基于分子生物學(xué)原理技術(shù)檢測(cè)肉制品中動(dòng)物源性成分研究進(jìn)展

易艷，劉明東，蔣子敬，姜展樾,，馬麗俠，葉德萍，韓國(guó)全*，周李華*

1(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，四川 雅安，625000)2(中國(guó)測(cè)試技術(shù)研究院，四川 成都，610000)

肉中富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、脂肪和維生素(維生素B6、維生素B12和維生素D)等，此外，它含有維持基本生命活動(dòng)所需的必需氨基酸。近年來，肉及肉制品摻偽摻假事件頻繁發(fā)生，已對(duì)消費(fèi)者的權(quán)益造成傷害，擾亂社會(huì)秩序，侵犯宗教信仰。隨著部分商販及企業(yè)摻假手段不斷提高，使得肉制品的多樣性和復(fù)雜性日益增加，傳統(tǒng)鑒別技術(shù)已不能適應(yīng)市場(chǎng)監(jiān)管要求，快速、高通量、準(zhǔn)確的動(dòng)物源性成分檢測(cè)方法，不僅能為政府部門監(jiān)管工作提供技術(shù)支持，也為消費(fèi)者權(quán)益提供技術(shù)保障。目前國(guó)內(nèi)外已研發(fā)多種鑒別肉類摻假的檢測(cè)方法，如基于形態(tài)學(xué)特征的感官鑒定技術(shù)、以光譜學(xué)為基礎(chǔ)的化學(xué)鑒別法、以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的免疫學(xué)方法及色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。

DNA是生物體組織和細(xì)胞內(nèi)基因儲(chǔ)存、復(fù)制和傳遞的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，與蛋白質(zhì)相比，其穩(wěn)定性和種間多態(tài)性更強(qiáng)，利于物種鑒別。因此，以核酸分子為基礎(chǔ)的生物學(xué)技術(shù)在物種識(shí)別中具有重要意義，已成為肉類種屬鑒別最常用的方法，如普通PCR、數(shù)字PCR、多重PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性PCR，除此之外，研究人員還開發(fā)出環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增、DNA條形碼、高通量測(cè)序(next-generation sequencing, NGS)等快速、高通量的檢測(cè)方法。目前，主要選擇線粒體DNA和核基因組作為肉制品源性成分的鑒定基因，線粒體DNA是一種雙鏈核外遺傳物質(zhì)，具有分子質(zhì)量小、分子進(jìn)化速度快、物種間差異大，種間穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于物種鑒定領(lǐng)域[1]，常用的目標(biāo)基因有cytb、ATP6、12S rRNA、D-loop區(qū)、16S rRNA 和ATP8[2]等。

1 PCR技術(shù)

PCR檢測(cè)技術(shù)是目前國(guó)內(nèi)肉類成分鑒定的標(biāo)準(zhǔn)方法，我國(guó)已陸續(xù)頒布一些國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和地方標(biāo)準(zhǔn)，以熒光PCR技術(shù)為主，可用于絕大多數(shù)動(dòng)物源性成分的鑒定，也能滿足食品安全監(jiān)管部門對(duì)檢測(cè)技術(shù)簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、高效的基本需求。

1.1 普通PCR定性檢測(cè)技術(shù)

PCR是一種在生物體外進(jìn)行的特殊DNA復(fù)制，其最顯著的特征是能大量增加DNA的數(shù)量，并能根據(jù)不同物種的特定基因比對(duì)分析，設(shè)計(jì)適合的特異性引物，實(shí)現(xiàn)對(duì)物種種源的鑒別[3]。普通PCR是用一對(duì)特異性引物對(duì)目的片段擴(kuò)增，是一種常規(guī)的肉制品鑒別技術(shù)。CALVO等[4]篩選豬的特異性引物，從香腸、餡餅、生熟肉、煙熏肉等豬肉制品中成功檢測(cè)出了豬肉。普通PCR方法的應(yīng)用為物種鑒別開辟了PCR技術(shù)的新時(shí)代，但普通PCR技術(shù)一次只能檢出一個(gè)物種，不能滿足高通量的檢測(cè)需求。

