環(huán)狀RNA circRSF11 結合HuR 促進輻射誘導的肝星狀細胞炎性表型

周佩濤，程炳霖，孫一寧，吳德華，陳宇翰

1南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院放療科，廣東 廣州 510515；2南方醫(yī)科大學第一臨床醫(yī)學院，廣東 廣州510515

放療已成為原發(fā)性肝癌綜合治療模式中的重要組成部分［1,2］。然而，在給予肝癌根治性放療劑量的同時，也存在誘發(fā)放射性肝?。≧ILD）的風險［3,4］。作為肝癌放射治療的常見并發(fā)癥，RILD組織學早期表現主要是急性放射性肝炎，晚期表現主要是放射性肝纖維化，嚴重的RILD 可致患者肝功能衰竭死亡［5,6］。因此，降低RILD發(fā)生率和減輕RILD程度是臨床實踐中提高肝癌放療效果的關注點之一。環(huán)狀RNA（circRNA）是一類無游離5’端或3’端，核酸分子間以共價鍵形成單鏈閉合環(huán)狀的基因轉錄產物［7］。許多研究已證實circRNA與腫瘤、內分泌、老化等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關［8-10］。circRNA可通過多種方式發(fā)揮作用，諸如參與調控親本基因表達，調控轉錄本可變剪切，作為miRNA海綿吸附小RNA（miRNA），直接與RNA結合蛋白（RBP）結合或充當RBP的支架，甚至還可翻譯蛋白質等［11,12］。本課題組前期研究發(fā)現輻射誘導肝星狀細胞（HSC）炎性表型促進RILD 發(fā)?。?3］。另外，輻射誘導HSC 的circRNA RSF1（hsa_circ_0023706）表達上調，其通過吸附miR-146a-5p促進HSC的炎性表型［14］。此外，課題組前期預測發(fā)現circRSF1 與人抗原R（HuR）蛋白有多個結合位點，而HuR 蛋白已被證實參與調控一些炎癥相關的mRNA的表達或翻譯進而影響炎癥免疫應答的發(fā)生［15］。但目前尚未見circRSF1結合RBP發(fā)揮功能的相關研究報道。本研究揭示circRSF1可通過結合HuR蛋白并阻遏HuR與IκBα結合進而促進NF-κB激活，從而實現對HSC炎性表型的調控，豐富了相關發(fā)病調控機制。后續(xù)研究將進一步探討circRSF1結合HuR介導炎癥通路激活在小鼠RILD模型中的調控作用，以期為RILD防治靶點的開發(fā)提供更多的依據。

1 材料和方法

1.1 細胞培養(yǎng)與照射

人HSC株LX2（廣州吉妮歐生物科技有限公司）在含有10%（V/V）胎牛血清（Gibco）的Dulbecco's Modified Eagle's培養(yǎng)基（DMEM;ph7.4）中培養(yǎng)，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按照如下參數進行單次8 Gy照射：6-MV X射線，劑量率300 cGy/min，細胞培養(yǎng)板下方置一塊1.5 cm補償膜，機架角旋轉至180°，源皮距設置為100 cm，射野大小依據照射細胞板數而定，一般不超過40 cm×40 cm。

1.2 細胞轉染

circRSF1過表達質粒、circRSF1 siRNA和陰性對照（廣州吉賽生物），HuR過表達質粒及陰性對照（上海吉凱基因醫(yī)學科技股份有限公司），HuR siRNA、miR-146a-5p 模擬物和相應陰性對照（廣州銳博生物技術有限公司）。參照說明書，使用Lipofectamine 3000(Invitrogen)進行細胞轉染，分別將質粒（1 μg）、siRNA或miR-146a-5p 模擬物(終濃度50 nmol/L)轉染入24孔板中的細胞。HuR 的特異性siRNA 序列為CAACAAGUCCCACAAAUAAUU，circRSF1 siRNA設計的目標序列為CACAAAGGAACAGAAAGAA。

1.3 qRT-PCR

使用TRIzol reagent（Invitrogen）從細胞中提取RNA，應用Prime Script RT試劑盒（Takara Bio，Shiga）合成cDNA，然后使用SYBR?Premix Ex Taq?（Takara）試劑盒在實時檢測系統(tǒng)（QuantStudio 6 Flex）進行qRTPCR 檢測。引物序列見表1。使用GAPDH 作為circRNA或mRNA的檢測內參，采用2-△△CT法計算基因表達。

