歐前胡素對(duì)惡病質(zhì)模型小鼠的改善作用及機(jī)制研究 Δ

王雅嫻 ，楊全軍 ，郭澄 （1.上海中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，上海 0103；.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第六人民醫(yī)院藥劑科，上海 0033）

腫瘤惡病質(zhì)是一種以骨骼肌質(zhì)量持續(xù)損失為特征的多因素綜合征，或伴隨著脂肪組織的損耗[1]，傳統(tǒng)的營(yíng)養(yǎng)支持不能完全逆轉(zhuǎn)。其伴隨著肌原纖維蛋白水解、脂肪組織分解增加、胰島素抵抗、能量代謝異常和食物攝入量減少[2]，從而降低患者的治療效果和生活質(zhì)量，進(jìn)一步惡化腫瘤患者的病情[3]。2020年全球有1 930萬新發(fā)癌癥病例和近1 000萬癌癥死亡病例[4]，然而50%～80%的晚期癌癥患者會(huì)出現(xiàn)惡病質(zhì)，其中至少20%直接因惡病質(zhì)而死亡[5]，而非因?yàn)槟[瘤本身。腫瘤惡病質(zhì)發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，迄今為止，仍然缺乏有效的干預(yù)手段，治療方法多為營(yíng)養(yǎng)治療加體育鍛煉[6]。在藥物治療方面，醋酸甲地孕酮作為唯一一個(gè)獲批用于治療腫瘤相關(guān)惡病質(zhì)的藥物，臨床上常用其來刺激食欲，使得患者體質(zhì)量增加，但其增加的是體脂含量而不是骨骼肌質(zhì)量[7]。在腫瘤惡病質(zhì)中，骨骼肌又是蛋白質(zhì)丟失的主要部位[8]，肌肉質(zhì)量和力量慢慢喪失，導(dǎo)致患者身體功能下降，且骨骼肌萎縮降低了患者對(duì)幾種常見癌癥治療方法的耐受性[9]，因此研究腫瘤惡病質(zhì)引起肌肉萎縮的治療方法具有重要的臨床意義。

歐前胡素是一種天然的呋喃香豆素類化合物，廣泛存在于各類植物中[10]。歐前胡素的藥理作用廣泛，主要集中在抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、抗過敏和神經(jīng)保護(hù)方面[11―12]。因此，本研究通過構(gòu)建腫瘤惡病質(zhì)小鼠模型，旨在探索歐前胡素改善腫瘤惡病質(zhì)肌肉萎縮的作用效果及機(jī)制，以期為臨床治療腫瘤惡病質(zhì)提供更多實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有ABI ViiA7型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、NanoDrop 2000型核酸蛋白濃度分析儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司），Ⅸplore Standard型熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司），Mini型蛋白電泳系統(tǒng)電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad公司），KZ-Ⅲ-F型低溫型研磨儀（武漢賽維爾生物科技有限公司），Amersham Imager 600型化學(xué)發(fā)光成像儀（美國(guó)GE Healthcare Bio-Sciences AB公司）。

1.2 主要藥品與試劑

歐前胡素（貨號(hào)MUST-21030804，純度＞98%）購自成都曼思特生物科技有限公司；羧甲基纖維素鈉（CMCNa，貨號(hào)G1121）購自北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒（貨號(hào)P0011）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；蘇木素-伊紅（HE）染料、麥胚凝聚素（WGA）染料均購自武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號(hào)分別為G1001、GDP1020；兔源肌細(xì)胞生成素（Myogenin，Myog）單克隆抗體、兔源肌肉萎縮盒F蛋白（Muscle atrophy F box，MAFbx）多克隆抗體均購自英國(guó)Abcam公司，貨號(hào)分別為ab1835、ab168372；兔源B細(xì)胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）單克隆抗體、兔源Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）單克隆抗體、山羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗、山羊抗鼠辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG二抗均購自美國(guó)CST公司，貨號(hào)分別為15071、89477、7074S、7076S；兔源磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子3（phosphorylation-signal transducer and activator of transcription 3，p-STAT3）單克隆抗體、兔源信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）多克隆抗體、兔源胱天蛋白酶 3（Caspase3）單克隆抗體均購自武漢愛博泰克生物科技有限公司，貨號(hào)分別為AP0705、A1192、A19654；鼠源微管蛋白（β-tubulin）單克隆抗體（貨號(hào)bsm-33034M）購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；ECL超靈敏化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)SQ201）購自上海雅酶生物科技有限公司；引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)合成，詳見表1。

