循環(huán)腫瘤細胞在早期肺癌診斷及預后的研究進展*

龔 臣 綜述,閆 萍 審校

廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院老年病學呼吸內科,廣西南寧 530021

肺癌是男性最常見的癌癥,女性肺癌發(fā)病率僅次于乳腺癌,乳腺癌每年估計有230萬新病例(11.7%),其次是肺癌(11.4%)、結直腸癌(10.0%)、前列腺癌(7.3%)和胃癌(5.6%)。肺癌是包括中國在內的許多國家的腫瘤死亡首要原因,每年估計有180萬人死亡(18%)[1]。肺癌可分為兩個主要的細胞學亞群:小細胞肺癌(SCLC)占20%,非小細胞肺癌(NSCLC)占80%。NSCLC進一步細分為腺癌、鱗狀細胞癌和大細胞癌。由于約70%的肺癌患者確診時已是晚期,不能行手術治療,化療、放療和靶向治療是最常見的治療選擇,但5年生存率較低。對于少數(shù)早期NSCLC患者,手術治療是最常見的治療選擇,然而仍有腫瘤復發(fā)轉移,總體存活率仍然很低。

診斷肺癌的階段對預后有重大影響。然而,肺癌的及時檢測較為困難,因為患者在早期通常沒有癥狀。低劑量計算機斷層掃描(LDCT)是目前最廣泛推薦的肺癌篩查方法,但它會帶來輻射風險,并且單一的LDCT檢查,在臨床實踐中,區(qū)分孤立性肺結節(jié)良惡性仍然是一個挑戰(zhàn)。早期腫瘤已經出現(xiàn)潛在轉移是導致較低存活率的一個重要因素,且選擇性治療往往基于單個腫瘤活組織表型和分子檢查,這可能低估了腫瘤異質性,而沒有考慮腫瘤進化和治療抵抗的能力[2]。肺癌的監(jiān)測對治療的成功至關重要,然而復發(fā)的活組織檢查通常較困難。因此,能夠識別早期出現(xiàn)的治療耐藥性并發(fā)現(xiàn)新的驅動突變的微創(chuàng)方法對于優(yōu)化肺癌治療至關重要。這種微創(chuàng)方法被統(tǒng)稱為“液體活檢”,它利用的是腫瘤可以將細胞和分子成分轉移到血液中,在那里它們可以被識別為循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)和循環(huán)游離核酸(cfNAs)。盡管在肺癌中,cfNAs的檢測已經取得了相當大的進展,尤其是循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)的檢測,CTCs是循環(huán)系統(tǒng)外滲的腫瘤,是轉移的前體,因此,它們是包括微轉移在內的癌癥監(jiān)測的理想目標[3-4]。CTCs仍然是研究腫瘤生物學的重要手段,因為它們可以用于建立體內和體外模型,用于測試新藥或藥物組合,并識別可能的耐藥機制[5]。

CTCs的分子和遺傳特性研究是一個相對較新的領域,在這一過程中逐漸向臨床轉化。肺癌若在早期發(fā)現(xiàn)并干預,將直接影響患者的預后,本篇綜述將著重介紹CTCs在指導肺癌早期篩查、治療預后評估、隨訪過程中的應用。

1 CTCs作為早期肺癌檢測的生物標志物

由于原發(fā)腫瘤在其整個發(fā)展過程中,甚至在腫瘤發(fā)展的早期階段CTCs就能游離出原發(fā)組織[6],因此,檢測CTCs可能為早期癌癥檢測提供一種靈敏的方法。早期發(fā)現(xiàn)對肺癌患者尤其有益,因為肺癌患者大部分確診時已是晚期,治療局限,且效果差。有研究表明,在168例慢性阻塞性肺疾病患者中,有5例患者檢測到CTCs,預測到隨訪后的1～4年內會出現(xiàn)肺小結節(jié)[7]。最近,一項研究評估了CTCs的存在,以區(qū)分良惡性肺部病變[8]。惡性病變患者中有90%檢測到CTCs,良性病變患者中有5%檢測到CTCs。HASHIMOTO等[9]也發(fā)現(xiàn),給予Ⅰ期的NSCLC 患者術前進行CTCs檢測,發(fā)現(xiàn)17例患者檢測到CTCs,其中2例病理結果證實為肺內轉移灶,對另外15例患者進行長期隨訪發(fā)現(xiàn),術前CTCs陽性與術后復發(fā)相關。