多重PCR技術(shù)(multiplex PCR)又稱復(fù)合PCR技術(shù)，是一種基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的新PCR技術(shù)，加入的兩對(duì)或以上引物在同一反應(yīng)體系中擴(kuò)增不同模板，獲得不同的目標(biāo)片段。如表1列舉多重PCR技術(shù)用于牛、羊、雞、鴨等成分的檢測(cè)，檢出限達(dá)0.01 ng/μL，最高可同時(shí)檢測(cè)6種動(dòng)物源性成分，多重PCR法不僅特異性強(qiáng)、靈敏度高，同時(shí)又減少試劑用量，提高檢測(cè)效率，節(jié)約檢測(cè)費(fèi)用，被廣泛用于動(dòng)物源性成分的檢測(cè)，但該技術(shù)引物設(shè)計(jì)是關(guān)鍵，數(shù)量過多可能引起交叉反應(yīng)。

表1 多重PCR檢測(cè)技術(shù)

1.2 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性PCR技術(shù)

限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性PCR(PCR-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)將RFLP與PCR兩項(xiàng)技術(shù)相結(jié)合，經(jīng)同一限制性內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，獲得不同長(zhǎng)度的酶切片段，用瓊脂糖凝膠電泳法或毛細(xì)管電泳法分析酶切片段，從而鑒別樣品中的動(dòng)物源性成分。已有大量研究將該技術(shù)應(yīng)用于肉制品的鑒別中，如ISLAM等[11]基于PCR-RFLP法，采用4種限制性內(nèi)切酶分別對(duì)64個(gè)肉類樣品的12S rRNA基因進(jìn)行分析，結(jié)果表明，所有酶剪切位點(diǎn)在這些樣品中均是保守的，該技術(shù)可用于肉類的檢測(cè)與鑒別。同時(shí)UDDIN等[12]建立了牛、水牛、雞、鴨、山羊、綿羊和豬的七重PCR-RFLP檢測(cè)方法，PCR產(chǎn)物經(jīng)FatⅠ、BfaⅠ、HPY188I酶切鑒定，得到混合肉類的檢出限為0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，該方法的靈敏度高，穩(wěn)定性好，利于生鮮肉及加工肉制品中目標(biāo)物種的鑒別。RFLP方法雖然有很好的檢測(cè)效果，但由于內(nèi)切酶位點(diǎn)隨機(jī)變異，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性較差，因此設(shè)計(jì)合適的酶切位點(diǎn)至關(guān)重要。

1.3 實(shí)時(shí)熒光PCR相對(duì)定量技術(shù)

實(shí)時(shí)熒光PCR是一種以PCR為基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù)，指將熒光基團(tuán)加入反應(yīng)體系中，通過連續(xù)監(jiān)測(cè)PCR擴(kuò)增過程中熒光信號(hào)的強(qiáng)度來實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)特定產(chǎn)物的量，并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)其進(jìn)行定量檢測(cè)的過程，可分為熒光探針法和熒光染料法，如圖1所示，此技術(shù)已廣泛應(yīng)用于肉類摻假鑒定[14-15]。基于實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)的定量分析策略主要通過構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒、引入校正系數(shù)等方案實(shí)現(xiàn)動(dòng)物源成分的準(zhǔn)確定量。徐瓊等[16]基于TaqMan實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，將朊蛋白基因(PRNP)作為豬特異性基因，使用ΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量，豬源性的檢出限為0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，所配制的豬肉含量為31%、52%、59%和79%的仿冒羊肉樣品，其檢測(cè)值與真值差異較小，表明此法能夠精準(zhǔn)、穩(wěn)定地檢測(cè)出在羊肉中所摻的豬肉含量。ZHU等[17]建立了常規(guī)多重PCR和標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)時(shí)PCR同時(shí)檢測(cè)5種常見肉類及定量檢測(cè)食品中驢肉含量的方法，能快速準(zhǔn)確區(qū)分驢、羊、牛、豬和馬5種常見的摻假品種。IWOBI等[18]利用肌生長(zhǎng)抑制素的通用序列和雙重量化性質(zhì)，建立一種定量檢測(cè)肉糜中牛肉和豬肉組分的三重實(shí)時(shí)熒光PCR方法，其檢測(cè)限為20個(gè)基因組當(dāng)量，能為肉糜的量化提供可靠依據(jù)。與數(shù)字PCR相比，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)具有成本低、儀器平臺(tái)廣泛等優(yōu)勢(shì)，但也存在一些不足之處，定量過程需要構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，但無法獲得定量準(zhǔn)確的標(biāo)準(zhǔn)品。其次，以Ct值作為中間系數(shù)，無法準(zhǔn)確計(jì)算用于定量的靶基因拷貝數(shù)與樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系，因此一定程度阻礙了該方法在肉類定量檢測(cè)中的應(yīng)用[19]。

