黃芪發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)小鼠急性肺損傷的近紅外熒光活體成像研究

劉必旺，趙換，周文靜，路榮榮，曹越

（1.山西中醫(yī)藥大學(xué)傅山學(xué)院，山西 榆次 030619； 2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；3.山西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山西 太原 030024）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是各種直接和間接致傷因素導(dǎo)致的肺泡上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，造成的急性低氧性呼吸功能不全［1］。依據(jù)歐美聯(lián)席會(huì)議的ALI診斷標(biāo)準(zhǔn)，近年來ALI在美國的發(fā)病率每年79/10萬。據(jù)研究，嚴(yán)重感染患者中有25% ～ 50%會(huì)發(fā)生ALI/ARDS（急性呼吸窘迫綜合征）［2］。

黃芪具有補(bǔ)中益氣、益衛(wèi)固表、升陽舉陷等功效，其成分或制劑具有改善肺功能、保護(hù)肺臟的作用，可以降低脂多糖致急性肺損傷（ALI）模型大鼠呼吸頻率、提高PaO2，顯著改善ALI導(dǎo)致的ARDS［3-4］。

黃芪發(fā)酵產(chǎn)物（HF）是通過酵母菌將黃芪發(fā)酵制得。據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，通過發(fā)酵生物轉(zhuǎn)化技術(shù)，可以產(chǎn)生多種酶，使纖維素、半纖維素等構(gòu)成的細(xì)胞壁發(fā)生裂解，促進(jìn)中藥有效成分釋放，甚至產(chǎn)生新的活性物質(zhì)，從而可能改善其生物利用度，提高藥效［5］。含量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，黃芪發(fā)酵產(chǎn)物中黃芪甲苷等化學(xué)成分含量增高［6］，且黃芪中的許多化學(xué)成分有改善肺功能、保護(hù)肺臟的功效［7］。

近紅外熒光活體小動(dòng)物成像研究是近年來應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討炎性的一項(xiàng)新技術(shù)。本研究以脂多糖復(fù)制ALI小鼠模型，觀察HF對(duì)ALI模型小鼠TNF－α、IL－1、IL－6及TLR4表達(dá)的影響，并采用近紅外熒光活體小動(dòng)物成像技術(shù)闡釋其保護(hù)肺組織免受炎性因子損傷的機(jī)制，為其開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)BALB/c小鼠60只，雌雄各半，4周齡，體質(zhì)量（20 ± 2）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（京）2016－0011。實(shí)驗(yàn)單位使用許可證編號(hào)：SYXK（晉）2020－0006。飼養(yǎng)于SPF環(huán)境。本研究經(jīng)過山西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)指導(dǎo)原則。

1.2 藥品

黃芪于2018年8月采自山西省應(yīng)縣南泉鄉(xiāng)麻峪村（北緯N39°20'59.80″，東經(jīng)E113°14'46.46″），經(jīng)應(yīng)縣乾寶黃芪種植專業(yè)合作社專家劉仲秀鑒定為豆科植物蒙古黃芪［Astragalus memeranaceus（Fisch） Bge. var.mongholicus （Bge.） Hsiao］的根，3～4年半野生藥材。分別用干凈的實(shí)驗(yàn)刷子刷掉表面泥土至潔凈，置50～60 ℃真空干燥箱中干燥120 min，取出，粉碎后過4號(hào)篩，備用。舒普深（頭孢哌通舒巴坦鈉，美國輝瑞制藥有限公司，批號(hào)：cr5630）。

1.3 試劑

水合氯醛（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20191010，使用生鹽水溶液配制為濃度10%，于常溫保存）；RDye?800CW 2－DG Optical Probe（C60728－01）（美國LI－COR公司，批號(hào)：C60728－01）；脂多糖（美國Sigma公司，批號(hào)：L2630，使用前量取5 mg脂多糖溶于100 mL生理鹽水中，4 ℃保存）；PBS緩沖液（批號(hào)：03C30C21）、TNF－α（批號(hào)：af7108）、IL－6（批號(hào)：20201119）、IL－1（批號(hào)：20201208）、TLR4檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20210324）、β－actin檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：20210203）（武漢博士德生物工程有限公司）；牛血清白蛋白（BSA，批號(hào)：A8024，華美生物有限責(zé)任公司）；BCA蛋白定量試劑盒（批號(hào)：CW0016s，美國PIERCE公司）。

