抗菌肽MAF-1A洐生肽的設(shè)計(jì)及其抗白色念珠菌活性*

黃敏慧， 曾曄， 張迎春， 李彩多， 吳建偉， 陳崢宏*， 王濤*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng) 550025； 2.貴州省普通高等學(xué)校病原生物學(xué)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽(yáng) 550025)

近年來(lái)，白色念珠菌(Candidaalbicans，C.albicans)感染的臨床病例數(shù)逐年上升，由C.albicans所致的侵襲性真菌病的死亡率高達(dá)50%[1-3]。隨著抗真菌藥物的廣泛使用，真菌的耐藥現(xiàn)象越來(lái)越普遍，耐藥性已成為當(dāng)前臨床抗真菌感染治療中亟待解決的難題?？咕?antimicrobial peptides, AMPs)是一種小分子先天免疫功能多肽，對(duì)真菌、細(xì)菌、病毒等病原微生物和腫瘤細(xì)胞具有抑殺活性，且不易產(chǎn)生耐藥等特點(diǎn)，具備開(kāi)發(fā)成為新型抗菌藥物的巨大潛力[4-6]。家蠅抗真菌肽-1A(Muscadomesticaantifungal peptide-1A，MAF-1A)是本課題組從家蠅幼蟲(chóng)獲得的由26個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的小分子陽(yáng)離子多肽[7]，研究表明MAF-1A對(duì)C.albicans等多種真菌及腫瘤細(xì)胞具有良好的抑殺效果[8-10]，具有新型肽類(lèi)藥物開(kāi)發(fā)潛力，但其抗菌能力、溶血性等需要進(jìn)一步優(yōu)化。研究表明，一些天然AMPs經(jīng)結(jié)構(gòu)改造后具有與模板肽相似或更高的生物學(xué)活性[11-12]。因此，本研究采用序列截短法、氨基酸殘基替換法對(duì)MAF-1A進(jìn)行改造，利用生物信息學(xué)分析衍生肽的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)，并檢測(cè)其抗C.albicans生物學(xué)活性及抗菌機(jī)制，以期獲得高抗菌活性、低毒性的AMPs，為臨床新型抗真菌藥物研發(fā)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1受試菌株C.albicansATCC10231由貴州醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2主要試劑和儀器 沙氏葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(schaller's glucose broth, SDB；杭州百思)、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(sabouraud dextrose agar, SDA；杭州百思)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution, PBS；北京Solarbio)、Triton X-100(北京Solarbio)、2.5%戊二醛(北京Solarbio)、氟康唑(fluconazole, FLC；北京Solarbio)；單面垂直流超凈工作臺(tái)(蘇州SW-CJ-1F)、超微量微孔板分光光度計(jì)(美國(guó)biotek epoch2)、臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)SIGMA)。

1.2 研究方法

1.2.1MAF-1A衍生肽的分子設(shè)計(jì)、生物信息學(xué)分析及化學(xué)合成 根據(jù)影響AMPs功能的正電荷、疏水性、兩親性及a-螺旋結(jié)構(gòu)等參數(shù)，對(duì)MAF-1A進(jìn)行分子改造。首從采用截短法從MAF-1A的 N端以及C端分別截取2、3、4或5個(gè)氨基酸得到4條截短肽，其次用堿性氨基酸-賴(lài)氨酸(lysine,K)替換截短肽序列中的谷氨酸(glutamic acid,E)、天冬酰胺(aspartic acid,D)和絲氨酸(serine,S)，以此來(lái)增加正電荷；異亮氨酸(isoleucine, I)、色氨酸(tryptophan,W)替換谷氨酰胺(glutamin,Q)和E提高衍生肽的疏水性；利用ProtParam網(wǎng)站軟件 (https://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)AMPs的理化性質(zhì)；以HeliQuest網(wǎng)站軟件(https://heliquest.ipmc.cnrs.fr/cgi-bin/ ComputParams.py) 預(yù)測(cè)AMPs的螺旋輪投影；使用NPS (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl/page=/NPSA/npsa. html) 網(wǎng)站的HNN軟件計(jì)算AMPs中α-螺旋所占比例。所設(shè)計(jì)的衍生肽通過(guò)生物信息學(xué)的方法分析，篩選出理化性狀優(yōu)秀的多肽委托生工生物(上海)工程股份有限采用9-芴甲氧羰基固相合成法合成，高效液相色譜純化、液相色譜-質(zhì)譜驗(yàn)證，多肽合成純度≥98%。

