miR-135a和miR-135b表達(dá)水平在子宮內(nèi)膜癌預(yù)后評估中的價值

王秋梅，全培青，劉曉慶，孫姍姍，江燁伶

復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院婦科，上海 200011

子宮內(nèi)膜癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，其發(fā)病率呈逐年升高的趨勢，嚴(yán)重威脅患者的健康和生命。子宮內(nèi)膜癌早期一般沒有明顯癥狀，確診時往往已經(jīng)為中晚期，出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和宮頸浸潤等情況，預(yù)后較差，因此，尋找早期診斷和預(yù)后判斷的指標(biāo)具有重要的臨床意義。微小RNA(miRNA)是非編碼RNA核苷酸片段，與癌基因和抑癌基因的表達(dá)密切相關(guān)，對基因表達(dá)的調(diào)控，如癌細(xì)胞分化、增殖和凋亡具有重要作用，已經(jīng)成為診斷癌癥及預(yù)后判斷的重要指標(biāo)，尤其在預(yù)后判斷方面得到了學(xué)者們的關(guān)注[1]。DONKERS等[2]的研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌與良性子宮內(nèi)膜疾病患者血清miR-135a和miR-135b的表達(dá)存在明顯差異，但是miR-135a和miR-135b是否能夠成為子宮內(nèi)膜癌的預(yù)后判斷指標(biāo)仍不清楚。本研究擬通過檢測子宮內(nèi)膜癌患者血清中的miR-135a和miR-135b表達(dá)水平，觀察二者在子宮內(nèi)膜癌預(yù)后判斷中的臨床價值，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年1月至2019年12月在本院接受子宮內(nèi)膜癌手術(shù)的115例子宮內(nèi)膜癌患者納入子宮內(nèi)膜癌組，年齡45～79歲，平均(62.83±12.63)歲；體質(zhì)量指數(shù)(BMI)為(23.53±2.18)kg/m2；病理類型：子宮內(nèi)膜樣腺癌84例，黏液/漿液性腺癌31例；分化程度：中高分化70例，低分化45例；臨床分期：Ⅰ期21例，Ⅱ期56例，Ⅲ期23例和Ⅳ期15例。納入標(biāo)準(zhǔn)：均符合子宮內(nèi)膜癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)術(shù)后病理檢查證實；首次手術(shù)切除；臨床病歷資料完整；術(shù)前未經(jīng)過放化療、內(nèi)分泌和免疫治療等。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他部位惡性腫瘤；合并其他婦科疾??；合并免疫性疾病；存在智力下降或者精神性疾病。選擇同期在本院體檢健康的45例女性納入對照組，年齡45～79歲，平均(62.19±11.62)歲;BMI為(23.19±2.07)kg/m2。兩組研究對象年齡、BMI比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。所有研究對象均簽署知情同意書，本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 抽取所有研究對象入院或體檢時肘靜脈血5 mL于抗凝管中，以3 000 r/min離心10 min，將上清液放置于—70 ℃的冰箱中保存待測。

1.2.2實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR) 使用 mirVana miRNA 提取試劑盒提取標(biāo)本中的總RNA，并使用 MagMAXTMmirVanaTMTotal RNA 分離試劑盒 (Thermo Fisher Scientific) 從血清中提取 RNA。根據(jù)說明書，使用 All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR 檢測系統(tǒng)(GeneCopoeia,Rockville,MD,USA)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR和qRT-PCR，以確定 miR-135a 和miR-135b的表達(dá)水平。基于 miR-135b 的退火溫度，采用 3 步法進(jìn)行 qRT-PCR 檢測 miRNA 表達(dá)。初始變性設(shè)定為 95 ℃，持續(xù)10 min，1個循環(huán)。變性步驟設(shè)置為95 ℃ 10 s，退火步驟設(shè)置為55 ℃ 20 s，延伸步驟設(shè)置為72 ℃ 15 s，共40個循環(huán)。 U6作為內(nèi)部對照，miRNA的相對表達(dá)水平采用2—ΔΔCt法計算。引物序列：U6正向引物為5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物為5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′；miR-135a正向引物為5′-AACCCTGCTCGCAGTATTTGAG-3′，反向引物為5′-GCGGCAGTATGGCTTTTTATTCC-3′；miR-135b正向引物為5′-GGGGTACCTCCTCTTCTTCACAATTTCTCTCAGTG-3′，反向引物為5′-GAAGATCTCAGTCACCTTTGAGGTCTGAG-CT-3′。