1.4 儀器

MGC－350 HP人工氣候箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；VORTEX－5漩渦混合器（海門其林貝爾儀器制造有限公司）；YC－D209E超聲波加濕器（北京亞都環(huán)?？萍加邢薰荆籔earl Trilogy近紅外熒光小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)（美國LI－COR公司）；EL204萬分之一電子天平（梅特勒－托利多儀器上海有限公司）；BCD－206STPQ海爾冰箱（青島海爾股份有限公司）；Option R7純水系統(tǒng)（英國ELGA科技有限公司）。

1.5 黃芪發(fā)酵產(chǎn)物及其混懸液的制備

取安琪釀酒高活性干酵母150 g、蛋白胨100 g、麥芽糖300 g，加入5 000 mL 35～38 ℃的0.2%糖水活化30 min，然后加入5 000 g黃芪藥材粉末與15 000 mL 37 ℃的蒸餾水，充分?jǐn)嚢杈鶆颉１ｕr膜封口放置于提前設(shè)定好38 ℃的電熱恒溫培養(yǎng)箱中，經(jīng)液體深層發(fā)酵7 d［8］。將發(fā)酵好的藥材放置在電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中3 h（溫度設(shè)定為120 ℃）烘干，殺菌，研磨，即得黃芪發(fā)酵產(chǎn)物（HF）。采用HPLC－ELSA法測(cè)定發(fā)酵后黃芪甲苷的含量為1.337 mg/g。實(shí)驗(yàn)時(shí)根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需以純水配成相應(yīng)濃度的混懸液。

1.6 分組及給藥

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分成空白對(duì)照組、模型組、舒普深組、HF低劑量組、HF中劑量組和HF高劑量組，每組10只，并標(biāo)記?？瞻讓?duì)照組不造模，蒸餾水灌胃干預(yù)。其余各組造模處理后，根據(jù)既往研究結(jié)果并結(jié)合臨床劑量，模型組蒸餾水灌胃，舒普深組按0.3 g/kg劑量灌胃，HF低、中、高劑量組分別按黃芪生藥量12.5、25、50 g/kg灌胃干預(yù)，連續(xù)4周。

1.7 模型復(fù)制

根據(jù)文獻(xiàn)［9－11］，在實(shí)驗(yàn)第1周和第3周，按標(biāo)記分10次從模型組、舒普深組、HF低劑量組、HF中劑量組和HF高劑量組取不同標(biāo)記的小鼠各1只，放入自制的密閉艙中。在做好實(shí)驗(yàn)者防護(hù)措施的前提下，抽取10 mL的脂多糖溶液進(jìn)行霧化處理，并將低濃度的脂多糖霧化氣體通入密閉艙，30 min后將小鼠從密閉艙中取出，進(jìn)行下一批小鼠的染毒處理，共10批次完成染毒。

1.8 一般狀態(tài)觀察及體質(zhì)量檢測(cè)

每日觀察并記錄小鼠的飲食情況及精神狀態(tài)等一般狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)前及實(shí)驗(yàn)中每周稱量并記錄小鼠體質(zhì)量。

1.9 近紅外熒光小鼠活體成像觀察

將近紅外熒光分子探針I(yè)RDye?800CW 2－DG凍干粉，放入微量迷你離心機(jī)中，離心5 min，用1 mL無菌PBS溶解為濃度0.1 nmol/μL水溶液，避光儲(chǔ)存在4 ℃冰箱。末次灌胃1 h后，通過尾靜脈注射15 nmol的2－DG探針。探針注入24、48、72、96 h后，以10%水合氯醛，按0.04 mL/10 g體質(zhì)量腹腔注射麻醉，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不反抗后，放入近紅外熒光小動(dòng)物成像系統(tǒng)中，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)熒光探針2－DG在小鼠體內(nèi)的代謝與分布，所得的圖像在同一熒光（800 nm）通道下進(jìn)行顯示，并分析其熒光強(qiáng)度［12-13］。

1.10 ELISA法檢測(cè)小鼠血清TNF－α、IL－6、IL－1水平

近紅外熒光活體成像觀察后，3 d內(nèi)，眼球取血，離心血清，使用TNF－α、IL－6、IL－1的酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)試劑盒檢測(cè)血清中TNF－α、IL－6、IL－1的含量。