血液中的CTCs可作為有效篩查和診斷的標志物,以區(qū)分小的惡性肺結節(jié)和良性病變。有學者對直徑小于30 mm的肺結節(jié)患者進行研究,分析CTCs、CT檢查特征、血清腫瘤標志物濃度及組織病理學特征,發(fā)現(xiàn)良惡性肺結節(jié)患者的CTCs有明顯差異,聯(lián)合使用CTCs和CT確定的結節(jié)密度特征進一步提高了惡性肺結節(jié)的診斷效果,以及TNM分期的確定[10]。循環(huán)基因異常細胞(CACs)也可以用來鑒別肺癌和良性肺部病變。使用LDCT進行肺癌篩查在肺結節(jié)≤10 mm的患者中特異度較低,國內一項多中心前瞻性研究表明,當CACs的最佳臨界值為2時,肺癌的靈敏度和特異度分別為70.5%和86.4%。提示CACs對肺結節(jié)≤10 mm有較好的肺癌診斷價值[11]。

MANJUNATH等[12]研究發(fā)現(xiàn),在所有NSCLC 患者中檢測到CTCs。在腫瘤診斷方面,目前腫瘤早期篩查主要依靠血清腫瘤標志物和CT檢查;傳統(tǒng)檢測需要病灶形態(tài)提示高度惡性才考慮切除。CTCs從原發(fā)性或轉移性腫瘤脫落后在外周血中循環(huán),因此檢測不依賴于腫瘤負荷,從而使CTCs具有更高的靈敏度和特異度。CTCs在原發(fā)性肺癌診斷中的陽性檢出率高于血清腫瘤生物標志物。CTCs是疾病狀態(tài)的可靠指標,可作為診斷NSCLC有利的生物學標志物。使用新的配體靶向PCR檢測技術,研究了CTCs區(qū)分NSCLC與肺部良性疾病的診斷價值,檢測到的CTCs的分子表型可用于區(qū)分腫瘤類型。葉酸受體陽性CTCs在肺癌診斷中顯示出較高的診斷效力[13]。葉酸受體陽性CTCs與其他腫瘤生物標志物的組合可以明顯提高區(qū)分肺癌和肺部良性疾病的診斷效能[14]。

因此,液體活檢作為一種非侵入性檢測方式,操作簡單。CTCs可能是肺癌早期檢測的有效標志物,通過檢測CTCs來早期診斷癌癥十分必要。然而,早期肺癌檢測由于所涉及的CTCs數(shù)量較少,且可能有較高的假陰性,因此,在早期肺癌檢測中使用CTCs的可行性需要一個大型的、多中心的試驗。

2 CTCs作為預后生物標志物

CTCs在臨床上作為預后標志物的應用前景廣闊。液體活檢作為監(jiān)測腫瘤遺傳學和腫瘤動力學的新方法引起了腫瘤學的極大興趣,被證明是檢測與腫瘤復發(fā)明顯相關的微小殘留病的重要工具。使用液體活檢檢測外周血中的腫瘤成分,如血漿中的CTCs和ctDNA,已被證明是監(jiān)測實時腫瘤基因組變化的微創(chuàng)工具[15]和對治療的反應,以及調查耐藥性和評估可手術早期癌癥的腫瘤復發(fā)風險,最終將液體活檢整合到臨床工作流程中[16]。美國食品藥品監(jiān)督管理局已經批準了幾種單基因檢測和多基因檢測,以檢測漿細胞游離DNA的遺傳改變,用于與特定分子靶向癌癥治療相匹配的伴隨診斷[17]。這些批準標志著液體活檢在臨床上廣泛應用的一個轉折點。

