八月瓜籽油納米乳液制備及其穩(wěn)定性評價

朱仁威，武奕彤，胡深德，沈俊利，陸俊*

1(銅仁學院 材料與化學工程學院，貴州 銅仁，554300)2(中南林業(yè)科技大學 食品科學與工程學院，湖南 長沙，410003)

八月瓜(Akebiatrifoliata)是木通科木通屬半落葉木質藤本植物三葉木通的果實[1]，我國的八月瓜資源豐富，廣泛分布在陜西、河北、湖南、四川、云南等省份以及長江流域[2]。八月瓜果實中的維生素C、糖、蛋白質含量均高于大眾平時攝取的普通水果，且氨基酸種類較多，富含多種必需氨基酸和為果肉呈現(xiàn)香味的鮮味氨基酸，所占鮮果含量分別為298.4、274.1 mg/100g[3]。八月瓜果皮也具有豐富的營養(yǎng)物質，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，其礦物質元素含量普遍高于梨、蘋果等[4]。研究表明八月瓜籽油中含有30.10%脂肪油，其中多數(shù)為不飽和脂肪酸，以單不飽和脂肪酸、油酸和多不飽和脂肪酸亞油酸為主，含量分別占47.63%和27.05%[5]，谷氨酸與天冬氨酸含量分別為7.783 4%和4.621 9%[6]，并且八月瓜籽油中氨基酸成分含量與聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織/聯(lián)合國世界衛(wèi)生組織推薦的成人氨基酸模式相似，具有將其作為保健油開發(fā)成品的巨大潛力。

納米乳液是將水、油、表面活性劑與助表面活性劑按一定比例混合，通過一系列手段制成的粒徑在50～200 nm的乳液體系，納米乳液的水相主要由乳化劑和助乳化劑組成[7]，油相常采用具有特殊活性的油或是溶解了親脂性活性物質的油溶液。納米乳分為3種類型，分別為水包油型 (oil in water，O/W)、油包水型 (water in oil，W/O)以及雙連續(xù)型。納米乳液的制備方法一般分為高能乳化法與低能乳化法。常用的高能乳化法有高壓均質、超聲波乳化、高壓微射流化法[8]與膜乳化法[9]；低能乳化法與界面動力學聯(lián)系緊密，在實際中多用來制備O/W型乳液。主要分為自發(fā)乳化法、溶劑蒸發(fā)法[10]、水凝膠法、反相法[11]等。本研究對八月瓜籽油納米乳液的制備工藝進行探究，為八月瓜籽油產(chǎn)品開發(fā)提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

八月瓜籽油，購于湖南省古丈縣；吐溫-80(食品級)，廣東潤華化工有限公司；丙二醇，天津市科密歐化學試劑有限公司；乙醇，湖南匯虹試劑有限公司；亞甲基藍，天津市北辰方正試劑廠；蘇丹紅Ⅲ，上海麥克林生化科技有限公司；ABTS，合肥博美生物有限公司；過硫酸鉀，國藥集團化學試劑有限公司；試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

HJS-3A恒溫磁力攪拌水浴鍋，常州澳華儀器有限公司；722 N紫外可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；JE602電子天平，上海浦春計量儀器有限公司；DHG-9140A電熱鼓風干燥箱(電熱鼓風干燥箱)；D-6L高壓均質機，美國PhD科技有限公司；Zetasizer Nano ZS納米粒度與電位分析儀，英國馬爾文儀器有限公司；ZOOMAC-L超純水儀，湖南中沃水務環(huán)?？萍加邢薰?；5810R高速離心機，德國艾本德股份公司；FA25D高剪切乳化機，上海弗魯克公司；SpectraMax iD3多功能酶標儀，美國分子儀器公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 八月瓜籽油納米乳液配方和工藝優(yōu)化

以吐溫-80為乳化劑，以溶解度大且無毒的無水乙醇、丙二醇為助乳化劑。分別向2個燒杯中加入4 g八月瓜籽油、0.8 g吐溫-80與0.4 g助乳化劑，在37 ℃水浴條件下，以450 r/min的轉速下均勻攪拌15 min，加入34.8 g超純水后繼續(xù)攪拌30 min形成粗乳液。將得到的粗乳液利用高速剪切機以10 000 r/min的速度剪切2 min，在25 ℃、100 MPa的條件下均質5次，得到粒徑較為均一的八月瓜籽油納米乳液，用超純水稀釋200倍后以納米粒度和Zeta電位與粒徑分布和多分散系數(shù)(polydispersity index，PDI)指數(shù)為參考指標來確定最佳助乳化劑。

