活性氧激活缺氧誘導(dǎo)因子-1α加速宰后成熟初期牛肉能量代謝

郭雨軒，陳 騁，師希雄，郭兆斌，馬國(guó)源，馬紀(jì)兵，余群力

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

宰后成熟過(guò)程中以糖酵解為主要途徑的能量代謝反應(yīng)對(duì)牛肉品質(zhì)的形成起至關(guān)重要的作用[1]。屠宰后缺氧迫使肌肉細(xì)胞啟動(dòng)缺氧應(yīng)答反應(yīng)，通過(guò)糖酵解維持細(xì)胞能量供應(yīng)，該過(guò)程引起肌肉pH值變化進(jìn)而對(duì)嫩度、保水性、色澤、風(fēng)味等關(guān)鍵品質(zhì)產(chǎn)生重要影響[2]。目前，大量學(xué)者基于飼喂管理、屠宰工藝以及宰后成熟等不同角度，對(duì)調(diào)控糖酵解反應(yīng)的因素進(jìn)行了全面研究。例如，采用電刺激處理提升宰后成熟過(guò)程中牦牛肉能量代謝水平，加速pH值降低繼而促進(jìn)牦牛肉骨架蛋白質(zhì)降解，有利于牦牛肉嫩度的改善[3]。飼料中添加直鏈淀粉以提升宰后能量代謝底物濃度和關(guān)鍵酶活性，間接調(diào)節(jié)pH值變化速率從而影響肌肉的保水性[4]。但是，宰后成熟過(guò)程中牛肉能量代謝受到宰前、屠宰及成熟環(huán)節(jié)眾多因素的影響，現(xiàn)有研究尚不能完全解釋宰后能量代謝的調(diào)控機(jī)理。

缺氧狀態(tài)下，肌肉細(xì)胞能量代謝方式向糖酵解的轉(zhuǎn)變依賴于蛋白質(zhì)的表達(dá)。缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxiainducible factor-1，HIF-1）作為細(xì)胞缺氧條件下能量代謝的重要調(diào)控因子，其氧敏感的亞基HIF-1α直接調(diào)控大多數(shù)糖酵解酶的表達(dá)或激活[5-6]。供氧正常時(shí)，HIF-1α被脯氨酰羥化酶（prolineamide hydroxylase，PHD）降解，反之HIF-1α則正常表達(dá)并上調(diào)糖酵解酶表達(dá)，促使細(xì)胞能量代謝轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒鈁7]。近期研究認(rèn)為，細(xì)胞缺氧應(yīng)激過(guò)程中ROS通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)功能對(duì)糖酵解反應(yīng)的啟動(dòng)表現(xiàn)出重要調(diào)控作用。缺氧導(dǎo)致肌肉細(xì)胞線粒體的電子傳遞受阻而產(chǎn)生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），部分ROS擴(kuò)散至細(xì)胞質(zhì)中作為信號(hào)傳導(dǎo)分子調(diào)控多種細(xì)胞生理反應(yīng)，其中就包括細(xì)胞能量代謝[8]。目前，ROS介導(dǎo)HIF-1α調(diào)控細(xì)胞能量代謝主要有2 種途徑：一是ROS通過(guò)細(xì)胞氧化修飾作用引起PHD活力降低，抑制PHD對(duì)HIF-1α的降解作用，促進(jìn)HIF-1α穩(wěn)定積累[9]；二是ROS能夠激活磷酸肌醇-3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）并促進(jìn)蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）磷酸化，磷酸化AKT（p-AKT）調(diào)控HIF-1α穩(wěn)定表達(dá)并與細(xì)胞缺氧反應(yīng)元件（hypoxia response elements，HRE）結(jié)合，進(jìn)而啟動(dòng)糖酵解反應(yīng)[10]。但是，宰后成熟過(guò)程中牛肉細(xì)胞糖酵解反應(yīng)的調(diào)控是否依賴于上述機(jī)制還有待研究。

因此，本研究選取牛背最長(zhǎng)肌，采用ROS激活劑H2O2、清除劑N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine，NAC）和生理鹽水處理后，在溫度為4 ℃、相對(duì)濕度為85%條件下成熟，依次在第0.5、6、12、24、48小時(shí)測(cè)定ROS細(xì)胞分布及含量、PHD活力、PI3K/AKT信號(hào)通路表達(dá)水平、HIF-1α細(xì)胞聚集和表達(dá)水平、糖原含量、R值以及pH值變化水平，進(jìn)而探究ROS含量對(duì)宰后成熟初期牛肉代謝水平的調(diào)控機(jī)制，以期為進(jìn)一步明確宰后牛肉品質(zhì)形成及調(diào)控機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