表1 用于qRT-PCR的引物Tab.1 Primers for qRT-PCR

1.4 Western blot

使用含有苯甲基磺酰氟（上海碧云天生物技術有限公司）的RIPA裂解液在冰上裂解提取蛋白。將蛋白質萃取物轉移至10%～15%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離，然后將凝膠上的蛋白轉移至PVDF膜（Millipore）。經過5%脫脂奶粉封閉1 h后，使用相應一抗在4 ℃孵育過夜。本研究中使用的抗體包括anti-HuR（#12582）、anti-IκBα（#4814）、anti-nuclear factor-κB（NF-κB）p65（#8242）、anti-phospho-NF-κB p65（Ser536；#3033）和anti-GAPDH（#2118）均購自Cell Signaling Technology。然后用辣根過氧化物酶偶聯二抗（Cell Signaling Technology）在室溫下孵育1 h。使用化學發(fā)光系統(tǒng)（BLT GelView 6000 Pro，廣州博鷺騰生物科技有限公司）對蛋白印跡進行可視化。所有蛋白條帶以GAPDH作為檢測內參。

1.5 RNApull down

利用Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down 試劑盒（Pierce Biotechnology）進行RNA pull down 檢測。參照說明書，將與circRSF1互補的生物素化RNA探針或陰性對照探針與鏈霉親和素包被的磁珠在26 ℃下孵育30 min，生成包被的磁珠。將30 μL細胞裂解液用于制備RNA-蛋白結合反應的混合物，部分細胞裂解液作為input。然后將混合物與探針包被的磁珠在4 ℃孵育30 min。將RNA 結合蛋白復合物洗脫后，采用Western blot分析下拉物中的蛋白。

1.6 RNA結合蛋白免疫沉淀（RIP）

采用Magna RIP 試劑盒（Millipore）進行RIP 檢測。參照說明書，將磁珠與5 μg抗兔IgG（Millipore）或5 μg抗HuR（#12582，Cell Signaling Technology）抗體混合，然后將細胞裂解液和RIP免疫沉淀緩沖液與磁珠-抗體復合物在4 ℃旋轉孵育過夜。經過蛋白酶Κ處理后，從免疫沉淀復合物中洗脫RNA，進一步純化后進行qRT-PCR檢測。

1.7 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件進行數據分析。數據采用均數±標準差表示，兩組間的差異比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HuR表達下調促進輻射誘導的HSC炎性表型

給予LX2細胞不同劑量X線照射后檢測發(fā)現，8 Gy誘導circRSF1表達上調最為顯著（P＜0.05，圖1A）。通過circRNA 研究網站CircInteractome (https://circinteractome.irp.nia.nih.gov/)預測發(fā)現，circRSF1與HuR蛋白有多個結合位點。相比非照射組，予8 Gy X線照射后LX2細胞的HuR表達無明顯改變（圖1B）。為明確HuR表達水平在輻射背景下對HSC功能的影響，本研究分別對LX2細胞敲低或過表達HuR后進行照射。轉染HuR siRNA可顯著下調HuR和IκBα的表達，促進NF-κB p65磷酸化和促炎因子（IL1-β、IL-6、TNF-α）生成（P＜0.05，圖1C）。相反，予LX2細胞過表達HuR后可上調HuR和IκBα的表達，抑制NF-κB p65磷酸化和促炎因子（IL1-β、IL-6、TNF-α）生成（P＜0.05，圖1D）。此外，過表達或敲低HuR對LX2細胞的circRSF1和活化指標α-SMA的表達均無明顯影響（圖1C、D）。

圖1 改變HuR的表達對受照的HSC炎性表型和NF-κB激活的影響Fig.1 Effect of modifying the expression of HuR on inflammatory phenotype and NF-κB activation in irradiated HSCs.A:Expression of circRSF1 in LX2 cells with X ray irradiation at different doses(Gy).B:Expression of HuR in LX2 cells with or without irradiation.C:Effect of HuR knockdown on inflammatory phenotype and NF-κB activation in irradiated LX2 cells.D:Effect of HuR overexpression on inflammatory phenotype and NF-κB activation in irradiated LX2 cells.*P＜0.05 vs NIR or negative control (NC).NIR: Nonirradiation;si-NC:siRNAnegative control;OE-NC:Negative control overexpressing plasmid.

