畜禽益生菌研究方向的思考

陸偉偉,汪 兵,李慶華,張盼望

(1.鄂州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,湖北 鄂州 436000;2.鄂州市農(nóng)業(yè)綜合執(zhí)法支隊(duì))

益生菌,又稱“益生素”,2001年由聯(lián)合國(guó)糧食農(nóng)業(yè)委員會(huì)統(tǒng)一將其概括為:通過(guò)攝取一定的數(shù)量,對(duì)宿主健康產(chǎn)生有益作用活的微生物。因具備天然、安全、功能多、無(wú)殘留等優(yōu)點(diǎn)一直是益生菌備受關(guān)注的重要因素,也被視為替代抗生素最具潛力的生物制劑之一。目前的研究重點(diǎn)主要集中在益生菌的體外篩選優(yōu)良菌種和使用效果等方面的應(yīng)用研究。首先通過(guò)特定的生化試驗(yàn)和分子生物學(xué)鑒定,明確菌株具體的種屬分類,然后對(duì)目的菌株經(jīng)過(guò)安全性、有效性、耐受性、同源性和生產(chǎn)性等方面驗(yàn)證,篩選出活性好、耐受性強(qiáng)、易于大量生產(chǎn)的菌株投入到養(yǎng)殖生產(chǎn)中,用于提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能和改善畜產(chǎn)品質(zhì)量。

但隨著科技水平的進(jìn)步,僅靠體外篩選和臨床飼喂等方式研究益生菌功能,難于發(fā)揮出菌種的最大功效,因此本文綜合眾多學(xué)者的研究成果,系統(tǒng)指出益生菌今后一段時(shí)期的研究重點(diǎn),便于研究出益生菌更多的功效和作用。

1 采用新技術(shù)、新方法,瞄準(zhǔn)腸道菌群核心靶位

腸道菌群主要由胃腸道內(nèi)寄居的微生物群落和過(guò)路群落構(gòu)成,包括厭氧菌、需氧菌和兼性厭氧菌等。各種菌之間互相制約,互相依存,腸道內(nèi)菌群形成一種平衡狀態(tài)。正常情況下,腸道菌群有相當(dāng)固定的細(xì)菌組成,而且各菌群按照一定比例組合,對(duì)宿主胃腸道功能和完整性、維持免疫機(jī)能和宿主能量代謝等方面起著重要作用。但當(dāng)腸道菌群失衡時(shí),則會(huì)導(dǎo)致輕度慢性腸炎、腸道炎癥疾病、腸道應(yīng)激綜合征、代謝紊亂,進(jìn)而引起肥胖病、糖尿病等不良后果。

2011年O’Shea提出益生菌或者代謝產(chǎn)物可以抑制病菌的生長(zhǎng),主要通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)和結(jié)合受體位點(diǎn)來(lái)抵抗其他細(xì)菌的生長(zhǎng)。同年,Lee and Bak得出乳酸桿菌能提高腸道屏障,導(dǎo)致能粘附到腸道表面的細(xì)菌數(shù)目降低,降低胃腸道疾病的發(fā)生,比如:腸道應(yīng)激綜合征、腸道炎癥疾病等。而對(duì)于益生菌能引起腸道菌群的改變,目前使用的方法手段主要有高通量測(cè)序、DGGE、宏基因組測(cè)序等新技術(shù)。2010年Cox運(yùn)用高通量測(cè)序?qū)?月齡的嬰兒糞便進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示益生菌增加腸道菌群的均勻度指數(shù)。2011年Ki Cha運(yùn)用DGGE技術(shù)對(duì)患者糞便進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明益生菌組使腸道菌群更趨于穩(wěn)定。2013年P(guān)eera Hemarajata and James Versalovic提出益生菌對(duì)腸道菌群組成、多樣性作用的改變,主要采用宏基因組技術(shù)完成的;2012年P(guān)reidis探討益生菌對(duì)小鼠腸道菌群的影響,同樣使用了16S rRNA宏基因組測(cè)序方法,結(jié)果顯示此益生菌能增加腸道菌群的多樣性和穩(wěn)定性。因此,對(duì)于益生菌采用的新技術(shù)、新方法,主要針對(duì)腸道菌群這個(gè)關(guān)鍵靶位產(chǎn)生作用。