1.2.3隨訪 患者出院后，每兩個月到醫(yī)院門診隨訪1次，對于不能到醫(yī)院就診的患者，有專人進(jìn)行電話隨訪，并記錄患者死亡、腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移情況。復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移參照《子宮內(nèi)膜癌診斷與治療指南(2021年版)》[3]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)B超、CT和MRI進(jìn)行盆腔腫塊的檢查，必要時進(jìn)行腫塊活組織檢查。隨訪兩年，出現(xiàn)死亡、腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移判斷為預(yù)后不良，無上述情況判斷為預(yù)后良好。

1.2.4觀察指標(biāo) 比較子宮內(nèi)膜癌組和對照組血清miR-135a和miR-135b表達(dá)水平；比較子宮內(nèi)膜癌患者治療前后血清miR-135a和miR-135b表達(dá)水平；比較不同臨床特征和不同預(yù)后情況子宮內(nèi)膜癌患者血清miR-135a和miR-135b表達(dá)水平；分析血清miR-135a和miR-135b表達(dá)水平預(yù)測兩年內(nèi)子宮內(nèi)膜癌患者出現(xiàn)預(yù)后不良的價值。分析子宮內(nèi)膜癌患者血清miR-135a與miR-135b表達(dá)水平的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1兩組血清miR-135a和miR-135b表達(dá)水平比較 入院時，子宮內(nèi)膜癌組血清miR-135a表達(dá)水平明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=10.734，P<0.001)；子宮內(nèi)膜癌組術(shù)后7 d血清miR-135a表達(dá)水平較入院時明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=13.930，P<0.001)。 入院時，子宮內(nèi)膜癌組血清miR-135b表達(dá)水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=18.601，P<0.001)；子宮內(nèi)膜癌組術(shù)后7 d血清miR-135b表達(dá)水平較入院時明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=13.475，P<0.001)。見表1。

表1 兩組血清miR-135a和miR-135b表達(dá)水平比較

2.2不同特征子宮內(nèi)膜癌患者血清miR-135a和miR-135b表達(dá)水平比較 低分化、Ⅲ～Ⅳ期和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移子宮內(nèi)膜癌患者的血清miR-135a表達(dá)水平明顯低于中高分化、Ⅰ～Ⅱ期和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移子宮內(nèi)膜癌患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而低分化、Ⅲ～Ⅳ期和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌患者血清miR-135b表達(dá)水平明顯高于中高分化、Ⅰ～Ⅱ期和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。不同年齡、病理類型、腫瘤最大徑和肌層浸潤情況子宮內(nèi)膜癌患者血清miR-135a和miR-135b表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.3不同預(yù)后情況子宮內(nèi)膜癌患者血清miR-135a和miR-135b表達(dá)水平比較 隨訪2年，出現(xiàn)死亡6例，復(fù)發(fā)11例和轉(zhuǎn)移9例，為預(yù)后不良，其余89例患者為預(yù)后良好。預(yù)后不良子宮內(nèi)膜癌患者血清miR-135a表達(dá)水平明顯低于預(yù)后良好子宮內(nèi)膜癌患者，而預(yù)后不良子宮內(nèi)膜癌患者血清miR-135b表達(dá)水平明顯高于預(yù)后良好子宮內(nèi)膜癌患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

