痰涂片熒光染色法在老年患者呼吸道真菌感染中的應(yīng)用

王艷平，鄭 鵬，田 敏，石雪艷，王靜波

航天中心醫(yī)院血液科，北京 100049

近年來，中國老齡化問題日益突出，隨著各類抗菌藥物、免疫抑制劑、激素及抗腫瘤藥物的廣泛應(yīng)用，老年患者呼吸道真菌感染的發(fā)病率上升，已成為臨床值得重視的問題，因此，快速檢測出病原菌，為臨床及時提供治療依據(jù)尤為重要。目前，實驗室檢測真菌的方法主要有直接鏡檢法、血清學(xué)實驗、培養(yǎng)法、組織病理學(xué)檢查等。真菌培養(yǎng)法一直被視為診斷真菌感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但真菌培養(yǎng)法所需時間長，臨床醫(yī)生不能及時獲取患者真菌感染的依據(jù)。近來又出現(xiàn)了真菌免疫熒光技術(shù)，又稱為痰涂片熒光染色法，此方法簡便快速，但在臨床實驗室并未推廣，尤其是在呼吸道真菌感染中的應(yīng)用甚少[1]。本研究通過對疑似呼吸道真菌感染的老年患者的痰涂片革蘭染色法、痰涂片熒光染色法與真菌培養(yǎng)法檢測結(jié)果進(jìn)行比較，探討痰涂片熒光染色法在老年患者呼吸道真菌感染中的應(yīng)用價值，為臨床快速、準(zhǔn)確地獲得真菌檢測結(jié)果提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2021年1-12月擬診為肺部真菌感染的479例老年患者為研究對象，其中男298例，女181例；年齡65～103歲，平均(81.5±9.4)歲。

1.2方法

1.2.1痰液標(biāo)本留取 患者清潔口腔后采集清晨深咳痰于無菌痰盒內(nèi)，2 h內(nèi)送檢。

1.2.2痰液標(biāo)本合格標(biāo)準(zhǔn) 痰液直接鏡檢，要求白細(xì)胞計數(shù)在每個低倍視野中≥25個，上皮細(xì)胞在每個低倍視野中≤10個，不合格標(biāo)本重新采集并送檢。

1.2.3痰涂片革蘭染色法 混勻痰液標(biāo)本，涂片，干燥后火焰固定，采用革蘭染液染色后鏡檢，看到形態(tài)典型的藍(lán)黑色孢子、菌絲或假菌絲記錄為陽性。

1.2.4痰涂片熒光染色法 混勻痰液標(biāo)本，涂片，自然干燥后加一滴熒光染色液(諾立清，免疫顯色試劑)，加蓋玻片，輕輕按壓，用濾紙把多余的染色液吸凈，染色時間1～2 min，使用熒光顯微鏡(型號DM500)觀察結(jié)果，看到熒光標(biāo)記的孢子或菌絲即判斷為陽性。

1.2.5真菌培養(yǎng)法 采用常規(guī)方法將混勻的痰液標(biāo)本接種在沙保羅培養(yǎng)基上，35 ℃培養(yǎng)1周，菌株的初次分離采用科瑪嘉顯色培養(yǎng)基和YST酵母菌鑒定卡進(jìn)行常規(guī)鑒定，所有菌株采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)儀復(fù)核鑒定，結(jié)果不一致的菌株采用核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列分析的方法進(jìn)行菌種鑒定。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株為念珠菌ATCC8735。