2.2 circRSF1過表達阻遏HuR與IκBα結合

為探討circRSF1是否通過HuR調控IκBα表達，本研究分別將circRSF1過表達質粒或siRNA轉染入LX2細胞，發(fā)現過表達或敲低circRSF1對HuR表達均無影響（圖2A）。RNA pull down 和Western blot 檢測發(fā)現circRSF1能與HuR蛋白結合，且circRSF1表達上調促進了HuR蛋白與circRSF1結合（圖2B）。RIP和qRTPCR檢測發(fā)現，HuR蛋白能與circRSF1結合，且circRSF1 表達上調，結合在HuR 蛋白的circRSF1 明顯增多，而結合在HuR 蛋白的IκBα mRNA 明顯減少（P＜0.05，圖2C）。將circRSF1 過表達質粒和或miR-146a-5p 模擬物轉染入LX2 細胞，發(fā)現circRSF1 和或miR-146a-5p 表達上調對HuR 蛋白表達無影響，circRSF1過表達可抑制IκBα的表達，而miR-146a-5p則無此效應（圖2D）。

圖2 circRSF1與HuR結合的驗證Fig.2 Verification of the binding between circRSF1 and HuR.A: Effect of knockdown or overexpression of circRSF1 on HuR expression.B:Interaction between HuR protein and circRSF1 detected by RNA pull-down assay.C:Interaction of HuR protein with circRSF1 and IκBα detected by RIP assay.D: Effect of overexpression of circRSF1 and/or miR-146a-5p on expressions of HuR and IκBα.*P＜0.05 vs corresponding negative control.si-circNC:Negative control siRNA for circRSF1;si-circRSF1:Specific siRNAagainst circRSF1;pLCDH:pLCDH-ciR vector.

2.3 抑制circRSF1表達對HSC的抑炎效應可被HuR敲低逆轉

將circRSF1 siRNA聯合HuR siRNA共轉染HSC后予照射，結果顯示敲低circRSF1 抑制HSC 生成IL1-β、IL-6、TNF-α，而予聯合敲低HuR則可上調HSC的促炎因子（P＜0.05，圖3A）。敲低circRSF1導致IκBα表達上調和NF-κB p65磷酸化減少，予聯合敲低HuR后則可下調IκBα表達和促進NF-κB p65磷酸化（P＜0.05，圖3B）。

圖3 聯合敲低circRSF1與HuR的表達對受照的HSC炎性表型和NF-κB激活的影響Fig.3 Effect of knockdown of circRSF1 and HuR on inflammatory phenotype(A)and NF-κB activation(B)in irradiated HSCs.*P＜0.05 vs corresponding negative control.#P＜0.05 vs si-circRSF1 group.

2.4 上調circRSF1表達對HSC的促炎效應可被HuR過表達逆轉

將circRSF1過表達質粒聯合HuR過表達質粒共轉染HSC后予照射，結果顯示circRSF1過表達促進HSC生成IL1-β、IL-6、TNF-α，而予聯合過表達HuR則可抑制HSC的促炎因子生成（圖4A）。circRSF1過表達抑制IκBα表達和促進NF-κB p65磷酸化，而予聯合過表達HuR后則可上調IκBα表達和抑制NF-κB p65磷酸化（P＜0.05，圖4B）。

圖4 聯合過表達circRSF1與HuR對受照的HSC炎性表型和NF-κB激活的影響Fig.4 Effect of overexpression of circRSF1 and HuR on inflammatory phenotype (A) and NF-κB activation(B)in irradiated HSCs.*P＜0.05 vs corresponding negative control.#P＜0.05 vs circRSF1 group.