2.4血清miR-135a和miR-135b表達(dá)水平對子宮內(nèi)膜癌預(yù)后不良的預(yù)測效能 血清miR-135a和miR-135b表達(dá)水平預(yù)測子宮內(nèi)膜癌患者發(fā)生預(yù)后不良的曲線下面積(AUC)分別為0.830、0.856，二者AUC差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。根據(jù)子宮內(nèi)膜癌患者是否發(fā)生預(yù)后不良將兩指標(biāo)進(jìn)行Logistic回歸分析，得到方程Y=—1.87XmiR-135a+1.99XmiR-135b—2.42作為聯(lián)合檢測指標(biāo)，聯(lián)合檢測預(yù)測預(yù)后不良的靈敏度為92.3%，特異度為83.1%，AUC為0.932，聯(lián)合檢測預(yù)測子宮內(nèi)膜癌患者發(fā)生預(yù)后不良的AUC明顯大于miR-135a和miR-135b單獨檢測(Z=2.391、2.247，P<0.05)。見圖1和表4。

表2 不同特征子宮內(nèi)膜癌患者血清miR-135a和miR-135b表達(dá)水平比較

續(xù)表2 不同特征子宮內(nèi)膜癌患者血清miR-135a和miR-135b表達(dá)水平比較

表3 不同預(yù)后情況子宮內(nèi)膜癌患者血清miR-135a和miR-135b表達(dá)水平比較

圖1 血清miR-135a和miR-135b表達(dá)水平預(yù)測子宮內(nèi)膜癌預(yù)后不良的ROC曲線

2.5子宮內(nèi)膜癌患者血清miR-135a與miR-135b表達(dá)水平的相關(guān)分析 子宮內(nèi)膜癌患者血清miR-135a表達(dá)水平與miR-135b表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=—0.721，P<0.01)。

表4 血清miR-135a和miR-135b表達(dá)水平對子宮內(nèi)膜癌預(yù)后不良的預(yù)測效能

3 討 論

子宮內(nèi)膜癌以手術(shù)切除為主要治療方式，但手術(shù)效果并不理想。因此，尋找對病程和預(yù)后具有監(jiān)測作用的靶標(biāo)尤其重要。miRNA是一種非編碼RNA，具有高度的保守性，對基因具有明顯的調(diào)控作用，參與了細(xì)胞增殖、代謝、分化和凋亡等病理、生理調(diào)控過程，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有密切關(guān)系。近年來研究顯示，血清中存在多種miRNA，并且性質(zhì)極為穩(wěn)定，對酸堿等環(huán)境耐受性較好，不易被內(nèi)源性或者外源性的核苷酸酶降解，并且具有嚴(yán)格的組織特異性和時序特異性[4]。但在病理狀態(tài)下，miRNA會出現(xiàn)異常表達(dá)，并且在腫瘤的診斷和預(yù)后評估中越來越受到重視。在子宮內(nèi)膜癌的研究中，同樣發(fā)現(xiàn)大量異常表達(dá)的miRNA參與了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展，對其診斷和預(yù)后的判斷具有重要的意義。