癌癥驅動基因突變狀態(tài)和表達特征等分子改變與早期肺癌預后有關。TNM 分期目前仍然是肺癌中使用最廣泛的預后工具。然而,分期組內生存的變異性表明有必要尋找額外的預后參數(shù)。與此同時,越來越多的證據支持表觀遺傳改變的預后價值,但基因突變與早期肺癌的預后研究鮮有報道。研究者分析了73例早期肺腺癌患者的分子譜,對表皮生長因子受體(EGFR)和Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因(KRAS)進行突變分析。在5.47%的患者中發(fā)現(xiàn)了EGFR突變,僅檢測到外顯子19缺失;9.58%的患者中存在KRAS突變,而只有1例患者為間變性淋巴瘤激酶(ALK)陽性;此外,在56.16%的患者中檢測到p53的異常免疫染色[18]。總之,EGFR和KRAS突變和ALK重排的檢出率低于歐洲和亞洲國家,而p53異常表達的發(fā)生率略高。此外,鑒于該研究的樣本量較小,有必要對該患者進行更全面的分析[18]。因此,早期肺癌亦存在基因突變,其預后價值來自歐洲早期肺癌生物庫的NSCLC標本研究,以評估TP53、KRAS和EGFR基因突變的預后意義[19]。該研究包括11例從不吸煙者、86例既往吸煙者、152例現(xiàn)吸煙者和1例不詳吸煙狀況的患者;鱗癌110例,腺癌133例,大細胞癌或混合組織7例;該研究發(fā)現(xiàn)從冰凍的腫瘤組織中提取DNA,突變率為48.8%,TP53突變狀態(tài)與預后無關;EGFR基因突變幾乎只在從不吸煙的女性中發(fā)現(xiàn);KRAS基因突變在18.5%的患者中檢出,且與疾病進展有關。這些結果表明,突變是不同病因和組織病理形式肺癌的良好標志物,但除了KRAS突變外,幾乎沒有預后價值,KRAS突變可能對腺癌有預后價值[19]。CTCs有望作為監(jiān)測NSCLC患者預后和復發(fā)的生物標志物。在100例NSCLC手術切除患者中,48%的患者檢測到了肺靜脈循環(huán)腫瘤細胞(PV-CTC),PV-CTC、基因組分析和計數(shù)有可能成為 NSCLC 復發(fā)的早期預測指標[20]。在患者縱向監(jiān)測血液循環(huán)中的 CTCs 比放射學證據更能指示疾病復發(fā)[21]。CTCs 的分子特征可以提供基于細胞計數(shù)的有用信息。不同轉移潛能患者的 CTCs 具有特定的基因特征和不同的表達譜,可用于識別早期 NSCLC 患者的高復發(fā)風險[22]。

手術仍然是早期肺癌患者的最佳治療策略,但這種手術干預后的評估和預警機制不夠健全。 CTCs檢測和血漿代謝物分析可能是診斷早期肺癌和識別有疾病復發(fā)風險的患者的有效手段[23]。CTCs檢測可以識別出那些具有較高疾病復發(fā)風險的肺癌患者,從而有可能讓臨床醫(yī)生確定哪些患者最有可能從手術后的輔助治療中獲益。一項回顧性研究表明,術前CTCs水平是NSCLC患者預后的獨立、靈敏的生物標志物[24]?；谛g前CTCs水平在預測NSCLC患者術后轉移和復發(fā)風險中具有重要價值,CTCs是晚期NSCLC患者無進展生存期和總生存期的獨立預后指標,當CTCs計數(shù)添加到完整的臨床病理預測模型時,可以改善預后[25]。CTCs的檢測與早期和晚期NSCLC患者的不良臨床結局相關。轉移是NSCLC患者死亡的主要原因。然而,鑒別術后局部或遠處轉移的NSCLC患者仍然具有挑戰(zhàn)性。CTCs能準確反映循環(huán)血液中腫瘤細胞微轉移對患者治療及預后的影響。