確定最佳助乳化劑后，以納米粒度和Zeta電位與粒徑分布和PDI指數(shù)為指標，考察均質壓力、均質次數(shù)、八月瓜籽油質量分數(shù)、乳化劑與助乳化劑比例、復合乳化劑質量分數(shù)對八月瓜籽油納米乳液的影響，方案為：均質壓力為70、100、130 MPa，均質次數(shù)為1、3、5、7、9，八月瓜籽油質量分數(shù)為6%、8%、10%、12%、14%，乳化劑與助乳化劑質量比為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3，復合乳化劑質量分數(shù)為1%、2%、3%、4%、5%，以制備得到的八月瓜籽油納米乳液用超純水稀釋200倍后的納米粒度和Zeta電位與PDI指數(shù)為指標，確定八月瓜籽油納米乳液的最佳配方和工藝。

1.3.2 八月瓜籽油納米乳液質量評價

1.3.2.1 基本評價

將制得的八月瓜籽油納米乳液稀釋200、1 000倍，觀察是否有淡藍色乳光，采用平行光照射后是否產(chǎn)生丁達爾效應，出現(xiàn)一條光亮的通路。將油溶性蘇丹紅Ⅲ染液與水溶性亞甲基藍染液分別同時加入制得的八月瓜籽油納米乳液中，觀察2種顏色染料擴散速度的快慢，若亞甲基藍擴散速度快于蘇丹紅Ⅲ，則證明乳液為O/W型，若蘇丹紅Ⅲ擴散速度快于亞甲基藍，則證明乳液為W/O型，若兩者擴散速度一樣，則為雙連續(xù)型[12]。

1.3.2.2 粒徑與Zeta電位測定

將八月瓜籽油納米乳液用超純水稀釋200倍，避免高濃度乳液引起多重散射現(xiàn)象，用Zetasizer Nano-ZS90納米粒度和Zeta電位分析儀測定乳液微粒粒徑、Zeta電位、PDI指數(shù)和粒度分布，重復測定3次。

1.3.3 八月瓜籽油納米乳液穩(wěn)定性評價

1.3.3.1 貯藏期穩(wěn)定性

在QIN等[13]方法的基礎上稍微修改，將八月瓜籽油納米乳液分別放置在4、25、60 ℃條件下貯藏，分別于5、10、15、20、25 d測定粒徑與PDI，測定方法同1.3.2.2。

1.3.3.2 稀釋穩(wěn)定性

將八月瓜籽油納米乳液用超純水稀釋到50、200、1 000倍，觀察是否分層，若未分層，則證明八月瓜籽油納米乳液具有良好的稀釋穩(wěn)定性[14]。

1.3.3.3 離心穩(wěn)定性

在XU等[15]方法的基礎上稍微修改，將八月瓜籽油納米乳液用超純水稀釋200倍，測定其下層液體在500 nm處的吸光度，在2 000×g下離心20 min，吸取離心后下層液體測定其在500 nm處吸光度，重復3次。按照公式(1)計算表征離心穩(wěn)定性的Ke值。Ke值越小，證明分散的油滴在離心力的作用下上浮或下沉的越少，可判斷納米乳液的物理穩(wěn)定性。

(1)

1.3.3.4 吸光比測定

在KAUFMAN等[16]方法的基礎上稍微修改，室溫下將八月瓜籽油納米乳液用超純水稀釋1 000倍，分別測定其在80、400 nm處的吸光度，用公式(2)計算出的吸光比(specific absorptivity，SRI)判定乳液的穩(wěn)定性，當吸光比<0.3時納米乳液較穩(wěn)定。

(2)