miR-135家族包括miR-135a和miR-135b兩個成員，在各種癌癥中出現(xiàn)異常表達(dá)。 miRNA可以作為癌基因或腫瘤抑制因子，多項研究表明miR-135a在癌癥進(jìn)展中起著重要作用，既有促進(jìn)癌細(xì)胞增殖，也有抑制癌細(xì)胞增殖的報道[5-6]。miR-135a還可以通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化影響患者的預(yù)后。本研究結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜癌患者血清miR-135a表達(dá)水平明顯低于對照者，并且發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌患者術(shù)后血清miR-135a表達(dá)水平明顯升高，說明miR-135a可能與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病具有一定的聯(lián)系。本研究結(jié)果顯示低分化、Ⅲ～Ⅳ期和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌患者血清miR-135a表達(dá)水平明顯低于中高分化、Ⅰ～Ⅱ期和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者(P<0.05)，說明miR-135a 在預(yù)測預(yù)后方面也具有潛在的應(yīng)用價值。進(jìn)一步研究顯示，預(yù)后不良子宮內(nèi)膜癌患者血清miR-135a表達(dá)水平明顯低于預(yù)后良好子宮內(nèi)膜癌患者(P<0.05)，說明血清miR-135a表達(dá)水平降低可能導(dǎo)致了子宮內(nèi)膜癌患者的不良預(yù)后。有關(guān)miR-135a表達(dá)水平在卵巢癌中表達(dá)情況的研究發(fā)現(xiàn)，血清miR-135a高表達(dá)的卵巢癌患者預(yù)后良好，而miR-135a低表達(dá)與卵巢癌患者的較低的生存率和無進(jìn)展生存期縮短有關(guān)[7-8]。對非小細(xì)胞肺癌的研究發(fā)現(xiàn)，血清miR-135a表達(dá)水平與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、病理分期關(guān)系密切，miR-135a低表達(dá)的患者生存期明顯短于miR-135a高表達(dá)的患者，miR-135a表達(dá)水平降低是非小細(xì)胞肺癌預(yù)后不良的獨立危險因素[9]。對經(jīng)典霍奇金淋巴瘤的研究發(fā)現(xiàn)，miR-135a低表達(dá)的患者復(fù)發(fā)率更高，無病生存期更短[10]。對肝細(xì)胞癌的研究發(fā)現(xiàn)，miR-135a的高表達(dá)與肝癌切除后12個月內(nèi)復(fù)發(fā)的高風(fēng)險相關(guān)[11]。另一項研究發(fā)現(xiàn)，胃癌腫瘤組織中miR-135a的高表達(dá)與較短的生存期和較短的復(fù)發(fā)時間有關(guān)[12]。本研究結(jié)果顯示，血清miR-135a表達(dá)水平為2.73時，其預(yù)測子宮內(nèi)膜癌預(yù)后不良的靈敏度為88.5%，特異度為75.3%，AUC為0.830，說明血清miR-135a表達(dá)水平在預(yù)測子宮內(nèi)膜癌患者兩年內(nèi)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和死亡方面具有較高的價值。

miR-135b位于1號染色體上，定位在1q32.1，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，但在不同腫瘤組織中，其功能不盡相同。如在前列腺癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，miR-135b可作為腫瘤抑制因子[13-14]。然而，在乳腺癌、肝細(xì)胞癌和結(jié)直腸癌等癌癥中，miR-135b是一種腫瘤促進(jìn)因子，可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和遷移[15-17]。本研究結(jié)果顯示，入院時，子宮內(nèi)膜癌組血清miR-135b表達(dá)水平明顯高于對照組，并且發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌組術(shù)后7 d血清miR-135b表達(dá)水平較術(shù)前明顯降低，說明miR-135b在子宮內(nèi)膜癌中作為促癌基因存在，與文獻(xiàn)[18]報道的結(jié)果一致。本研究結(jié)果還顯示，低分化、Ⅲ～Ⅳ期和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜癌患者血清miR-135b表達(dá)水平明顯高于中高分化、Ⅰ～Ⅱ期和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，并且預(yù)后不良患者血清miR-135b表達(dá)水平明顯高于預(yù)后良好患者，說明血清miR-135b表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜癌的預(yù)后關(guān)系密切。一項關(guān)于脂肪肉瘤的研究發(fā)現(xiàn)，miR-135b高表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)[19]。另一項研究表明miR-135b-5p過表達(dá)是胰腺導(dǎo)管腺癌預(yù)后不良的獨立預(yù)測因子，具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移的作用，與腫瘤預(yù)后不良有關(guān)[20]。本研究結(jié)果顯示，血清miR-135b表達(dá)水平為3.21時，其預(yù)測子宮內(nèi)膜癌患者術(shù)后預(yù)后不良的靈敏度為73.1%，特異度為84.3%，AUC為0.856，具有較高的預(yù)測效能。同時本研究顯示血清miR-135a與miR-135b聯(lián)合檢測對子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后不良的AUC明顯大于miR-135a和miR-135b單獨檢測，說明兩項指標(biāo)具有互補(bǔ)性。另外，相關(guān)性分析結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜癌患者血清miR-135a與miR-135b表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，進(jìn)一步說明了二者在子宮內(nèi)膜癌中具有一定的聯(lián)系，miR-135a有抑癌作用，而miR-135b有促癌作用，二者處于某種平衡，其具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，miR-135a和miR-135b可能參與了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生及發(fā)展過程，是子宮內(nèi)膜癌預(yù)后的潛在預(yù)測指標(biāo)。