1.2.2衍生肽抗C.albicans活性檢測(cè) 參考美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)推薦的M27-A3方法，挑取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的C.albicansATCC10231菌落置于SDB液體培養(yǎng)基中，并采用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)、將菌液濃度調(diào)整至(0.5～2.5)×106cfu/L。取相同體積的菌液100 μL分別與4條不同終濃度(25～1 600 mg/L)的衍生肽稀釋液于96孔板中混勻，37 ℃孵育24 h，肉眼觀察無(wú)菌生長(zhǎng)孔對(duì)應(yīng)的濃度為衍生肽的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)。取MIC 試驗(yàn)中判定無(wú)菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)液接種于SDA 平板，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察平板上菌落生長(zhǎng)現(xiàn)象，以無(wú)菌生長(zhǎng)所對(duì)應(yīng)的最低藥物濃度為最小殺真菌濃度(minimum fungicidal concentration, MFC)，另設(shè)MAF-1A 組(25～1 600 mg/L MAF-1A處理)、FLC對(duì)照組(0.25～64.00 mg/L FLC處理)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.3衍生肽溶血活性檢測(cè) 采集健康人全血，離心分層后吸取下層的血細(xì)胞，并重懸于PBS中得到4%(V/V)紅細(xì)胞懸液備用。取重懸紅細(xì)胞100 μL分別與不同終濃度的4條活性衍生肽和模板肽MAF-1A(25～400 mg/L)稀釋液100 μL混勻于96孔板中，0.1%Triton X-l00處理組作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS處理組作為陰性對(duì)照。恒溫37 ℃孵育2 h，96孔板4 ℃于1 500 r/min離心10 min，取上清液100 μL使用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)414 nm處測(cè)其吸光度并計(jì)算溶血率，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4活性衍生肽對(duì)C.albicans的殺菌動(dòng)力學(xué)檢測(cè) 取濃度為(1.0～5.0)×109cfu/ L菌液與不同終濃度(1、2、4×MIC)的活性衍生肽稀釋液混合，37 ℃恒溫培養(yǎng)；分別在0、4、8、12、16、20、24 h取菌液100 μL適當(dāng)稀釋?zhuān)瑒澗€涂布于SDA平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，菌落計(jì)數(shù)。以不同時(shí)間點(diǎn)(h)為橫坐標(biāo)，菌落數(shù)的對(duì)數(shù) (log cfu/L)為縱坐標(biāo)，繪制時(shí)間-殺菌曲線。同時(shí)設(shè)MAF-1A組(1、2、4×MIC MAF-1A 處理)、FLC對(duì)照組(1、2、4×MIC FLC 處理)和陰性對(duì)照組(PBS處理)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。

1.2.5C.albicans細(xì)胞樣品制備與掃描電鏟觀察 制備濃度為1.0×109cfu/L的C.albicans菌液，加不同終濃度(1、2、4×MIC)的活性衍生肽稀釋液，37 ℃培養(yǎng)12 h，3 000 r/min離心2 min收集沉淀，PBS洗滌3次，棄上清，加2.5%戊二醛固定3 h，PBS洗滌3次，依次于50%、75%及100%乙醇中各脫水5 min，取沉淀涂于載玻片，干燥后用離子濺射儀噴金，掃描電鏡觀察其形態(tài)。另設(shè)MAF-1A組(1、2、4×MIC MAF-1A 處理)、FLC對(duì)照組(1、2、4×MIC FLC 處理)和陰性對(duì)照組(PBS處理)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 MAF-1A 和衍生肽的生物信息學(xué)