1.3.4 八月瓜籽油納米乳液對ABTS陽離子自由基的清除能力

參考RE等[17]方法并稍作修改，采用ABTS法對八月瓜籽油、制得的納米乳液以及不同溫度下貯藏25 d的納米乳液進行測定，準確配制7 mmol/L ABTS水溶液與4.9 mmol/L過硫酸鉀水溶液，按體積比為1∶1混合均勻。將混合液置于室溫黑暗條件下反應12～16 h，得到ABTS原液。在測定開始前將ABTS原液用無水乙醇稀釋至溶液在734 nm處吸光度為0.7。準確稱取1 g八月瓜籽油于離心管中，再加入9 g無水乙醇，使用漩渦混合器將其混合均勻，靜置30 min后進行測定。將10 μL樣品溶液加入96孔板中，再加入190 μL稀釋后的ABTS溶液，室溫反應30 min后使用酶標儀在734 nm處測定其吸光度，以無水乙醇為空白對照，ABTS陽離子自由基清除能力用每克干樣品中Trolox當量表示，單位為μmol Trolox/g。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實驗重復3次，結果為3次的平均值，采用Origin實驗圖形的繪制，利用SPSS 20軟件進行統(tǒng)計分析。P<0.05則認為有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 八月瓜籽油納米乳液配方和工藝優(yōu)化

2.1.1 助乳化劑的確定

助乳化劑是一種兩親分子，由于極性頭較小，不能穩(wěn)定乳液本身，但是它可以與乳化劑產(chǎn)生協(xié)同作用，有助于納米乳液的形成，還能夠進一步降低界面張力，同時增加了系統(tǒng)的熵。助乳化劑插入乳化劑分子之間，削弱了極性頭和非極性尾部的相互作用，生成了一種更靈活的界面膜，能夠在液滴周圍輕易地變形，醇類在兩相之間作用，改善了油相和水相的溶解度[18]。由圖1分析發(fā)現(xiàn)，當丙二醇作為乳化劑時，乳液微粒粒徑與PDI指數(shù)更小。丙二醇作為良好的溶劑，可以影響表面活性劑的親水親油平衡值，提高納米乳液體系的穩(wěn)定性，并且八月瓜籽油在丙二醇中有良好的的溶解性。因此，在后續(xù)實驗中選擇丙二醇作為助乳化劑進行下一步實驗。

a-粒徑；b-PDI

2.1.2 均質次數(shù)對粒徑與PDI的影響

圖2為均質次數(shù)對八月瓜籽油納米乳液粒徑與PDI的影響，隨著均質次數(shù)增加到5次后，大部分乳液粒徑在140～150 nm，并且PDI也隨著均質次數(shù)的增加而降低，乳液粒徑減小且趨于穩(wěn)定[19]。均質次數(shù)過多會造成工藝繁復，多次均質產(chǎn)生的機械熱可能會使乳液溫度升高，破壞納米乳液體系，降低穩(wěn)定性。綜合考慮，均質次數(shù)選擇5次。

a-粒徑、PDI；b-粒徑分布

2.1.3 均質壓力對八月瓜籽油納米乳液粒徑、PDI與Zeta電位的影響

由圖3可知，在100 MPa下制得的八月瓜籽油納米乳液粒徑與在130 MPa條件下制得的乳液粒徑相差不大，PDI指數(shù)均在0.2以下，Zeta電位維持在-25 mV左右，具有足夠的靜電斥力，較為穩(wěn)定。均質壓力過高會導致乳液溫度顯著升高，加大油脂被氧化的風險[20]，為了保證乳液的穩(wěn)定性以及油脂的活性成分不被破壞，同時降低高壓對儀器造成損耗以及保護熱敏性活性物質，均質壓力不宜過高，均質壓力選擇為100 MPa。

a-粒徑、PDI；b-Zeta電位

2.1.4 八月瓜籽油質量分數(shù)對八月瓜籽油納米乳液粒徑、Zeta電位的影響

由圖4可知，隨著八月瓜籽油質量分數(shù)的增加，乳液粒徑也隨之增大，Zeta電位絕對值隨之減小[21]，當八月瓜籽油質量分數(shù)為10%時，Zeta電位絕對值最高，證明此時的納米乳液液滴間存在的靜電斥力最大，乳液體系更加穩(wěn)定。在保證八月瓜籽油納米乳液穩(wěn)定性較好的情況下，使載油量保持在較高的水平，以充分利用八月瓜籽油中的各類活性物質，因此確定了八月瓜籽油質量分數(shù)為10%。