1.11 Western blot 檢測(cè)肺組織TLR4的表達(dá)

小鼠取血后，取右肺進(jìn)行組織蛋白的提取。配置SDS－PAGE分離膠，制備凝膠，上樣后接通凝膠電泳儀的電源，進(jìn)行電泳及轉(zhuǎn)膜。將PVDF膜封入塑料袋中，加入BSA稀釋的一抗（β－actin，TLR4）。以TBST洗膜，再將PVDF膜封入塑料袋中，加入BSA稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗，常溫?fù)u動(dòng)1～1.5 h，以TBST洗膜。將化學(xué)發(fā)光試劑盒ECL中的兩種試劑混合，在暗室中滴加到膜上，將所有條帶放入普利萊避光片盒中，壓緊蓋子進(jìn)行曝光，KODAK曝光系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。將每個(gè)條帶的相對(duì)強(qiáng)度通過其對(duì)應(yīng)的β－actin進(jìn)行歸一化處理，然后使用圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析。

1.12 肺病理學(xué)觀察

小鼠取血后，取左肺浸入10%中性福爾馬林溶液中固定。至少48 h后，經(jīng)水沖洗固定液，酒精梯度脫水后包埋；3～5 μm切片，60 ℃烤片，采用蘇木素－伊紅（HE）染色；二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明后樹膠封片，對(duì)各實(shí)驗(yàn)組的肺臟進(jìn)行光鏡檢查。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0和Origin 7.5軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One－Way ANOVA）。P＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)一般狀態(tài)和體質(zhì)量的比較

空白對(duì)照組小鼠表現(xiàn)正常，呼吸平穩(wěn)，攝食飲水正常，皮毛光亮，體質(zhì)量逐漸增加。模型組小鼠造模后活動(dòng)減少，呼吸急促，反應(yīng)靈敏度變差，毛發(fā)干燥晦暗。第14、21、28天模型組小鼠體質(zhì)量顯著低于空白對(duì)照組，第21、28天的模型組與空白對(duì)照組比較，小鼠體質(zhì)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。第28天舒普深組、HF中劑量組、HF高劑量組與模型組比較，小鼠體質(zhì)量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。詳見表1。結(jié)果表明，黃芪發(fā)酵產(chǎn)物可以改善脂多糖造模的小鼠體質(zhì)量的減輕情況，起到增加體質(zhì)量的作用。

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠體質(zhì)量比較（ ± s，g）

表1 不同時(shí)間點(diǎn)各組小鼠體質(zhì)量比較（ ± s，g）

注：與空白對(duì)照組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；與模型組比較，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01。

第28天30.6 ± 1.7 24.2 ± 2.8**29.4 ± 2.4##26.2 ± 2.7 26.5 ± 2.5#28.9 ± 2.9##組別空白對(duì)照組模型組舒普深組HF低劑量組HF中劑量組HF高劑量組n 10 10 10 10 10 10第0天20.5 ± 1.4 20.8 ± 1.2 19.9 ± 1.7 20.4 ± 1.4 19.6 ± 1.6 20.1 ± 1.3第7天23.4 ± 1.3 22.5 ± 2.8 22.5 ± 2.8 23.5 ± 2.8 22.5 ± 2.8 23.5 ± 2.8第14天26.7 ± 1.6 23.3 ± 2.3*25.6 ± 2.5#24.3 ± 2.5 24.7 ± 2.6 25.4 ± 2.3第21天28.1 ± 1.6 24.5 ± 2.1**27.9 ± 2.7#25.5 ± 2.5 25.6 ± 2.2 27.4 ± 2.5#