通過(guò)生物信息學(xué)方法分析、篩選出4條衍生肽(表1)：MAF-1A22S3、MAF-1A20S3、MAF-1A18S5和MAF-1A16S5，與模板肽MAF-1A相比，4條衍生肽的序列長(zhǎng)度明顯減短，分別由22、20、18和16個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子量有所降低；用帶正電荷的氨基酸以及疏水性的氨基酸替換后，MAF-1A22S3和MAF-1A18S5的正電荷數(shù)均由+2增加到+7，MAF-1A20S3和MAF-1A16S5分別增加到+8和+5；疏水性分別由0.013增加到0.478、0.326、0.461和0.671，MAF-1A22S3和MAF-1A16S5結(jié)構(gòu)中的的α-螺旋占比有所增加，不穩(wěn)定指數(shù)均降低(表2)。螺旋輪結(jié)構(gòu)分析結(jié)果可見(jiàn)(圖1)，衍生肽和MAF-1A均為兩親性結(jié)構(gòu)。

表1 MAF-1A和衍生肽的序列Tab.1 Sequence of MAF-1A and derived peptides

表2 MAF-1A和衍生肽理化性質(zhì)參數(shù)Tab.2 Physicochemical properties of MAF-1A and derived peptides

注：黃色表示強(qiáng)疏水性氨基酸，灰色表示弱疏水性氨基酸，藍(lán)色表示帶正電的親水性氨基酸氨基，紅色表示帶負(fù)電的氨基酸殘基，紫色表示不帶電的氨基酸殘基。圖1 MAF-1A和衍生肽的螺旋輪結(jié)構(gòu)Fig.1 Helical wheel projection of MAF-1A and derived peptides

2.2 MAF-1A衍生肽對(duì)C.albicans的抗菌活性

體外抗C.albicans活性檢測(cè)結(jié)果顯示(表3)，衍生肽MAF-1A22S3、MAF-1A20S3、MAF-1A18S5及MAF-1A16S5對(duì)C.albicans均具有抗菌活性，相較于模板肽MAF-1A，4條衍生肽的MIC和MFC值均下降，其中MAF-1A22S3的抗菌活性增加最為明顯(MIC為31.25 mg/L、MFC為125.00 mg/L)，優(yōu)于模板肽MAF-1A。

表3 MAF-1A、衍生肽和FLC對(duì)C.albicans的MIC和MFCTab.3 MIC and MFC of MAF-1A, derived peptides, and FLC against C. albicans

2.3 MAF-1A衍生肽的溶血活性

體外溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖2)，衍生肽MAF-1A18S5、MAF-1A16S5的溶血活性較強(qiáng)，而MAF-1A22S3、MAF-1A20S3溶血活性低于模板MAF-1A，其中MAF-1A22S3的溶血性最低，在200 mg/L(6×MIC)范圍內(nèi)溶血率<5%，即使高于MIC 值12倍(400 mg/L)時(shí)，溶血率仍然低于 10%，僅出現(xiàn)輕微的溶血現(xiàn)象。

注：(1)與同濃度MAF-1A組比較，P<0.05。圖2 MAF-1A及其衍生肽的溶血率Fig.2 Hemolytic rate of MAF-1A and derived peptides

2.4 時(shí)間-殺菌曲線分析

時(shí)間-殺菌曲線結(jié)果顯示(圖3)，MAF-1A22S3對(duì)C.albicans具有較強(qiáng)的殺菌作用，濃度為1×MIC、2×MIC及4×MIC的MAF-1A22S3在作用于C.albicans后立即發(fā)揮殺菌作用，且隨濃度的增加，殺菌效率逐漸增強(qiáng)，當(dāng)濃度為4×MIC時(shí)作用4 h后即可將C.albicans完全殺滅；相同作用濃度下，MAF-1A22S3對(duì)C.albicans的殺菌效率強(qiáng)于模板肽MAF-1A和FLC對(duì)照組。