圖1 實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)原理圖[13]

1.4 數(shù)字PCR絕對(duì)定量技術(shù)

微滴數(shù)字PCR技術(shù)(droplet digital PCR, ddPCR)是一種核酸定量檢測(cè)方法，通過微滴生成儀把反應(yīng)體系分散到不同的反應(yīng)單元中，獨(dú)立進(jìn)行PCR，并依據(jù)陽性比例和泊松分布計(jì)算出DNA起始濃度，能實(shí)現(xiàn)核酸的絕對(duì)定量[20]，如圖2所示。肉制品定量檢測(cè)的關(guān)鍵是實(shí)現(xiàn)DNA拷貝數(shù)與樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)的轉(zhuǎn)換，吳海晶等[21]基于微滴式數(shù)字PCR建立羊肉中鴨肉組分與拷貝數(shù)之間的線性關(guān)系，通過測(cè)定混合樣品中羊肉與鴨肉的DNA拷貝數(shù)，利用結(jié)合建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出羊肉與鴨肉的質(zhì)量比，結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確度高，經(jīng)多重驗(yàn)證，與標(biāo)準(zhǔn)樣品的絕對(duì)誤差為0.35%；REN等[22]采用微滴數(shù)字PCR定量測(cè)定綿羊和山羊肉產(chǎn)品中雞肉的含量，并在檢驗(yàn)過程中引入校正系數(shù)k，將動(dòng)物源成分質(zhì)量比例轉(zhuǎn)換為拷貝數(shù)的比例，研究結(jié)果表明，原料肉的不同部位對(duì)所建立方法的定量準(zhǔn)確性無影響，且檢測(cè)經(jīng)高溫高壓處理的樣品時(shí)，該方法表現(xiàn)出良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。與傳統(tǒng)PCR、熒光定量PCR相比，數(shù)字PCR技術(shù)準(zhǔn)確度和靈敏度更高，不依賴擴(kuò)增閾值(Ct值)，無需考慮不同樣品的引物擴(kuò)增效率差異造成定量檢測(cè)不準(zhǔn)確，人為操作因素少，對(duì)模板濃度進(jìn)行精準(zhǔn)定量，但實(shí)際檢測(cè)時(shí)，不同來源的肉制品中核基因組DNA或線粒體DNA拷貝數(shù)及豐度存在差異，線粒體DNA豐度高且拷貝數(shù)大，易造成定量不準(zhǔn)確，而核基因組DNA拷貝數(shù)恒定，不易受到不同組織細(xì)胞的影響，更適用于動(dòng)物源成分的定量檢測(cè)。

圖2 微滴數(shù)字PCR技術(shù)原理圖

2 快速檢測(cè)技術(shù)

隨著全球?qū)θ忸愯b別技術(shù)越來越高的要求，開發(fā)準(zhǔn)確高效的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)技術(shù)是監(jiān)管部門執(zhí)法的關(guān)鍵，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種新型核酸體外擴(kuò)增技術(shù)，基本原理是DNA在4條特異性引物(內(nèi)外引物各2條)及鏈置換DNA聚合酶作用下可不斷合成鏈置換DNA，具有可以在恒定溫度下(65 ℃左右)快速高效地?cái)U(kuò)增目的片段的優(yōu)勢(shì)，由于該方法無DNA變性步驟，因此擺脫了復(fù)雜的溫度控制裝備及精密儀器的限制，能滿足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)及執(zhí)法的需求，耗時(shí)較少，結(jié)果肉眼可判別，應(yīng)用于肉類快速檢測(cè)具有較好的前景。CAI等[23]研發(fā)了一種基于實(shí)時(shí)LAMP的測(cè)定法，此方法可在20 min內(nèi)檢測(cè)出肉制品中豬源成分，檢測(cè)限達(dá)1.76 pg/μL，比PCR靈敏度高1 000倍，這是首次應(yīng)用LAMP法檢測(cè)商業(yè)產(chǎn)品中的豬源成分，其實(shí)際應(yīng)用將有助于打擊食品工業(yè)的摻假行為；ZAHRADNIK等[24]采用LAMP法檢測(cè)加工食品中馬肉含量，以馬的線粒體基因組設(shè)計(jì)了特定擴(kuò)增引物，引物特異性好，未觀察到牛肉、豬肉和雞肉的交叉反應(yīng)，方法靈敏度高，能從制備的模型香腸中檢測(cè)到0.1%的馬肉。于媛媛等[25]以豬、雞、鴨線粒體DNA為靶基因設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)3種源性成分的模擬深加工樣品檢測(cè)分析，分析時(shí)間為36 min，可實(shí)現(xiàn)生鮮肉、加工肉制品肉源成分的快速篩查。目前國(guó)內(nèi)外已有大量研究者將LAMP應(yīng)用于肉類成分鑒別中。