平均年齡3 歲、體質(zhì)量（500±50）kg、飼養(yǎng)條件相同、健康無(wú)病的安格斯雜交公牛6 頭，選自甘肅康美現(xiàn)代農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)集團(tuán)有限公司。

糖原、次黃苷酸、二磷酸腺苷、三磷酸腺苷含量檢測(cè)試劑盒、PHD活力檢測(cè)試劑盒 上海梵態(tài)生物科技有限公司；PI3K、p-AKT、HIF-1α、肌動(dòng)蛋白多克隆抗體（一抗）、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、Cy3標(biāo)記的山羊抗兔IgG（二抗）、聚偏二氟乙烯膜、NAC上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司；4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）、H2O2北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FV1200激光共聚焦顯微鏡 日本奧林巴斯公司；GelDoc-It310凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)耶拿分析有限公司；Aperio GT450智能數(shù)字掃描儀 上海徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易有限公司；DYCZ-25D電泳儀 濟(jì)南來(lái)寶醫(yī)療器械有限公司；MK-40A離心機(jī) 湖南邁克爾實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；R255自動(dòng)切片機(jī) 湖北泰維科技實(shí)業(yè)股份有限公司；HS-1145生物組織攤片機(jī) 金華華速科技有限公司；UV755B紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海荊和分析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的采集與處理

肉牛屠宰前24 h禁食、6 h禁水，采用擊暈聯(lián)合三管齊斷法屠宰，降低屠宰應(yīng)激引起的糖原過(guò)度消耗。宰后45 min內(nèi)取背最長(zhǎng)肌，切割成厚約3 cm、質(zhì)量約200 g的肉塊。將肉樣分成H2O2處理組、NAC處理組及對(duì)照組，分別按照肉液比10∶1（g/mL）均勻注射20 mmol/L H2O2溶液、20 mmol/L NAC溶液和0.9%生理鹽水。樣品置于溫度4 ℃、相對(duì)濕度85%條件下成熟，分別在0.5、6、12、24、48 h測(cè)定pH值并立即采用液氮速凍，然后在-80 ℃條件下保存。

1.3.2 ROS含量測(cè)定

參考張玉林[11]的方法制備和封閉切片，滴加ROS熒光探針，37 ℃條件下孵育60 min。然后加入DAPI染色，避光反應(yīng)3 min顯核，用磷酸緩沖液洗去DAPI，甘油封片后立即使用共聚焦顯微鏡拍照觀察ROS的細(xì)胞分布情況。ROS熒光強(qiáng)度使用ImageJ進(jìn)行分析，并以單位面積的熒光強(qiáng)度表示ROS含量。

1.3.3 PHD活力測(cè)定

參考Kaluz等[12]的方法，稱取1 g肉樣剪碎，加入9 mL磷酸鹽緩沖液，冰浴勻漿，在6000×g、4 ℃條件下離心10 min，使用PHD活力試劑盒檢測(cè)上清液PHD活力。PHD活力表示為每克肌肉組織中的酶活力單位數(shù)（U）。

1.3.4 PI3K/AKT信號(hào)通路表達(dá)水平測(cè)定

采用蛋白質(zhì)免疫印跡法測(cè)定PI3K/AKT信號(hào)通路表達(dá)水平。參考Jia Zhen等[13]的方法分離目標(biāo)蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，封閉60 min后加入相應(yīng)一抗（1∶1000），孵育過(guò)夜，再加入相應(yīng)二抗（1∶500）避光反應(yīng)60 min。完成后經(jīng)試劑盒發(fā)光，采用凝膠成像系統(tǒng)和化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)進(jìn)行定量分析，以目的蛋白和標(biāo)準(zhǔn)蛋白灰度的比值表示蛋白表達(dá)水平。