表1 RPS18等基因引物序列和引物長(zhǎng)度

1.3 動(dòng)物與細(xì)胞

SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠（6周齡）15只，體質(zhì)量18～22 g，購于上海計(jì)劃生育研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)營(yíng)部，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（滬）2018-0006。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已通過上海市第六人民醫(yī)院動(dòng)物福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，編號(hào)為DWLL2022-0545。小鼠肺癌LLC細(xì)胞購于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組、建模及給藥

將15只雄性C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組和歐前胡素組，每組5只。參考相關(guān)文獻(xiàn)[13]的方法建立模型，除空白對(duì)照組外，余下2組小鼠均于背部皮下接種0.1 mL LLC細(xì)胞混懸液（細(xì)胞密度約為1×106個(gè)/mL），空白對(duì)照組注射等體積的生理鹽水。接種LLC細(xì)胞混懸液第7 天觀察，除空白對(duì)照組小鼠外，其余小鼠可見腫瘤，并于第7天開始每日灌胃給藥干預(yù)。參考相關(guān)文獻(xiàn)[14]并結(jié)合前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，歐前胡素組按60 mg/kg灌胃歐前胡素混懸液（溶劑為0.5%CMC-Na溶液），空白對(duì)照組和模型組給予等體積0.5%CMC-Na溶液，連續(xù)給藥13 d。

2.2 指標(biāo)檢測(cè)

2.2.1 一般指標(biāo)檢測(cè) 給藥期間，每日定時(shí)記錄小鼠的攝食量和體質(zhì)量；每?jī)扇諟y(cè)量一次腫瘤的長(zhǎng)徑（x）和短徑（y），計(jì)算腫瘤體積V（V＝x×y2/2）；取材當(dāng)日稱量腫瘤質(zhì)量和骨骼肌質(zhì)量，并計(jì)算去瘤體質(zhì)量。

2.2.2 取材 末次給藥結(jié)束后，用1%戊巴比妥按體質(zhì)量5 mL/kg對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉，然后頸椎脫臼處死小鼠，取下腫瘤和雙側(cè)后肢骨骼肌，將部分骨骼肌置于4%多聚甲醛中固定，剩余部分放在－80 ℃冷凍保存用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

2.2.3 骨骼肌病理學(xué)檢測(cè)和纖維橫截面積計(jì)算 將4%多聚甲醛固定的骨骼肌組織包埋于石蠟中，制作石蠟切片，用常規(guī)方法進(jìn)行HE染色，于顯微鏡下觀察病理變化，采集圖片。另取石蠟切片進(jìn)行WGA染色，觀察骨骼肌纖維橫截面積的變化，每組測(cè)量100個(gè)骨骼肌纖維橫截面積大小，并使用Image Pro Plus 6.0軟件對(duì)小鼠骨骼肌纖維橫截面積進(jìn)行計(jì)算。

2.2.4 骨骼肌萎縮和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot法進(jìn)行檢測(cè)。取出部分存于－80 ℃的各組小鼠骨骼肌用于總蛋白提取，BCA法測(cè)量蛋白濃度，對(duì)蛋白濃度進(jìn)行調(diào)平。每組動(dòng)物均隨機(jī)選取3個(gè)蛋白樣本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE電泳分離后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%牛血清白蛋白封閉1 h，分別加入β-tubulin、p-STAT3、STAT3、Myog、MAFbx、Bcl-2、Bax、Caspase3一抗（稀釋比均為1∶1 000），于4 ℃搖床孵育過夜。次日用TBST洗膜4次，每次5 min，加入相應(yīng)二抗（稀釋比均為1∶10 000），常溫孵育1 h后，用TBST洗膜3次，每次5 min，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影成像。收集圖片，使用Image J軟件進(jìn)行灰度值計(jì)算，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參β-tubulin灰度值的比值作為其表達(dá)量，以p-STAT3與STAT3灰度值的比值反映STAT3的磷酸化水平，空白對(duì)照組作為統(tǒng)計(jì)結(jié)果矯正組。