3 新型分子檢測(cè)技術(shù)

目前，我國(guó)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)涉及的方法主要是針對(duì)已知目標(biāo)物種，而在實(shí)際檢測(cè)中，對(duì)于更多未知成分的篩查，傳統(tǒng)方法不適用，為滿足這一需求，有研究者開發(fā)了非目標(biāo)成分檢測(cè)的DNA測(cè)序技術(shù)，該技術(shù)可以通過一次測(cè)序得到混合樣品尤其是未知樣品中的全部目標(biāo)片段序列，隨后與基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，從而確定物種種類?，F(xiàn)存在許多包含核酸序列信息的動(dòng)物DNA數(shù)據(jù)庫，有學(xué)者實(shí)驗(yàn)室建立了包含2 700多個(gè)種的動(dòng)物數(shù)據(jù)庫[26]，即使沒有參考樣本或參考基因序列，通過數(shù)據(jù)庫序列信息比對(duì)也能確定動(dòng)物源性。該技術(shù)準(zhǔn)確、快速、通量高，在肉類摻假檢測(cè)中具有較好的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

3.1 DNA條形碼技術(shù)

DNA條形碼(DNA barcode)技術(shù)是由HEBERT等[27]提出并在物種鑒別中開始應(yīng)用的，其工作原理是使用標(biāo)準(zhǔn)的或已知的基因組DNA基因片段作為分子靶標(biāo)，在種級(jí)水平進(jìn)行物種鑒定，與超市里識(shí)別商品的條形碼相似，DNA barcode主要編碼線粒體COI基因，線粒體COI基因已被證明可作為動(dòng)物公認(rèn)條形碼[28]，DNA條形碼技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)多種未知摻雜成分的快速、高通量的檢測(cè)，真正突破了常規(guī)分子方法定向測(cè)定的局限，它有不可替代的優(yōu)越性，是一個(gè)通用、非定向靶標(biāo)的檢測(cè)方法。而國(guó)內(nèi)關(guān)于牛、羊、豬、鴨等肉類DNA條形碼的研究仍處于初級(jí)階段[29]。AHMED等[30]以印度不同烹飪方式加工的肉制品為研究對(duì)象，測(cè)試DNA條形碼的適用性，研究顯示，經(jīng)烹飪加工的肉制品雖經(jīng)復(fù)雜處理及含有大量香料，但對(duì)應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)進(jìn)行物種鑒定無影響，表明其可作為一種可靠的動(dòng)物源性追溯方法；田晨曦等[31]采用COI-2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增及序列比對(duì)，建立以COI基因?yàn)榛A(chǔ)的肉制品摻假鑒別方法，對(duì)牛-豬、羊-豬、牛-鴨和羊-鴨模型摻假物的檢出限分別為5%、8%、1%和4%，方法簡(jiǎn)便快速有效；勵(lì)炯等[32]基于COI序列建立并優(yōu)化可鑒別11種生鮮肉的DNA條形碼技術(shù)，研究以低價(jià)值肉(雞、鴨、馬等)摻入高價(jià)值肉類中(牛、羊、兔等)制備18種摻假模型，結(jié)果顯示，在18種摻假模型中，牛羊肉與低價(jià)值肉摻混的最低檢出率為5%，該方法靈敏度高，可作為高低價(jià)值肉類摻雜的有效鑒別方法。目前國(guó)際上對(duì)于DNA條形碼技術(shù)在鑒定雜交物種種屬信息方面存在爭(zhēng)議，但可通過聯(lián)合其他分子檢測(cè)方法來解決，例如，在某種程度上，采用復(fù)合條形碼技術(shù)、微型條形碼技術(shù)解決了含有多個(gè)未知物種的混合樣品的鑒定問題[33]。

3.2 高通量測(cè)序技術(shù)