1.3.5 HIF-1α細(xì)胞聚集與表達(dá)水平測(cè)定

采用單標(biāo)免疫熒光法分析HIF-1α細(xì)胞聚集與表達(dá)水平。參考Federico等[14]的方法制備切片（4 μm），切片采用由高到低不同濃度的乙醇進(jìn)行洗滌，然后用抗原修復(fù)液修復(fù)并以5%的BSA封閉。加入相應(yīng)一抗（1∶500），搖床孵育過(guò)夜，再加入相應(yīng)二抗（1∶100），避光反應(yīng)60 min。加入染色液反應(yīng)10 min后滴加淬滅劑孵育5 min，封片處理。立即使用全景切片掃描儀拍照觀察。HIF-1α細(xì)胞聚集情況以陽(yáng)性細(xì)胞的熒光強(qiáng)度表示。

1.3.6 能量代謝指標(biāo)測(cè)定

樣品處理和R值計(jì)算參考Wicks等[15]的方法，稱取2 g肉樣，加入18 mL提取液，高速間歇式勻漿，勻漿液以4 ℃、6000×g離心20 min，收集上清液。分別按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定上清液中糖原、三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、次黃苷酸含量。其中，R值按下式計(jì)算：

式中：A為二磷酸腺苷含量/（μmol/g）；B為次黃苷酸含量/（μmol/g）；C為三磷酸腺苷含量/（μmol/g）。

1.3.7 pH值測(cè)定

參照邢通[16]的方法，使用便捷式pH計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 ROS含量變化

肌肉細(xì)胞中ROS一方面作為重要的信號(hào)分子參與調(diào)控多種細(xì)胞生理反應(yīng)，另一方面作為細(xì)胞毒性分子，通過(guò)加速脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)導(dǎo)致ROS不斷積累[17]。從圖1可以看出，成熟0.5 h，H2O2處理組的ROS熒光強(qiáng)度（圖中綠色標(biāo)記）略強(qiáng)于對(duì)照組與NAC處理組，但隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，H2O2處理組的熒光強(qiáng)度顯著強(qiáng)于其他2 組。由圖2可以看出，3 組樣品中ROS含量整體呈顯著升高趨勢(shì)（P＜0.05）。其中，外源H2O2處理能夠顯著提升牛肉初始ROS含量，H2O2處理組成熟0.5 h ROS含量分別是對(duì)照組和NAC處理組的1.52、1.77 倍（P＜0.05），并在48 h內(nèi)顯著高于其他2 組（P＜0.05）。同時(shí)，NAC處理組能夠在0.5～12 h內(nèi)顯著抑制ROS的積累，但是隨成熟時(shí)間延長(zhǎng)，ROS含量也出現(xiàn)顯著升高（P＜0.05）。ROS可作為信號(hào)分子參與細(xì)胞存活和代謝過(guò)程的調(diào)控，張佳瑩[18]發(fā)現(xiàn)宰后初期ROS作為上游信號(hào)分子通過(guò)線粒體細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)，加快細(xì)胞凋亡進(jìn)而促進(jìn)牛肉結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)降解，間接促進(jìn)牛肉嫩化進(jìn)程。劉瑜[19]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子可以顯著提升小鼠肌肉細(xì)胞中ROS含量，且ROS積累加速HIF-1α聚集進(jìn)而影響細(xì)胞的能量代謝水平，但具體調(diào)控機(jī)制尚未清楚。由此可見(jiàn)，宰后成熟初期缺氧應(yīng)激誘導(dǎo)ROS生成，較高的初始濃度能夠促進(jìn)ROS在牛肉中快速積累，并可能對(duì)細(xì)胞能量代謝發(fā)揮調(diào)控作用。

圖1 宰后成熟過(guò)程中牛肉中ROS細(xì)胞分布變化（×400）Fig.1 Changes in the cellular distribution of ROS in postmortem bovine muscle (× 400)

圖2 宰后成熟過(guò)程中牛肉中ROS含量變化Fig.2 Changes in ROS content in bovine muscle during postmortem aging