2 優(yōu)良菌種的選育方法實(shí)現(xiàn)新突破

優(yōu)良菌種的選育是生產(chǎn)益生菌菌株的關(guān)鍵一環(huán),是發(fā)揮益生作用的重要一步。目前,篩選益生菌的方法主要通過(guò)毒力因子安全性檢測(cè)、模擬胃腸道酸堿性耐受等試驗(yàn),進(jìn)而培育出目的菌株。但隨著科技手段的進(jìn)步,很多文獻(xiàn)表明益生菌的選育方向更加精準(zhǔn)、選育方式更加多樣。秀麗隱桿線蟲(C. elegans)是一種可以獨(dú)立生存的線蟲 ,個(gè)體小,生活史短,通身透明,以大腸桿菌為食,其遺傳背景清楚,和高等動(dòng)物相比有很大的同源性。早在1965年,科學(xué)家就采用線蟲作為模式生物用于發(fā)育生物學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域開展研究。

當(dāng)前線蟲應(yīng)用領(lǐng)域廣泛,在益生菌和藥物篩選、環(huán)境生物學(xué)等方面都取得很大進(jìn)展。研究表明,Grompone和Martorel等人首先采用H2O2使線蟲處于氧化應(yīng)激狀態(tài),然后喂養(yǎng)定量益生菌株后,通過(guò)觀察線蟲壽命長(zhǎng)短等因素來(lái)選育抗氧化益生菌,方法便捷且實(shí)效性高。另外作者還對(duì)篩選的目的菌株就如何調(diào)控宿主壽命等內(nèi)在機(jī)制開展了深層探究,文章的思考視角和選育益生菌株的方式與以往完全不同,研究的廣度和深度都有較大進(jìn)展,也為今后科學(xué)選育出更多有益生功能的菌株開辟了新的路徑。

3 益生菌株分子機(jī)理方面的探索

研究表明益生菌是良好的免疫激活劑,主要通過(guò)特異性和非特異性免疫應(yīng)答途徑來(lái)增強(qiáng)機(jī)體免疫防御能力。2009年Zoumpopoulou等人采取骨髓來(lái)源的IEC、DC及九種不同來(lái)源的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和益生菌株開展體外互作模擬研究。結(jié)果顯示金黃色葡萄球菌、大腸桿菌與益生菌株相比,上調(diào)了免疫細(xì)胞分泌的一些促炎癥因子含量,結(jié)論得出可能與細(xì)菌表面不同的標(biāo)記相關(guān)。

2009年P(guān)reidis和Versalovic表明益生菌主要通過(guò)分泌活性分子和代謝物來(lái)激活免疫細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞,進(jìn)而分泌促炎癥和抗炎癥因子來(lái)增強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)。Thomas和Versalovic在2010年具體闡述了益生菌一方面通過(guò)與細(xì)胞受體識(shí)別,激活MAPK/ NF- κB等信號(hào)途徑使巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子,從而提高機(jī)體的非特異免疫水平;另一方面激活DC使初始的T細(xì)胞向Th1/Th2/Th17等不同類型分化,主要分泌IL-1、IL-6、TNF-α等促炎癥因子,向Treg類型分化,主要分泌IL-10等抗炎癥因子,從而共同影響機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答;使B細(xì)胞分化成效應(yīng)B細(xì)胞分泌IgA/IgG,增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫應(yīng)答,抵抗病原菌的入侵(見圖1)。

當(dāng)前大部分學(xué)者的研究重點(diǎn)主要在益生菌與免疫細(xì)胞的體外互作方面,由于病原菌和益生菌菌株表面分子標(biāo)記不同,與DC或者IEC等免疫細(xì)胞結(jié)合后,致使其分泌的細(xì)胞因子不同、表達(dá)量不一。但菌株表面的標(biāo)記如何調(diào)控免疫細(xì)胞,其內(nèi)在的分子機(jī)理信號(hào)傳導(dǎo)途徑仍是今后科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)部分。