3 討論

circRNA可以與不同的RNA結合蛋白結合形成特定的復合物，隨后影響相關蛋白的作用模式［16-18］。本研究通過預測發(fā)現circRSF1與HuR蛋白有多個結合位點。HuR，又稱類胚胎致死性異常視覺蛋白1，該蛋白可特異性地結合靶mRNA 3'非翻譯區(qū)(3'UTR)中的AU富集元件，通過提高靶mRNA的穩(wěn)定性和或翻譯效率而上調靶基因在細胞中的表達水平［19］。相反，circRNA則可通過競爭結合HuR導致HuR靶mRNA的穩(wěn)定性下降和表達下調，例如，circDLC1 可與HuR 結合，減少HuR 與MMP1 mRNA 的相互作用，從而抑制MMP1 mRNA的表達，最終抑制肝癌進展［20］。本研究也發(fā)現circRSF1與HuR結合后減少HuR與IκBα mRNA的結合，導致IκBα mRNA 表達下調。部分circRNA 結合HuR后并不影響靶mRNA的表達，但可下調靶mRNA的翻譯效率導致靶蛋白生成減少。據報道，circ-PABPN1 與HuR 的結合能阻止HuR 與PABPN1、Atg16l1 mRNA的結合并減少這些mRNA的翻譯［21,22］。另有研究顯示，circPPM1F 與HuR 的競爭性相互作用導致PPM1F的翻譯受阻，從而減輕PPM1F對NF-κB途徑的抑制作用［23］。結合本研究結果和既往報道表明，circRNA能夠作為HuR蛋白的“海綿”，阻遏HuR與其靶基因的結合進而影響靶基因的表達，參與調控疾病的發(fā)生發(fā)展。另外，與本研究結果不同的是，也有部分研究報道circRNA可以作為HuR的蛋白支架，協(xié)助HuR調控靶基因的表達［24］。如，circTICRR通過結合HuR蛋白進而穩(wěn)定GLUD1 mRNA并升高GLUD1蛋白的水平，促進宮頸癌增殖［25］。circEIF3H可作為HuR的支架來調節(jié)HSPD1，RBM8A和G3BP1的mRNA穩(wěn)定性，促進三陰性乳腺癌增殖和轉移［26］。另有研究報道circStag1 與HuR相互作用并促進HuR易位到細胞質中，高細胞質水平的HuR通過穩(wěn)定和增強β-連環(huán)蛋白表達，導致Wnt信號通路的激活，從而刺激骨髓間充質干細胞的成骨分化［27］。我們推測circRNA與HuR蛋白的互作方式可能與不同的疾病背景有關，在不同條件下，circRNA可充當RBP“海綿”或支架發(fā)揮不同的功能。

本研究發(fā)現，在輻射背景下，沉默HuR的表達可促進HSC生成炎性因子。相關研究已證實，HuR蛋白通過調控炎癥通路相關調節(jié)因子的mRNA的穩(wěn)定性和或翻譯進而影響炎癥反應的發(fā)生。如，HuR 通過提高NΚRF mRNA的穩(wěn)定性并上調NΚRF的表達，進而抑制NF-κB信號通路，減少退行性髓核細胞中的炎癥和胞外基質降解［28］。再有，HuR的表達上調可促進GILZ的翻譯，進而抑制NF-κB活化，導致炎癥因子生成減少［29］。另一項研究顯示HuR 能特異性結合IκBα mRNA 的3'UTR調控IκBα表達；HuR過表達或敲低可分別上調或下調IκBα蛋白表達，進而影響NF-κB的表達［30］。本研究發(fā)現circRSF1與HuR結合后使HuR與IκBα mRNA的結合減少，導致IκBα蛋白表達下調進而促進NF-κB活化，增加促炎因子生成，此效應可被HuR過表達逆轉，表明circRSF1通過阻遏HuR的功能發(fā)揮從而促進炎癥通路激活。

綜上所述，HuR增強IκBα表達并抑制NF-κB通路激活，減輕HSC受照后的炎性表型，而circRSF1通過結合HuR降低IκBα表達，促進HSC受照后的炎性表型。本研究在前期闡明circRSF1能夠作為miRNA海綿的基礎上進一步揭示circRSF1能夠結合RBP發(fā)揮調控功能，豐富了circRNA在RILD發(fā)病過程中的調控機制。然而，體外細胞實驗無法模擬體內復雜的微環(huán)境，因而后續(xù)研究需要在動物體內和臨床實踐中進一步驗證。體外實驗初步探索的機制和靶點為后續(xù)開展體內實驗提供了研究方向和轉化目的。如何實現HSC的靶向給藥以及防止核酸類藥物的體內降解等問題均是我們后續(xù)開展在體研究和臨床轉化的重要關注點。