2.2 PHD活力變化

PHD在供氧正常的細(xì)胞中通過(guò)降解HIF-1α而抑制其對(duì)糖酵解反應(yīng)的激活作用[20]。為探究宰后缺氧狀態(tài)下ROS對(duì)HIF-1α降解酶PHD的作用，分析宰后成熟過(guò)程中不同ROS含量條件下牛肉PHD活力的變化。從圖3可以看出，3 組樣品PHD活力隨宰后成熟時(shí)間的延長(zhǎng)呈顯著下降趨勢(shì)（P＜0.05）。不同的是，H2O2處理組PHD活力在0.5～48 h顯著低于其余2 組（P＜0.05），并在24 h降低到最低水平（22.15 U/g），分別比對(duì)照組和NAC處理組降低30.11%和42.03%（P＜0.05）。而NAC處理能夠在0.5～12 h內(nèi)延緩PHD活力的降低，這可能歸因于NAC在宰后初期（0.5～12 h）對(duì)ROS的抑制作用（圖2）。Liu Yang等[21]發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞處于低氧環(huán)境時(shí)，ROS大量產(chǎn)生并抑制PHD活力，同時(shí)檢測(cè)到HIF-1α表達(dá)水平上升，而當(dāng)恢復(fù)供氧后，HIF-1α表達(dá)水平迅速下降。供氧正常細(xì)胞中，PHD的羥基化作用將HIF-1α修飾標(biāo)記，后者被希佩爾-林道病蛋白靶向降解[22]。而在缺氧細(xì)胞中，不斷產(chǎn)生的ROS通過(guò)氧化修飾作用破壞PHD的活性位點(diǎn)，導(dǎo)致酶活力降低，從而抑制了HIF-1α的降解，為HIF-1α發(fā)揮能量代謝調(diào)節(jié)作用提供了必要條件[23-24]。本研究結(jié)果表明，宰后成熟過(guò)程中牛肉產(chǎn)生的ROS對(duì)PHD活力具備抑制作用，有利于HIF-1α的穩(wěn)定積累。

圖3 宰后成熟過(guò)程中牛肉中PHD活力變化Fig.3 Changes in PHD activity in bovine muscle during postmortem aging

2.3 PI3K/AKT信號(hào)通路表達(dá)水平變化

PI3K/AKT作為調(diào)控HIF-1α穩(wěn)定表達(dá)的關(guān)鍵信號(hào)通路，在細(xì)胞缺氧的能量代謝中具有重要作用[25]。從圖4a、b可以看出，在6～48 h內(nèi)，不同ROS水平下PI3K的表達(dá)水平存在顯著差異（P＜0.05），H2O2處理組PI3K表達(dá)水平在0.5 h分別是對(duì)照組和NAC處理組的2.39 倍和2.95 倍，在0.5～12 h內(nèi)上調(diào)42.63%，且顯著高于其他2 組（P＜0.05）。從圖4c、d可以看出，在0.5 h時(shí)，H2O2處理組p-AKT表達(dá)水平分別是對(duì)照組和NAC組的2.62 倍和4.87 倍（P＜0.05），并在0～6 h內(nèi)顯著高于其他2 組（P＜0.05）。這可能是由于H2O2處理組PI3K在相應(yīng)時(shí)間區(qū)間（0.5～12 h）內(nèi)顯著上調(diào)，進(jìn)而迅速靶向調(diào)控AKT磷酸化引起，同時(shí)也說(shuō)明成熟初期PI3K/AKT信號(hào)通路的激活依賴于ROS的積累。PI3K/AKT是一種特殊的信號(hào)通路復(fù)合體，PI3K靶向調(diào)控AKT磷酸化形成具有活性的p-AKT，后者進(jìn)一步誘導(dǎo)和活化HIF-1α，以提升HIF-1α的穩(wěn)定性[26]。近期研究發(fā)現(xiàn)，ROS的抑制劑人參皂苷Rk1可以減緩PI3K/AKT信號(hào)通路的激活，通過(guò)削弱AKT磷酸化水平進(jìn)而降低能量代謝水平[27]。相反地，紅景天苷能夠提升PI3K/AKT信號(hào)通路活化水平，進(jìn)而促進(jìn)HIF-1α穩(wěn)定表達(dá)以加速細(xì)胞能量代謝方式的轉(zhuǎn)換[28]。也有研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)激活嘌呤核苷磷酸化酶能加速ROS的積累，進(jìn)而提升p-AKT表達(dá)，增加HIF-1α轉(zhuǎn)錄水平以維持代謝的完整性[29-30]。本研究中較高的初始ROS含量顯著加速PI3K/AKT通路的激活，結(jié)合ROS對(duì)PHD活力的抑制作用（圖3），表明宰后成熟初期ROS積累為HIF-1α的穩(wěn)定表達(dá)提供了必要條件。

圖4 宰后成熟過(guò)程中牛肉中PI3K和p-AKT表達(dá)水平變化Fig.4 Changes in PI3K and p-AKT expression levels in bovine muscle during postmortem aging