1.3觀察指標(biāo) 比較痰涂片革蘭染色法、 痰涂片熒光染色法和真菌培養(yǎng)法檢測結(jié)果及鏡下形態(tài)，并以真菌培養(yǎng)法為參考標(biāo)準(zhǔn)，比較痰涂片革蘭染色法、痰涂片熒光染色法兩種方法的靈敏度、特異度、總符合率、陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值。靈敏度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%；特異度=真陰性例數(shù)/(假陽性例數(shù)+真陰性例數(shù))×100%；陰性預(yù)測值=真陰性例數(shù)/(假陰性例數(shù)+真陰性例數(shù))×100%；陽性預(yù)測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%；符合率=(真陰性例數(shù)+真陽性例數(shù))/總例數(shù)×100%。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.13種方法的真菌檢測結(jié)果比較 痰涂片革蘭染色法、 痰涂片熒光染色法和真菌培養(yǎng)法檢出率分別為13.6%、36.5%和34.2%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=75.828，P<0.001)；痰涂片熒光染色法真菌檢出率略高于真菌培養(yǎng)法，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.552，P=0.457)； 痰涂片熒光染色法真菌檢出率高于痰涂片革蘭染色法，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=67.269，P<0.001)。痰涂片革蘭染色法真菌檢出率低于真菌培養(yǎng)法，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=56.244，P<0.001)。見表1。

表1 3種方法的真菌檢測結(jié)果比較(n=479)

2.2痰涂片熒光染色法與痰涂片革蘭染色法對真菌感染的診斷效能比較 以真菌培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)，痰涂片熒光染色法、痰涂片革蘭染色法分別與真菌培養(yǎng)法結(jié)果比較見表2、3。痰涂片熒光染色法的靈敏度明顯高于痰涂片革蘭染色法,而特異度卻略低于痰涂片革蘭染色法，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；痰涂片熒光染色法的約登指數(shù)、總符合率、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值明顯高于痰涂片革蘭染色法，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表2 痰涂片熒光染色法與真菌培養(yǎng)法結(jié)果比較(n)

表3 痰涂片革蘭染色法與真菌培養(yǎng)法結(jié)果比較(n)

表4 痰涂片熒光染色法與痰涂片革蘭染色法診斷效能比較

2.3真菌培養(yǎng)結(jié)果 479例患者的痰液標(biāo)本真菌培養(yǎng)共檢出164株真菌，分別是白色念珠菌107株(65.2%)，光滑念珠菌19株(11.6%)，熱帶念珠菌15株(9.1%)，曲霉菌11株(6.7%)，耳念珠菌5株(3.0%)，葡萄牙念珠菌3株(1.8%)，克柔念珠菌、特納里夫念珠菌、星狀絲孢酵母、毛霉各1株，共4株(2.4%)。

2.4痰涂片革蘭染色法和痰涂片熒光染色法鏡下形態(tài) 痰涂片革蘭染色背景呈紫紅色或粉紅色，菌絲孢子被染成藍(lán)黑色，低倍鏡(×10)下背景雜亂，孢子菌絲形態(tài)與痰液標(biāo)本中脂滴、細(xì)胞碎片、植物纖維雜質(zhì)的形態(tài)不好區(qū)分(圖a1)，疑似的菌絲孢子形態(tài)需在油鏡下確認(rèn)，油鏡下可見菌絲孢子形態(tài)(圖a2)。痰涂片熒光染色法中的菌絲孢子在熒光顯微鏡下發(fā)出明亮的藍(lán)色熒光，背景黑色，真菌形態(tài)清晰可見(圖b1～b4)，低倍鏡(×10)下即可大致確認(rèn)陰、陽性，特異性非常強(qiáng)(圖b1、b3),高倍鏡(×40)下觀察菌絲孢子形態(tài)(圖b2、b4)，根據(jù)孢子和菌絲的形態(tài)、大小和排列等特征可初步判斷真菌種屬，例如念珠菌具有酵母樣孢子和藕節(jié)樣假菌絲(圖b2)；曲霉菌有有隔菌絲，約45度角分枝，呈鹿角樣(圖b4)。

注：a1、a2為革蘭染色菌絲孢子；b1～b4為熒光染色菌絲孢子；b1、b2為念珠菌；b3、b4為曲霉菌；a1、b1、b3為低倍鏡(×10),b2、b4為高倍鏡(×40),a2為油鏡(×100)。