2.2.5 骨骼肌萎縮和凋亡相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行檢測(cè)。取20 mg骨骼肌，加入1 mL Trizol，放入研磨機(jī)中低溫勻漿裂解，提取組織總RNA，測(cè)定純度和濃度后，取1 μg RNA配制成20 μL反應(yīng)體系，將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄采用兩步法反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性 10 min；95 ℃變性 15 s，60 ℃退火 60 s，40個(gè)循環(huán)反應(yīng)。以RPS18為內(nèi)參，采用2－ΔΔCt計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量，空白對(duì)照組作為統(tǒng)計(jì)結(jié)果矯正組。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8.0軟件、SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和作圖，數(shù)據(jù)均以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 歐前胡素對(duì)惡病質(zhì)模型小鼠一般指標(biāo)的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠體質(zhì)量、骨骼肌質(zhì)量均顯著降低（P＜0.05），攝食量有所下降；與模型組比較，歐前胡素組小鼠經(jīng)過給藥干預(yù)后體質(zhì)量下降的變化速度有所減緩，最終的體質(zhì)量、去瘤體質(zhì)量、骨骼肌質(zhì)量均顯著升高（P＜0.05），攝食量有所提高，同時(shí)腫瘤質(zhì)量和腫瘤體積均顯著降低（P＜0.05），表明歐前胡素在抗腫瘤惡病質(zhì)的基礎(chǔ)上兼有抗腫瘤功效。結(jié)果見圖1。

圖1 歐前胡素對(duì)惡病質(zhì)模型小鼠一般指標(biāo)的影響（n＝5）

3.2 歐前胡素對(duì)惡病質(zhì)模型小鼠骨骼肌病理狀態(tài)及纖維橫截面積的影響

HE染色切片可以看出空白對(duì)照組小鼠骨骼肌排列緊密且整齊，細(xì)胞間隙較小，細(xì)胞多呈圓形或多邊形；模型組小鼠骨骼肌排列疏松，細(xì)胞間隙較大；與模型組比較，歐前胡素組小鼠骨骼肌纖維排列緊密，細(xì)胞間隙較小。WGA染色結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠骨骼肌纖維橫截面積顯著縮?。≒＜0.05）；與模型組比較，歐前胡素組小鼠骨骼肌纖維橫截面積顯著增大（P＜0.05），說明歐前胡素能夠改善骨骼肌萎縮的癥狀。結(jié)果見圖2。

圖2 各組小鼠骨骼肌HE染色和WGA染色結(jié)果

3.3 歐前胡素對(duì)惡病質(zhì)模型小鼠骨骼肌中肌萎縮相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠骨骼肌中p-STAT3/STAT3比值和MAFbx蛋白表達(dá)量均顯著升高（P＜0.05），Myog蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，歐前胡素組小鼠骨骼肌中p-STAT3/STAT3比值和MAFbx蛋白表達(dá)量均顯著降低（P＜0.05），Myog蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖3。

圖3 歐前胡素對(duì)惡病質(zhì)模型小鼠骨骼肌中肌萎縮相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（n＝3）

3.4 歐前胡素對(duì)惡病質(zhì)模型小鼠骨骼肌中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響

與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠骨骼肌中Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），Bax、Caspase3蛋白表達(dá)量均顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，歐前胡素組小鼠骨骼肌中Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），Bax、Caspase3蛋白表達(dá)量均顯著降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖4。

圖4 歐前胡素對(duì)惡病質(zhì)模型小鼠骨骼肌中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（n＝3）