圖4 八月瓜籽油質量分數(shù)對八月瓜籽油納米乳液粒徑、Zeta電位的影響

2.1.5 乳化劑與助乳化劑的質量比對八月瓜籽油納米乳液粒徑、PDI及粒徑分布的影響

由圖5可知，隨著乳化劑與助乳化劑質量比的降低，乳液粒徑與PDI指數(shù)增大，在比值為3∶1時，乳液粒徑與PDI最小，并且粒徑分布最窄，證明此時的粒子大小較為均一，乳液體系最穩(wěn)定，缺少助乳化劑的助乳化作用，黏度較高，表面張力較大，降低乳化能力，形成微乳粒徑也較大[22]，因此確定吐溫-80與丙二醇的質量分數(shù)比為3∶1。

a-粒徑、PDI；b-粒徑分布

2.1.6 復合乳化劑的質量分數(shù)對八月瓜籽油納米乳液粒徑、PDI的影響

由圖6可知，隨著復合乳化劑質量分數(shù)的增加，乳液粒徑逐漸減小，并且具有顯著性差異(P<0.05)。在質量分數(shù)為3%時，乳液的PDI最低，此時的乳液體系最穩(wěn)定。當復合乳化劑質量分數(shù)在4%與5%時，粒徑雖然在減小，但PDI有增大的趨勢，可能是因為隨著質量分數(shù)的增大，液滴粒徑減小，導致布朗運動加快，撞擊液滴的分子數(shù)量減少，合力不平衡；也可能是吸附在液滴表面的復合乳化劑分子之間產(chǎn)生了聚集，導致乳液液滴之間的平衡狀態(tài)被破壞，吸附在油滴分子表面的復合乳化劑有互相聚合的趨勢，導致PDI產(chǎn)生了細微的增大。歐盟食品科學委員會規(guī)定吐溫-80的每日最大攝入量為10 mg/kg體重。雖然吐溫-80作為非離子表面活性劑廣泛應用于食品配方中，通常被認為是無毒、無刺激性的，但為了降低合成添加劑對人體的危害，因此復合乳化劑質量分數(shù)選擇3%，因2.1.5確定吐溫-80與丙二醇的質量比為3∶1，因此吐溫-80與丙二醇的質量分數(shù)分別為2.25%和0.75%。

a-粒徑、PDI；b-粒徑分布

2.2 八月瓜籽油納米乳液質量評價

由圖7-a可知，經(jīng)過稀釋后的乳液澄清透明，具有淡藍色的乳光。并由圖7-b可知，稀釋200與1 000倍的乳液經(jīng)平行光入射后產(chǎn)生了丁達爾效應。分別同時向乳液中滴加亞甲基藍與蘇丹紅Ⅲ，觀察到圖7-c中亞甲基藍在乳液中先是沉淀在底部，經(jīng)過輕微的搖晃后均勻分布在乳液中，而蘇丹紅Ⅲ則是浮在納米乳液上層，搖晃后也未觀察到顏色擴散。因此確定八月瓜籽油納米乳液為O/W型。經(jīng)納米粒度與電位分析儀的測定，確定乳液的平均粒徑為(146.43±0.47) nm，Zeta電位為(-25.67±0.21) mV，PDI為0.16±0.01，且由圖7-d可知粒徑分布峰形細高，證明此時的乳液微粒粒徑細小、均一，并且乳液體系較為穩(wěn)定。

a-稀釋液；b-丁達爾效應；c-擴散現(xiàn)象；d-粒徑分布

2.3 八月瓜籽油納米乳液穩(wěn)定性評價

2.3.1 貯藏期穩(wěn)定性

由圖8-a可知，在4、25 ℃條件下貯藏25 d的八月瓜籽油納米乳液粒徑基本維持在150 nm，并沒有顯著變化(P>0.05)，而在第25天時，貯藏溫度為60 ℃的納米乳液出現(xiàn)了分層，經(jīng)測定發(fā)現(xiàn)，其平均粒徑增大至(197.27±1.85) nm。有研究結果表明，這可能是在高溫貯藏條件下乳化劑頭基的最佳曲率發(fā)生變化或水解導致的結果[23]。由圖8-b可知，不同貯藏溫度下，PDI指數(shù)隨著貯藏時間的延長而上升，乳液體系隨著時間延長趨于不穩(wěn)定。在4 ℃下，乳液的PDI指數(shù)呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢。貯藏20 d后，25、60 ℃溫度下納米乳液的PDI值上升趨勢明顯大于在4 ℃條件下的納米乳液。結果表明，八月瓜籽油納米乳液在低溫條件下的貯藏穩(wěn)定性更好。

a-粒徑；b-PDI

2.3.2 稀釋穩(wěn)定性

圖9為八月瓜籽油納米乳液分別稀釋50、200、1 000倍后，觀察到其變?yōu)橥该?，且體系依舊均一，未發(fā)生油水分離現(xiàn)象，證明制備的八月瓜籽油納米乳液具有良好的稀釋穩(wěn)定性。