2.4 HIF-1α的細(xì)胞聚集與表達(dá)水平變化

HIF-1α作為糖酵解反應(yīng)的上游轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞缺氧應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，在缺氧條件下HIF-1α能夠激活90%以上的糖酵解酶和其他關(guān)鍵蛋白質(zhì)[31]。為了明確ROS對(duì)成熟初期牛肉HIF-1α表達(dá)水平的影響，進(jìn)一步分析宰后成熟過(guò)程中牛肉HIF-1α聚集情況與表達(dá)水平變化。從圖5可以看出，3 組樣品HIF-1α在0.5 h時(shí)聚集程度（圖中紅色標(biāo)記）不明顯，但隨著宰后成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，HIF-1α聚集程度不斷升高。H2O2處理組HIF-1α聚集程度明顯高于對(duì)照組和NAC處理組。如圖6所示，宰后成熟0.5～24 h內(nèi)H2O2處理組和對(duì)照組HIF-1α表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05），NAC處理組HIF-1α表達(dá)水平在0.5～12 h被抑制，在12～24 h出現(xiàn)顯著升高（P＜0.05）。此外，H2O2處理組HIF-1α表達(dá)水平在24 h時(shí)分別是對(duì)照組和NAC組的1.34 倍和1.81 倍，并且在6～48 h內(nèi)保持顯著較高水平（P＜0.05）。上述結(jié)果證實(shí)ROS能夠促進(jìn)宰后成熟初期牛肉中HIF-1α穩(wěn)定表達(dá)，這可能是ROS通過(guò)抑制PHD活力（圖3）和激活PI3K/AKT信號(hào)通路（圖4）的綜合作用機(jī)制實(shí)現(xiàn)。HIF-1α在缺氧細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)并向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，迅速調(diào)控HRE中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及多種糖酵解酶的表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)糖酵解反應(yīng)通量以維持細(xì)胞能量供應(yīng)[32]。此外，Paik等[33]發(fā)現(xiàn)ROS（特別是H2O2）能夠誘導(dǎo)細(xì)胞中HIF-1α表達(dá)，間接激活己糖激酶和磷酸果糖激酶2 種糖酵解限速酶，進(jìn)而顯著提升細(xì)胞糖酵解供能效率。因此，宰后成熟初期產(chǎn)生的ROS作為信號(hào)分子調(diào)控HIF-1α表達(dá)并積累，可能對(duì)牛肉糖酵解能量代謝表現(xiàn)出調(diào)控作用。

圖5 宰后成熟過(guò)程中牛肉HIF-1α細(xì)胞聚集變化情況（×200）Fig.5 Changes in cellular aggregation of HIF-1α in bovine muscle during postmortem aging (× 200)

圖6 宰后成熟過(guò)程中牛肉HIF-1α表達(dá)水平變化Fig.6 Changes in HIF-1α expression level in bovine muscle during postmortem aging

2.5 能量代謝水平變化

為明確ROS介導(dǎo)HIF-1α表達(dá)對(duì)能量代謝水平的影響，分別對(duì)糖酵解底物糖原含量和能量變化水平R值進(jìn)行測(cè)定。圖7a中，3 組樣品糖原含量均呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)（P＜0.05）。其中，H2O2處理組糖原含量在6～24 h顯著低于其他2 組，且在24 h內(nèi)下降到最低水平（P＜0.05），比其他2 組提前了24 h。而NAC組糖原含量下降速率相對(duì)較低，在6～48 h內(nèi)保持顯著較高水平（P＜0.05）。上述結(jié)果表明ROS能夠加速宰后初期牛肉糖酵解速率，NAC處理則對(duì)糖酵解反應(yīng)表現(xiàn)出一定的抑制作用。這種影響同時(shí)也體現(xiàn)在R值變化特征上，R值是糖酵解過(guò)程中三磷酸腺苷供能后分解形成的產(chǎn)物二磷酸腺苷和次黃苷酸與自身含量的比值，R值越高表明能量代謝水平越高[34]。從圖7b可以看出，3 組樣品R值隨宰后成熟時(shí)間延長(zhǎng)而顯著升高（P＜0.05）。其中，H2O2處理組R值在6～24 h內(nèi)顯著高于其他2 組（P＜0.05），這與圖7a中糖原含量變化相對(duì)應(yīng)，表明ROS能夠提升宰后成熟初期牛肉糖酵解供能效率。對(duì)比3 組樣品，H2O2處理組PHD活力、PI3K、p-AKT表達(dá)水平在宰后0.5 h就表現(xiàn)出顯著差異（圖3、4），而HIF-1α表達(dá)和能量代謝水平的差異性則出現(xiàn)在6 h（圖6、7），進(jìn)一步證實(shí)ROS作為上游信號(hào)分子，通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)介導(dǎo)HIF-1α表達(dá)，逐步調(diào)控和活化糖酵解供能途徑。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，楊威[35]發(fā)現(xiàn)當(dāng)清除肝癌細(xì)胞中的ROS后，HIF-1α表達(dá)量降低，下游葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)水平和糖酵解限速酶活性也隨之降低，最終導(dǎo)致糖酵解速率減慢。Feng Xiaomeng等[36]發(fā)現(xiàn)缺氧條件下細(xì)胞中上游信號(hào)分子ROS的增加導(dǎo)致HIF-1α穩(wěn)定聚集，促進(jìn)了糖原消耗和R值升高。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，宰后成熟初期牛肉中ROS的積累促進(jìn)HIF-1α穩(wěn)定表達(dá)，能夠顯著提升牛肉的能量代謝水平。