3 討 論

老年患者常伴有嚴(yán)重的基礎(chǔ)疾病、免疫力低下，長期使用抗菌藥物、激素及免疫抑制劑導(dǎo)致身體免疫功能低下，菌群失調(diào)，容易繼發(fā)真菌感染，感染部位以呼吸道占首位?；颊咧灰嬖谝赘幸蛩囟紤?yīng)進(jìn)行真菌的反復(fù)檢測，如有真菌感染史應(yīng)定期跟蹤監(jiān)測，以便及時診斷和治療。由于病原學(xué)檢查可以為臨床診治提供有力依據(jù)，建議將真菌檢測列為常規(guī)項目[2]。本研究中痰液標(biāo)本真菌檢出率為34.2%(真菌培養(yǎng)法)，表明真菌感染率較高，早期快速、準(zhǔn)確檢出真菌是治療的關(guān)鍵。應(yīng)用痰涂片革蘭染色法、痰涂片熒光染色法分別對479份痰涂片檢測真菌，并以真菌培養(yǎng)法為標(biāo)準(zhǔn)，對檢測結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果顯示痰涂片熒光染色法真菌檢出率略高于真菌培養(yǎng)法，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.457)。痰涂片革蘭染色法真菌檢出率明顯低于真菌培養(yǎng)法和痰涂片熒光染色法，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。以上結(jié)果表明痰涂片熒光染色法較痰涂片革蘭染色法的檢出率更高，可以減少漏診，痰涂片熒光染色法檢出率與真菌培養(yǎng)法接近，有利于患者及早診斷和治療。

以往痰涂片革蘭染色法以其操作簡單、觀察方便等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于實驗室，但其檢出率明顯低于真菌培養(yǎng)法[3]，痰涂片革蘭染色法常規(guī)用于痰培養(yǎng)前的鏡檢，一方面，痰涂片保證了痰液標(biāo)本的質(zhì)量，能提高痰培養(yǎng)的陽性率；另一方面，合格痰液標(biāo)本的細(xì)菌革蘭染色涂片信息可預(yù)測培養(yǎng)結(jié)果[4]，本研究同樣也驗證了上述觀點(diǎn)，痰涂片革蘭染色法檢出率明顯低于真菌培養(yǎng)法，但有助于選定合格的標(biāo)本。痰涂片革蘭染色法真菌檢出率非常低，筆者總結(jié)主要有以下幾方面原因：(1)痰涂片太厚，真菌孢子菌絲混雜在標(biāo)本內(nèi)部，染色不明顯，無法辨認(rèn)；(2)實驗室所用染色儀器的影響，導(dǎo)致染色太淺或太深均不利于鏡下觀察；(3)低倍鏡下孢子菌絲的形態(tài)不明顯，易與植物纖維、細(xì)胞碎片混淆，油鏡觀察很難做到整片瀏覽；(4)檢測人員鏡下觀察能力不足。