3.5 歐前胡素對(duì)惡病質(zhì)模型小鼠骨骼肌中肌萎縮和凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠骨骼肌中MAFbx、Bax、Caspase3 mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05），Myog、Bcl-2表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，歐前胡素組小鼠骨骼肌中MAFbx、Bax、Caspase3 mRNA表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05），Myog、Bcl-2 mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）。結(jié)果見圖5。

圖5 歐前胡素對(duì)惡病質(zhì)模型小鼠骨骼肌萎縮和凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響（n＝5）

4 討論

腫瘤惡病質(zhì)是一種復(fù)雜的全身性疾病，涉及不同組織和器官的不同代謝途徑，無論脂肪是否減少，均伴隨著骨骼肌的消耗[15]，因此能否緩解骨骼肌的消耗性萎縮，成為治療腫瘤惡病質(zhì)的關(guān)鍵。蛋白質(zhì)合成減少、水解加快，則是骨骼肌消耗性萎縮的關(guān)鍵原因[16]。蛋白水解主要涉及泛素依賴的蛋白水解途徑，MAFbx是泛素-蛋白酶體系統(tǒng)中參與蛋白降解的主要E3泛素連接酶，在肌細(xì)胞中特異性表達(dá)，介導(dǎo)肌蛋白的降解并抑制蛋白合成[15]。Myog是骨骼肌生長(zhǎng)、發(fā)育和再生的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，惡病質(zhì)模型小鼠MAFbx表達(dá)升高，Myog表達(dá)降低，蛋白合成減少、降解增多，骨骼肌被大量消耗；歐前胡素干預(yù)后顯著降低促進(jìn)蛋白水解的相關(guān)蛋白MAFbx的表達(dá)，且升高肌生成相關(guān)蛋白Myog的表達(dá)，且與mRNA表達(dá)結(jié)果一致。

STAT3是信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子STATs家族中的一員，在正常的生理狀態(tài)下STAT3會(huì)被短暫快速地激活幾分鐘，然而持續(xù)激活STAT3會(huì)引起與細(xì)胞增殖、分化和凋亡相關(guān)的基因異常表達(dá)[18]，STAT3可通過增強(qiáng)腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和免疫抑制來促進(jìn)惡病質(zhì)的發(fā)展。抑制STAT3激活可阻斷骨骼肌萎縮，并抑制泛素-蛋白酶體系統(tǒng)，保存肌肉質(zhì)量[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠相較于空白對(duì)照組，p-STAT3/STAT3比值顯著升高，提示造模后STAT3信號(hào)通路被激活；與模型組比較，歐前胡素組p-STAT3/STAT3比值顯著降低，表明歐前胡素可通過抑制STAT3信號(hào)通路，影響肌萎縮和肌生成相關(guān)蛋白，從而改善惡病質(zhì)模型小鼠的肌萎縮。

細(xì)胞凋亡是調(diào)節(jié)多種刺激誘導(dǎo)的骨骼肌分解代謝的重要過程，并已成為肌肉質(zhì)量損失的潛在控制點(diǎn)[20]。細(xì)胞凋亡的激活先于與肌肉消耗相關(guān)的蛋白質(zhì)分解[21]，Bcl-2、Bax和Caspase3是細(xì)胞凋亡過程的關(guān)鍵調(diào)控因子，主要位于線粒體中，參與調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠Bax和Caspase3蛋白表達(dá)量均顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著降低，表明惡病質(zhì)模型小鼠骨骼肌細(xì)胞處于過度凋亡狀態(tài)；經(jīng)過歐前胡素給藥干預(yù)后，凋亡情況有所好轉(zhuǎn)。

綜上所述，歐前胡素改善腫瘤惡病質(zhì)的機(jī)制可能通過抑制STAT3信號(hào)通路中STAT3磷酸化的激活從而改變泛素-蛋白酶體系統(tǒng)中與肌萎縮相關(guān)的蛋白和基因的表達(dá)，改善惡病質(zhì)模型小鼠骨骼肌過度消耗的狀況，并通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)，減緩惡病質(zhì)模型小鼠骨骼肌的萎縮進(jìn)程。