21世紀(jì)NGS的出現(xiàn)使動(dòng)物源性成分檢測(cè)取得了新突破。NGS可分為靶向測(cè)序、全基因組測(cè)序和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，NGS可以通過聚合酶或連接酶直接體外合成和測(cè)序同時(shí)進(jìn)行，具有高通量、快速、可定量、低成本和高分辨率等優(yōu)點(diǎn)。一次高通量測(cè)序可以讀取400 000～4 000 000條序列，不同的測(cè)序平臺(tái)可讀取到的堿基數(shù)不等[34]，目前NGS的主要代表平臺(tái)有Illumina公司的Solexa基因組分析儀和ABI的SOLiD測(cè)序儀，不同平臺(tái)的核心技術(shù)有所區(qū)別,圖3為BGISEQ原理圖。Solexa聚合酶合成測(cè)序的關(guān)鍵技術(shù)是：“DNA簇”和“可逆性末端終結(jié)”[36]；SOLiD連接酶測(cè)序取代了傳統(tǒng)PCR，可對(duì)單拷貝DNA片段進(jìn)行大規(guī)模擴(kuò)增和高通量測(cè)序[37]。

圖3 高通量測(cè)序技術(shù)原理圖[35]

該項(xiàng)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于環(huán)境中微生物多樣性分析[38]、病毒鑒別[39]、臨床診斷[40]等。蔡一村等[41]利用二代測(cè)序和DNA條形碼技術(shù)對(duì)哺乳動(dòng)物、禽類及其他肉類混合樣品進(jìn)行鑒定，通過擴(kuò)增線粒體基因16S rRNA區(qū)，使用Illumina Miseq二代測(cè)序技術(shù)獲取所有序列信息，并與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，混合樣品中鵝、鴨成分被正確識(shí)別，且檢測(cè)下限為0.5 ng/μL，該方法準(zhǔn)確度高，用途廣泛，實(shí)現(xiàn)了混合DNA片段序列的高通量測(cè)定；PAN等[42]提出一種能準(zhǔn)確識(shí)別加工肉制品中豬、牛、家禽等物種的NGS結(jié)合DNA微條形碼的方法，基于51種動(dòng)物的140條序列設(shè)計(jì)引物，鑒定包含12個(gè)物種的鮮肉混合物，經(jīng)測(cè)序、序列比對(duì)分析顯示，12個(gè)物種序列與目標(biāo)序列完全一致，說明此方法檢測(cè)效率較高。ZHANG等[43]采用NGS結(jié)合包含動(dòng)物2 354個(gè)完整的線粒體基因組序列數(shù)據(jù)庫，對(duì)不同含量的豬、牛、羊、雞、兔和小鼠成分的模擬樣品鑒定研究，結(jié)果表明該方法能夠檢測(cè)肉類中1%的動(dòng)物源成分，方法的準(zhǔn)確率達(dá)97.65%，對(duì)肉制品中混合動(dòng)物源性成分或未知成分的識(shí)別具有良好的應(yīng)用前景。NGS具有快捷、成本低、通量高等特點(diǎn)，能一次實(shí)現(xiàn)多種動(dòng)物源成分的檢測(cè)，將為食品安全執(zhí)法監(jiān)管、摻雜摻假、清真食品的檢測(cè)提供新思路。

4 總結(jié)與展望

近年來，屢次出現(xiàn)的肉制品摻假事件存在較大的食品安全風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重影響消費(fèi)者，破壞社會(huì)經(jīng)濟(jì)秩序，研究快速、準(zhǔn)確、高效的動(dòng)物源性成分檢測(cè)方法，對(duì)保障國(guó)家食品安全、社會(huì)穩(wěn)定、人民健康至關(guān)重要。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者開展的基于分子生物學(xué)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于肉制品的檢測(cè)，不同技術(shù)各有優(yōu)缺點(diǎn)，詳見表2，實(shí)驗(yàn)人員可根據(jù)具體條件選擇適當(dāng)?shù)牡姆椒?。未來，在現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)基礎(chǔ)上，開發(fā)低成本的快檢試劑盒、豐富動(dòng)物基因組序列數(shù)據(jù)庫、細(xì)化雜交物種的DNA條形碼、優(yōu)化數(shù)據(jù)分析方法、采用多核苷酸多態(tài)性標(biāo)記等是研究的趨勢(shì)，同時(shí)，NGS一次可檢測(cè)幾百份樣品，具有通量高、快速、準(zhǔn)確性好等優(yōu)勢(shì)，為動(dòng)物源性成分鑒定的發(fā)展提供了新方向，必將在大批量、未知摻假成分的肉制品檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。

表2 檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用場(chǎng)景及特點(diǎn)比較