圖9 八月瓜籽油納米乳液不同稀釋倍數(shù)效果圖

2.3.3 離心穩(wěn)定性

將乳液稀釋200倍后在2 000×g下離心20 min，分別吸取離心前后同樣位置的乳液在500 nm處進行測定，并進行計算，得到3組Ke值(表1)。觀察到離心后乳液體系均一，且平均Ke值為(2.72±0.001)%，在15%以下，且Ke值越小穩(wěn)定性越好[24-25]。證明其離心穩(wěn)定性良好。

表1 八月瓜籽油納米乳液離心穩(wěn)定性測定

2.3.4 吸光比測定

將乳液稀釋1 000倍后，分別測定其在800、400 nm處的吸光度，如表2所示，平均SRI值為0.182±0.007，在0.3以下，證明制備的乳液有較好的穩(wěn)定性。

表2 八月瓜籽油納米乳液吸光比測定

2.4 八月瓜籽油納米乳液對ABTS陽離子自由基的清除能力

通過測定八月瓜籽油、制得的納米乳液以及不同溫度下貯藏25 d納米乳液對ABTS陽離子自由基清除能力得出，八月瓜籽油納米乳液的抗氧化活性為(52.29±2.34) μmol Trolox/g，原料油乙醇提取物的抗氧化活性為(45.82±0.20) μmol Trolox/g，提高了14.12%。可以證明八月瓜籽油納米乳液保留了籽油的抗氧化活性，并且比八月瓜籽油乙醇提取物抗氧化活性更強，這說明該體系能夠提高八月瓜籽油對ABTS陽離子自由基的清除能力。由圖10可知，貯藏溫度的增加導致八月瓜籽油納米乳液的抗氧化能力有所下降，可能是由于活性物質的熱不穩(wěn)定性，也可能是劇烈的布朗運動造成液滴與氧氣接觸比較頻繁導致活性物質失活。

圖10 八月瓜籽油納米乳液在貯藏過程中抗氧化活性的變化

3 結論

本實驗對制備八月瓜籽油納米乳液的配方和工藝進行優(yōu)化，以食品級的吐溫-80作為乳化劑，助乳化劑選擇丙二醇，本實驗設計單因素試驗對制備八月瓜籽油納米乳液的工藝參數(shù)進行優(yōu)化，以食品級的吐溫-80作為乳化劑，最終確定工藝參數(shù)為將質量分數(shù)為10%的八月瓜籽油，2.25%的吐溫-80，0.75%的丙二醇，在100 MPa壓力下均質5次，制得八月瓜籽油納米乳液。制得平均粒徑為(146.43±0.47) nm，Zeta電位為(-25.67±0.21) mV，PDI為0.16±0.01的 O/W型納米乳液。

通過進行穩(wěn)定性試驗，發(fā)現(xiàn)離心后的八月瓜籽油納米乳液并未產(chǎn)生分層、絮凝，且測定的Ke值為(2.72±0.11)%，低于15%，因此乳液具有良好的物理穩(wěn)定性；分別在800、400 nm測定吸光度，得出SRI為0.182±0.005，<0.3，證明乳液具有較好的穩(wěn)定性；在低溫下貯藏25 d后的結果表明制備的納米乳液貯藏期穩(wěn)定性較好；制得的八月瓜籽油納米乳液對ABTS陽離子自由基清除能力為(52.29±2.341) μmol Trolox/g，比八月瓜籽油乙醇提取物抗氧化活性更強，這說明該體系能夠提高八月瓜籽油對ABTS陽離子自由基的清除能力。

本實驗對研究八月瓜籽油的運載體系具有一定價值，通過將八月瓜籽油制成納米乳液，提高了其生物利用度，為利用八月瓜籽油開發(fā)新產(chǎn)品提供了新思路。