4 開發(fā)出“益生菌種測(cè)序+生物信息學(xué)+功能分析”融合新思維

當(dāng)前研究益生菌或其他微生物的功能多樣性,主要采用基因測(cè)序手段,優(yōu)點(diǎn)在于不用對(duì)益生菌進(jìn)行傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)即可達(dá)到對(duì)未知功能性基因測(cè)定,過(guò)程全自動(dòng)化,能實(shí)現(xiàn)高通量、多樣本間的相關(guān)性分析。同時(shí)結(jié)合生物信息學(xué)知識(shí),采用“菌種測(cè)序+生物信息+功能分析”新思維,能更深層地挖掘益生菌的功能作用。

2011年Saulnier和Santos等人對(duì)四株篩選到的乳酸菌菌株采取全基因組測(cè)序方法,同時(shí)借助生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)軟件,開展了基因組、轉(zhuǎn)錄組等相關(guān)比較,初步探索出抗菌特性分析、代謝分析、免疫調(diào)節(jié)機(jī)制和黏附機(jī)制等內(nèi)在調(diào)控的靶向基因,此融合思維也為后續(xù)益生菌或其他菌株的更多功能研究提供了有力依據(jù)。

5 復(fù)合益生菌制劑“1+1>2”的作用功效

2010年我國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布新公告,明確規(guī)定能直接飼喂動(dòng)物且安全的微生物添加劑種類有33種,其中乳酸菌類有17種,芽胞桿菌類占5種,并規(guī)定這些菌株即能單獨(dú)使用,也能夠兩種菌株或多種菌株混合添加。

研究表明,趙劍闖等人詳細(xì)分析了枯草芽胞桿菌與乳酸菌不同的益生機(jī)制,王永芬等采用枯草芽胞桿菌和乳酸菌配比成復(fù)合益生菌,主要研究復(fù)合益生菌和單一菌株對(duì)蛋雞生產(chǎn)性能的影響,結(jié)論顯示飼喂復(fù)合益生菌在產(chǎn)蛋率、平均蛋重和日采食量等指標(biāo)上顯著高于單一菌株,這也與Zhang Panwang等人在蛋雞熱應(yīng)激方面的研究結(jié)論相一致。2014年Wang等人利用復(fù)合益生菌菌株(由雙歧桿菌、乳酸桿菌和鏈球菌組成)在PI-IBS鼠科模型中證實(shí),在腸道敏感性、屏障功能和免疫性能等指標(biāo)上,復(fù)合益生菌株的改善效果均好于單菌作用。

現(xiàn)階段,乳酸菌類、芽胞桿菌類兩種單菌雖然是目前臨床上應(yīng)用最多的菌株,并取得了一定的成效。但是單一菌株的益生功能畢竟有限,有時(shí)會(huì)暴露出臨床使用效果不太穩(wěn)定的缺陷。因此,應(yīng)根據(jù)動(dòng)物腸道多菌共生的特點(diǎn)和不同菌株之間的協(xié)同關(guān)系,發(fā)揮出菌株之間優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)的“最大公約數(shù)”,開發(fā)出更多功效、更有利于提升動(dòng)物生產(chǎn)性能的復(fù)合益生菌菌株,將是今后益生菌的研究方向。

6 定向改造益生菌的靶向基因

研究表明,致病菌大腸桿菌主要由菌毛基因與腸粘膜受體發(fā)生粘附,通過(guò)系列信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)而致病,并且大腸桿菌菌毛與腸粘膜粘附性很強(qiáng),也是誘發(fā)疾病的主要原因?？莶菅堪麠U菌為“過(guò)路菌”,主要靠“擠位”來(lái)阻止病原菌在腸道中定植,粘附性較差。如果將大腸桿菌菌毛基因重組到粘附性較差的枯草芽胞桿菌中,定向改造益生菌靶向基因,將能大大破解枯草芽胞桿菌粘附性差的難題,進(jìn)而開發(fā)出更多優(yōu)良的益生菌種用于實(shí)際生產(chǎn)中。