近些年來，痰涂片熒光染色法逐步在國內(nèi)被推廣，因其具有較高的靈敏度和特異度，越來越受到臨床實驗室的青睞。痰涂片熒光染色法所使用的免疫顯色試劑主要功能成分包括β-D-葡聚糖結(jié)合蛋白和熒光素，能特異性地結(jié)合真菌細(xì)胞壁β-D-葡聚糖和幾丁質(zhì)多糖，使真菌細(xì)胞壁被雙重標(biāo)記，在熒光顯微鏡紫外光(波長340～380 nm) 或者藍(lán)紫光(波長420～490 nm)特定的激發(fā)光波段下，菌絲或者孢子發(fā)出明亮的藍(lán)色熒光，在黑色背景下結(jié)構(gòu)清晰、易于分辨，提高真菌的檢出率，而且實驗過程非常簡單，只需滴加一滴試劑，等待1～2 min即可鏡檢。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)學(xué)者大多將痰涂片熒光染色法用于淺部真菌的檢測，標(biāo)本類型主要為皮屑、甲屑、毛發(fā)、皮膚病理組織等，研究結(jié)果均顯示痰涂片熒光染色法是一種靈敏度高、快捷、可靠的真菌檢測方法，陽性檢出率高于常規(guī)鏡檢法[5-11]。劉鴻宇等[12]提出，痰涂片熒光染色法與痰涂片革蘭染色法相比，具有更高的靈敏度、特異度和準(zhǔn)確度，可減少假陰性發(fā)生，降低對真菌的漏檢率，值得臨床推廣應(yīng)用。本研究采用3種不同的真菌檢測方法檢測老年患者痰液標(biāo)本，研究結(jié)果與上述文獻(xiàn)一致。痰涂片熒光染色法雖然過程簡便、快捷，具有較高的靈敏度和特異度，但熒光染色后除了真菌外，細(xì)支氣管上的彈性纖維、外源性植物纖維、脂肪滴、寄生蟲也可以發(fā)出亮藍(lán)色的熒光，需結(jié)合形態(tài)區(qū)分[13]。在熒光鏡檢實際工作中，筆者總結(jié)出一些需要注意的地方，如痰液標(biāo)本一定要混勻，挑取黏性或含血絲部位，均勻涂抹在玻片上，切勿蘸取唾液或涂得太厚，以免造成假陰性結(jié)果；壓片后一定要用濾紙按壓蓋玻片吸去多余的染色劑，這樣避免痰液標(biāo)本懸浮流動，可使鏡下觀察更清晰，同時也可避免液體溢出造成污染；染色后盡快讀片，以免試劑干涸熒光淬滅影響觀察；玻片上會有少量纖維雜質(zhì)，同樣也會發(fā)出熒光，但沒有典型的橫隔和出芽結(jié)構(gòu)，形態(tài)一般不規(guī)則，大小亮度與真菌有很大差異，一定要注意區(qū)分，避免出現(xiàn)假陽性結(jié)果；試劑常溫保存，避免高、低溫環(huán)境及陽光直射影響試劑效果。

痰涂片熒光染色法的特異度和靈敏度均較高，不乏導(dǎo)致定植真菌的檢出，因此可能導(dǎo)致檢出率高于真菌培養(yǎng)法。在臨床工作中，老年住院患者的念珠菌病發(fā)病率較高，這明顯與口腔真菌的高定植率有關(guān)，中老年住院患者口腔真菌定植檢出率最高的是白色念珠菌，占95．5%[14]。伍海英[15]在1 020份呼吸道標(biāo)本中共檢測出真菌271株，主要為白色念珠菌，占檢測出的病原菌總株數(shù)的76．0%，與本院培養(yǎng)法檢出的白色念珠菌的比例65.3%接近。本研究中的研究對象均為65歲以上的老年人，主要癥狀以咳嗽、咳痰為主，基礎(chǔ)疾病較多，大部分長期使用抗菌藥物治療，很容易發(fā)生菌群失調(diào)，導(dǎo)致機(jī)體免疫功能低下，念珠菌可在局部大量生長繁殖，由酵母相轉(zhuǎn)為菌絲相，毒力增強(qiáng)，導(dǎo)致感染，甚至導(dǎo)致播散性念珠菌病，因此，定植性的真菌檢出也很重要，應(yīng)根據(jù)臨床病情，結(jié)合其他檢測結(jié)果綜合診斷。

綜上所述，通過3種真菌檢測方法結(jié)果的比較，發(fā)現(xiàn)痰涂片熒光染色法能夠快速、準(zhǔn)確地判斷真菌，提高了真菌檢出率，在老年患者呼吸道真菌感染的診斷中具有重要的價值，有利于患者及早診斷和治療，值得實驗室推廣應(yīng)用。