早期肺癌治療后隨訪復查CTCs對預測患者預后復發(fā)起關鍵作用。一項薈萃分析評估早期NSCLC液體活檢的診斷和預后價值[26],包括常見生物標志物、CTCs、ctDNA、甲基化標志物和microRNAs。結果提示生物標志物對早期NSCLC的估計診斷價值在0.84～0.87。TNM Ⅰ期、T1期、N0期、腺癌、年輕和不吸煙等因素有助于降低腫瘤負擔,中位細胞游離DNA水平為8.64 ng/mL。對于預后分析,微小殘留病檢測的存在是疾病復發(fā)的一個強有力的預測因子,從分子層面預測復發(fā)到影像學監(jiān)測到疾病進展的間隔時間為(179±74)d。因而,在臨床工作中,如果在早期肺癌隨訪過程中行液體活檢,可以提前約半年發(fā)現(xiàn)肺癌復發(fā)進展。

程序性死亡配體1(PD-L1)表達陽性的CTCs與早期肺癌不良結局相關。目前多項研究表明,CTCs與接受免疫檢測點抑制劑治療的NSCLC預后有關[27-29]。外周血CTCs表面含有PD-L1蛋白的表達,從肺癌的早期階段分離出的CTCs預示著預后不良,并且可以通過定期隨訪來確定預測復發(fā)的生物標志物[30],但該研究僅包括36例肺癌患者,并且患者的分期并不都是早期(Ⅰ期患者僅19例)。另外一項擴大樣本研究表明,對110例可手術的肺癌患者通過肺靜脈檢測CTCs,其中僅4例未發(fā)現(xiàn)CTCs[31],根據患者肺靜脈CTCs是否表達PD-L1,將患者分為PD-L1陽性CTCs組(56/110,50.1%)和PD-L1陰性CTCs組(54/110,49.9%);單變量分析顯示PD-L1陽性CTCs組患者的中位無病生存期縮短,PD-L1陽性CTCs組的中位無病生存期為 16.7個月,PD-L1陰性CTCs組中位無病生存期為24.5個月,因而,CTCs中PD-L1的檢測可能為術后輔助免疫治療提供重要決策。

CTCs在肺癌放療預后中亦發(fā)揮著重要作用。對于早期NSCLC患者行立體定向放射(SBRT)治療后,監(jiān)測CTCs可能會提前預警疾病復發(fā)或進展,治療后CTC計數(shù)陰性可能會為疾病控制提供保證[32]。CTCs分析可能有助于加強該人群的臨床診斷和隨訪。SBRT早期NSCLC 10%～15%的患者會局部失敗,20%～25%的患者會出現(xiàn)遠處失敗。SBRT治療Ⅰ期的NSCLC患者在治療前、治療期間和治療后24個月內連續(xù)采集標本。結果發(fā)現(xiàn)治療前,較高的CTCs和治療后CTCs的持續(xù)存在與靶向治療部位以外復發(fā)風險增加相關[33]。這表明CTCs分析可能會潛在地識別區(qū)域或遠處復發(fā)風險較高的患者,以及可能從全身治療或及時的局部區(qū)域補救治療中獲益。CTCs檢測可作為SBRT后復發(fā)風險增加的預后標志物。

綜上所述,CTCs作為液體活檢在肺癌早期檢測、預后的臨床價值較高。肺癌重在早診早治,若在影像學表現(xiàn)之前和手術干預后進行CTCs隨訪檢測,對肺癌早期診斷及預后復發(fā)進展起著非常重要的作用。