2.2 各組小鼠近紅外熒光小鼠活體成像的比較

尾靜脈注射2－DG熒光探針24 h后，各組可觀察到小鼠體內(nèi)的熒光信號(hào)。注射48 h后，2－DG探針對(duì)炎癥特異性靶向效果良好，達(dá)到濃聚高峰，與空白對(duì)照組比較，模型組熒光成像非常明顯，提示48 h時(shí)段可作為觀察炎癥的最佳成像時(shí)段；各組組間比較，模型組小鼠體內(nèi)的熒光信號(hào)最強(qiáng)。注射72 h后，各組熒光信號(hào)減弱，說明2－DG探針開始逐漸排出體外。模型組小鼠持續(xù)成像96 h，仍可在炎癥部位觀察到熒光信號(hào)。與模型組比較，HF高劑量組小鼠對(duì)2－DG探針在不同時(shí)刻近紅外熒光明顯減弱。48 h時(shí)段近紅外熒光活體成像結(jié)果顯示，與模型組比較，各給藥組熒光信號(hào)都減弱。具體見圖1、圖2。結(jié)果表明，黃芪發(fā)酵產(chǎn)物可以改善脂多糖小鼠炎性反應(yīng)，起到抗炎的作用。

圖1 小鼠活體成像熒光強(qiáng)度折線圖

圖2 近紅外熒光小鼠活體成像48 h時(shí)段觀察圖

2.3 各組小鼠血清炎性因子水平的比較

與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中的TNF－α、IL－1、IL－6升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01，P＜ 0.05）。與模型組比較，HF中劑量組的TNF－α、IL－6的水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；HF高劑量組的TNF－α、IL－1、IL－6的水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01，P＜ 0.05）。見表2。結(jié)果表明，黃芪發(fā)酵產(chǎn)物在一定程度上能夠降低脂多糖誘導(dǎo)的血清炎性因子的水平。

表2 各組小鼠血清促炎細(xì)胞因子水平比較（ ± s， pg/mL）

表2 各組小鼠血清促炎細(xì)胞因子水平比較（ ± s， pg/mL）

注：與空白對(duì)照組比較，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01；與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜ 0.01。

IL－1 21.61 ± 1.29 26.53 ± 3.67*22.23 ± 2.94#26.17 ± 3.41 24.63 ± 3.39 23.19 ± 3.53#組別空白對(duì)照組模型組舒普深組HF低劑量組HF中劑量組HF高劑量組n 10 10 10 10 10 10 TNF－α 108.42 ± 12.16 183.25 ± 33.05**137.43 ± 26.71##171.62 ± 29.90 168.11 ± 26.83#142.68 ± 29.15##IL－6 40.31 ± 1.86 57.59 ± 3.65*43.19 ± 2.08#53.73 ± 4.09 47.39 ± 3.94#45.35 ± 2.03#

2.4 各組小鼠肺病理學(xué)的比較

空白對(duì)照組小鼠肺組織形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清楚，未見明顯病變；模型組肺組織上皮細(xì)胞不完整、管腔狹窄管壁皺縮、基底膜增厚，肺泡間隔增寬充血，可見大量炎性細(xì)胞浸潤；HF各劑量組管腔內(nèi)有滲出物，肺間質(zhì)增厚且有大量炎性細(xì)胞浸潤等不同程度病理性改變，其中HF中劑量組炎性細(xì)胞浸潤及黏液分泌相對(duì)較少。見圖3。結(jié)果表明，黃芪發(fā)酵產(chǎn)物能夠降低脂多糖小鼠的肺組織損傷程度。

圖3 各組小鼠肺組織病理學(xué)變化的比較（HE染色，×200）

2.5 各組小鼠對(duì)TLR4表達(dá)的比較

與空白對(duì)照組比較，模型組TLR4蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01）。與模型組比較，HF高劑量組TLR4表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）。見圖4。結(jié)果表明，黃芪發(fā)酵產(chǎn)物能夠通過TLR4途徑拮抗脂多糖誘發(fā)的炎性反應(yīng)。

圖4 各組小鼠對(duì)TLR4表達(dá)的影響

3 討論

近年來，近紅外熒光成像技術(shù)越來越廣泛地應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室和臨床前研究。該技術(shù)一鍵采集，成像迅速，靈敏度高，具有較強(qiáng)的組織穿透力，更好的信號(hào)強(qiáng)度，能夠?qū)崟r(shí)、無創(chuàng)地完成在體持續(xù)成像監(jiān)測(cè)等工作［12］。熒光探針2－DG是利用GLUT轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入細(xì)胞的葡萄糖類似物，磷酸化后被有效地捕獲在細(xì)胞內(nèi)［13］。許多炎癥的特征是代謝率升高，特別是對(duì)葡萄糖的攝取增強(qiáng)。2－DG作為葡萄糖的替代物，進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體后，可被炎癥組織靶向性攝取，所以可以進(jìn)行近紅外熒光成像系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)估分析的研究［14］。本研究結(jié)果可見，模型組和各給藥組組內(nèi)比較，48 h時(shí)段熒光信號(hào)最佳；組間比較，72、96 h時(shí)段熒光信號(hào)模型組熒光信號(hào)最強(qiáng)，各給藥組不同程度的熒光信號(hào)減弱，說明模型組炎癥最重，黃芪發(fā)酵產(chǎn)物具有一定的抗炎、保護(hù)肺組織的作用。

