～150位氨基酸的RMSF值都達到了0.8，說明該部分的氨基酸柔性較其他區(qū)域較大，而該區(qū)域正好是H-ADI三維結(jié)構(gòu)中的五螺旋束結(jié)構(gòu)域。不同來源的ADI在該螺旋束結(jié)構(gòu)域的序列和長度有很大變化，但該部分基本是由芳香族和疏水側(cè)鏈構(gòu)成的疏水核心，其作用還不清晰[23]。此外，野生型的RMSF值整體高于或接近于突變體，但也出現(xiàn)了突變體RMSF值高于野生型的區(qū)域和位點，而180位點和190位點剛好位于該區(qū)域；因此，表明這2個位點的突變導致蛋白在該區(qū)域的柔性降低、剛性增強從而使其具有更高的熱穩(wěn)定性。

圖3 野生型H-ADI和突變體的RMSF分析

2.5 突變位點分析

有研究為了探索影響蛋白熱穩(wěn)定性的因素，對大量同源的嗜熱和中溫蛋白的氨基酸類型進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)Arg、Glu和Tyr由于其結(jié)構(gòu)特征在嗜熱蛋白表面出現(xiàn)的頻率較高[24]。此外，大多數(shù)蛋白質(zhì)含有許多小的空腔，這些空腔可以由更大的殘基來填充進而增強蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[25]。對H-ADI而言，180位點位于其結(jié)構(gòu)表面(圖4)，實驗結(jié)果表明由Thr變化為Tyr增強了其的穩(wěn)定性，從該位點的三維表面結(jié)構(gòu)可以看出，Tyr的側(cè)鏈基團相較于Thr較大，填充了相鄰的一個表面空穴，因而可能加強了H-ADI的穩(wěn)定性。此外，芳香環(huán)作用也是蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的重要驅(qū)動力，主要包括芳香環(huán)和陽離子(帶正電的Lys、Arg和His)之間的作用(陽離子-π)或者芳香環(huán)之間的相互作用(π-π)，芳香環(huán)和陽離子間的相互作用是一種強的非共價鍵合力[26]，突變后的Tyr與空間位置與較近的Arg269可能存在陽離子-π的相互作用而提高了其熱穩(wěn)定性。但另一方面，180位點位于與底物進出相關(guān)的loop環(huán)上，突變?yōu)門yr后較大的側(cè)鏈集團以及與Arg269位點形成的非共價鍵合力降低了loop環(huán)的柔性進而降低了該酶的催化活力。

a-H-ADI 180位氨基酸突變前結(jié)構(gòu)；b-H-ADI 180位氨基酸突變后結(jié)構(gòu)；c-H-ADI 180位突變后氨基酸與相鄰269位氨基酸的芳香環(huán)作用

環(huán)狀亞氨基酸是Pro特有的結(jié)構(gòu)，其具有的吡咯環(huán)結(jié)構(gòu)使其具有較好的剛性結(jié)構(gòu)；根據(jù)結(jié)構(gòu)和統(tǒng)計分析，在β轉(zhuǎn)角的第2個位置和α-螺旋N1的Pro偏好位置進行Pro取代能增強酶的穩(wěn)定性[27]。此外，還有研究表明因為Pro在氨基基團少1個H原子，且不能形成α螺旋所需的φ角，所以α螺旋中基本不出現(xiàn)Pro[28]。在H-ADI的190位點，Ala突變?yōu)镻ro提高了該H-ADI熱穩(wěn)定性，值得注意的是該位點位于α螺旋的中間位置(圖5-a)。在另一個研究中，來自penicilliumverruculosum的內(nèi)切葡聚糖酶的脯氨酸理性設計突變中，最穩(wěn)定的突變體S308P在70 ℃下的半衰期相較野生酶提高了4倍，并且該位點也位于α螺旋的中間結(jié)構(gòu)[29]。借助DynaMut服務器[30]評估該突變位點對H-ADI的穩(wěn)定性影響，結(jié)構(gòu)表明從Ala突變?yōu)镻ro后，增加了與相鄰氨基酸殘基之間的疏水相互作用和極性相互作用(圖5-b)；此外，該突變體的折疊自由能(ΔΔG)為5.19 kJ/mol，證明該突變有利于增強H-ADI的穩(wěn)定性。

a-H-ADI 190位氨基酸突變后的結(jié)構(gòu)分析；b-與相鄰氨基酸的相互作用

2.6 瓜氨酸的生產(chǎn)