圖7 宰后成熟過(guò)程中牛肉糖原含量和R值變化Fig.7 Changes in glycogen content and R value in bovine muscle during postmortem aging

2.6 pH值變化

糖酵解反應(yīng)供能過(guò)程中，糖原經(jīng)酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)化為乳酸，引起pH值下降直接影響肌肉的色澤、嫩度、保水性等重品質(zhì)，因此pH值常用作評(píng)價(jià)肉品質(zhì)的重要指標(biāo)之一[37]。由圖8可以看出，3 組樣品在0.5 h時(shí)pH值差異不顯著，但在成熟過(guò)程中均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)（P＜0.05）。其中，H2O2處理組pH值在6～12 h內(nèi)顯著低于其他2 組（P＜0.05），并且在第12小時(shí)達(dá)到極限pH值，分別比對(duì)照組和NAC處理組提前了12 h和36 h。pH值的變化規(guī)律與糖原消耗水平（圖7a）保持一致，進(jìn)一步說(shuō)明ROS對(duì)牛肉能量代謝的調(diào)控作用直接影響pH值變化速率。pH值在正常范圍內(nèi)快速降低能夠縮短牛肉宰后僵直時(shí)間，從而有利于加速肌肉成熟嫩化進(jìn)程，對(duì)改善肉的嫩度、降低水分流失、延緩肉色劣變具有重要意義[38]。此外，肌肉成熟過(guò)程中，pH值的降低對(duì)糖酵解限速酶活性產(chǎn)生反向抑制作用，加之糖原消耗導(dǎo)致底物供應(yīng)不足，最終使肌肉能量代謝速率減弱、pH值不再降低[39]，這也解釋本實(shí)驗(yàn)不同處理組在48 h時(shí)糖原含量、R值以及pH值達(dá)到相近水平，表明ROS對(duì)宰后成熟初期能量代謝的調(diào)控作用表現(xiàn)在提升能量代謝速率而非程度。然而，上述調(diào)控作用對(duì)牛肉關(guān)鍵品質(zhì)影響也有待進(jìn)一步研究。

圖8 宰后成熟過(guò)程中牛肉pH值變化Fig.8 Changes in pH in bovine muscle during postmortem aging

3 結(jié)論

宰后成熟過(guò)程中牛肉會(huì)不可避免地產(chǎn)生ROS，其一方面抑制PHD活力，減少了對(duì)HIF-1α的降解作用；另一方面能夠迅速激活PI3K/AKT信號(hào)通路，加速了HIF-1α的穩(wěn)定積累。HIF-1α作為重要的能量代謝調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)加速糖原消耗顯著提升牛肉能量代謝水平，促使牛肉在短時(shí)間達(dá)到極限pH值。同時(shí)，由于成熟過(guò)程中糖原的快速消耗和pH值降低對(duì)糖酵解反應(yīng)的反向抑制作用，ROS介導(dǎo)HIF-1α對(duì)能量代謝的調(diào)控作用局限于加速宰后成熟初期能量代謝。上述結(jié)論有助于完善宰后成熟初期牛肉能量代謝的調(diào)控機(jī)理，為牛肉品質(zhì)改善技術(shù)的研發(fā)提供理論依據(jù)。