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，是引起ALI的主要原因之一，脂多糖誘導(dǎo)法是ALI動(dòng)物模型的主要方法之一。TLR4是Toll樣受體（Toll－like receptors，TLRs）之一，TLR4在肺內(nèi)多種細(xì)胞中均有表達(dá)，在肺損傷中起重要作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，黃芪可改善脂多糖所致大鼠ALI，脂多糖通過TLR4系統(tǒng)的信號(hào)通路引起ALI［15］。TLR4系統(tǒng)的信號(hào)通路主要為TLR4與髓樣分化因子（myeloid differentiation factor，MD）形成復(fù)合物，激活酪氨酸蛋白激酶（Src），介導(dǎo)NF－κB亞基的核轉(zhuǎn)位，啟動(dòng)TNF－α、IL－6、IL－1等促炎性因子的合成和釋放，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子（intercellular adhesion molecule，ICAM）表達(dá)，引發(fā)炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)研究了黃芪發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)TLR4、TNF－α、IL－6、IL－1等指標(biāo)的影響，這些指標(biāo)都有所改善，說明黃芪發(fā)酵產(chǎn)物一定程度上可以抑制脂多糖引起ALI。TLR4系統(tǒng)的信號(hào)通路還有其他指標(biāo)，如Src、NF－κB、ICAM－1及其他促炎性因子等。雖然本實(shí)驗(yàn)沒有對(duì)Src、NF－κB、ICAM－1等進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍可以說明黃芪發(fā)酵產(chǎn)物可通過TLR4通路拮抗脂多糖炎性反應(yīng)。見圖5。

圖5 黃芪發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)TLR4通路的影響

黃芪有廣泛的生物活性和良好的保健功能，關(guān)于黃芪的研究也日益受到國際關(guān)注。在美國出版的許多關(guān)于植物食品的書籍中，黃芪是位列第一的中藥材。中藥發(fā)酵技術(shù)可以將現(xiàn)代生物技術(shù)和中醫(yī)藥研究進(jìn)行完美結(jié)合，在中醫(yī)藥研究開發(fā)與利用等方面提供了新的思路。中藥材的發(fā)酵具有2 000多年的歷史，但有關(guān)黃芪的發(fā)酵研究本世紀(jì)初才有所報(bào)道，目前研究還相對(duì)較少。近年來，本研究團(tuán)隊(duì)一直致力于黃芪的發(fā)酵研究，推動(dòng)中藥發(fā)酵技術(shù)的發(fā)展。中藥發(fā)酵比一般的物理、化學(xué)方法炮制中藥更能大幅度地改變藥性，為了解中藥的功效，開發(fā)新藥等提供了新的手段。

本實(shí)驗(yàn)以黃芪發(fā)酵產(chǎn)物為研究對(duì)象，建立急性肺損傷（ALI）小鼠模型，通過觀察小鼠的一般狀態(tài)及體質(zhì)量、ELISA法檢測(cè)小鼠血清TNF－α、IL－6、IL－1水平，Western blot檢測(cè)肺組織TLR4的表達(dá)情況，及近紅外熒光小鼠活體成像觀察和肺病理學(xué)觀察，探討了黃芪發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)ALI的影響。結(jié)果顯示，黃芪發(fā)酵產(chǎn)物可以改善小鼠體質(zhì)量的降低的情況，降低脂多糖誘導(dǎo)的血清TNF－α、IL－1、IL－6炎性因子的水平，降低TLR4的表達(dá)水平，降低脂多糖小鼠的肺組織損傷程度。綜上所述，采用近紅外熒光成像系統(tǒng)初步確定黃芪發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)ALI有較好的保護(hù)作用，通過TLR4通路，保護(hù)肺組織免受炎性因子的損傷，為下一步新藥開發(fā)及臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。