誘導后的濕菌體按照5 g/L加入100 g/L的精氨酸反應體系中，55 ℃下進行轉(zhuǎn)化生產(chǎn)，結(jié)果如圖6所示。

圖6 野生型和突變型生產(chǎn)瓜氨酸

突變體和野生型均在轉(zhuǎn)化開始的2 h內(nèi)快速生成產(chǎn)物瓜氨酸，隨著反應時間的延長，轉(zhuǎn)化過程趨于平緩。單點突變體T180Y與野生型的瓜氨酸轉(zhuǎn)化過程相似，但T180Y的產(chǎn)量比野生型高了2 g/L，而A190P突變體的轉(zhuǎn)化速率和產(chǎn)物生成量均低于野生型，可能是因為A190P的比酶活力只有野生型的80.53%，而變性溫度只提高了1.96 ℃，在實際生產(chǎn)過程中影響不大。通過有序疊加獲得的雙點突變體T180Y/A190P在前1 h的轉(zhuǎn)化速率比野生型高12.5%，并且瓜氨酸最終產(chǎn)量也比野生型高5 g/L。SONG等[14]將來源于L.lactis的ADI異源表達于大腸桿菌工程菌，通過易錯PCR得到了酶活提高的突變體FMME106，在50 ℃的條件下進行轉(zhuǎn)化生產(chǎn)，F(xiàn)MME106相較于野生型提高了14.2%的產(chǎn)量，且最初的反應速率也提高了21.4%；另一方面，F(xiàn)MME106在8 h轉(zhuǎn)化后瓜氨酸產(chǎn)量達到了45 g/L，而H-ADI以及突變體在55 ℃進行8 h轉(zhuǎn)化后，瓜氨酸的產(chǎn)量達到了50～60 g/L?？偟膩碚f，在工業(yè)生產(chǎn)過程中，由于酶會處于一定的溫度進行長時間的生產(chǎn)，所以較好的熱穩(wěn)定性能保持較高的酶活力持續(xù)進行轉(zhuǎn)化，使得產(chǎn)物的產(chǎn)量提高；因此，熱穩(wěn)定性改造對于工業(yè)酶具有重要意義。

3 結(jié)論

通過理性設計獲得了來源于奧氏嗜熱鹽絲菌的3個熱穩(wěn)定性提高的突變體T180Y、A190P和T180Y/A190P，其酶活力為野生型的91.36%、80.53%和78.41%，變性溫度(Tm)較野生酶分別提高了2.5、1.96、5.26 ℃，T180Y和A190P的最適溫度與野生酶相同，而T180Y/A190P的最適溫度提高了5 ℃。在50 ℃下保溫180 min后，T180Y、A190P和T180Y/A190P殘余酶活力分別提高了30%、23%和41.8%。三維結(jié)構(gòu)分析表明表面空穴填充和芳香環(huán)作用是T180Y熱穩(wěn)定性增強的可能原因，而A190P則可能是由于脯氨酸的吡咯環(huán)剛性結(jié)構(gòu)以及空間相鄰殘基之間的疏水作用增強了其熱穩(wěn)定性。將獲得的突變體應用于瓜氨酸生產(chǎn)，T180Y/A190P的瓜氨酸產(chǎn)量和生產(chǎn)速率均優(yōu)于野生型。該研究為其他微生物來源的工業(yè)酶以及酶的理性改造提供了思路和參考。