注：A～C分別為藥物濃度1×MIC、2×MIC及4×MIC。圖3 MAF-1A、MAF-1A22S3和 FLC作用C.albicans后的時(shí)間-殺菌曲線Fig.3 Time-kill kinetics of MAF-1A, MAF-1A 22S3, and FLC against C. albicans

2.5 C.albicans掃描電鏡結(jié)果

掃描電鏡結(jié)果顯示(圖4)，陰性對(duì)照組C.albicans菌體呈橢圓形，細(xì)胞表面光滑，可見(jiàn)細(xì)長(zhǎng)假菌絲；1×MIC的MAF-1A22S3作用12 h，C.albicans細(xì)胞壁出現(xiàn)明顯凹陷、裂痕，并有細(xì)胞內(nèi)容物溢出；1×MIC的MAF-1A和FLC處理后，C.albicans的病變程度較輕，僅出現(xiàn)細(xì)胞凹陷和裂痕現(xiàn)象；2×MIC的MAF-1A22S3作用12 h后，細(xì)胞壁損傷嚴(yán)重，菌體明顯皺縮，出現(xiàn)小囊泡樣結(jié)構(gòu)；4×MIC的MAF-1A22S3作用12 h后，細(xì)胞壁完全破裂，內(nèi)容物大量溢出，未見(jiàn)形態(tài)完整細(xì)胞。

圖4 MAF-1A、MAF-1A22S3及FLC作用C.albicans后的掃描電鏡結(jié)果Fig.4 Scanning electron microscope images of C. albicans treated with MAF-1A, MAF-1A22S3, and FLC

3 討論

AMPs是生物體抵抗外界病原體感染的小分子多肽，對(duì)病原微生物和腫瘤細(xì)胞均有抑制生長(zhǎng)或清除作用[13-15]。由于AMPs抗菌活性好，免疫原性低，不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)，具備新型抗菌藥物開(kāi)發(fā)的巨大潛力[16-17]。但是天然AMPs由于存在抗菌活性較傳統(tǒng)化學(xué)藥物低、存在溶血性與細(xì)胞毒性等，使其在臨床應(yīng)用中受到了限制[18-20]。因此，以天然AMPs為模板進(jìn)行分子改造是獲得高效、低毒新型肽類(lèi)藥物的重要途徑。

目前，AMPs的改造方法有氨基酸殘基替換法、序列截短法、片段組合法以及化學(xué)基團(tuán)修飾法等，其中氨基酸殘基替換法、序列截短法較為常用[21-24]。AMPs結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的研究表明，影響AMPs抗菌活性的主要理化和結(jié)構(gòu)參數(shù)包括陽(yáng)離子性、疏水性、雙親性、α-螺旋結(jié)構(gòu)及肽鏈長(zhǎng)度等[25-28]。Galeane等[29]以 AMPs Mastoparan的氨基酸序列為模板，通過(guò)使用帶正電荷的賴(lài)氨酸進(jìn)行替換來(lái)提高衍生肽的陽(yáng)離子性，結(jié)果表明衍生肽MK58911和MK4589對(duì)于C.albicans的抑制活性明顯增強(qiáng)；也有研究顯示，通過(guò)肽鏈截短可以降低衍生肽的溶血性及免疫原性[30-31]。本研究在對(duì)MAF-1A理化性質(zhì)分析的基礎(chǔ)上，采用序列截短法與氨基酸殘基替換法相結(jié)合的方式，從陽(yáng)離子性、疏水性、α-螺旋及氨基酸組成等方面對(duì) MAF-1A 進(jìn)行分子改造，結(jié)果提示改造獲得的4條衍生肽MAF-1A22S3、MAF-1A18S5、MAF-1A20S3及MAF-1A16S5的正電荷數(shù)、疏水性及穩(wěn)定性較MAF-1A明顯增加，且MAF-1A22S3和MAF-1A16S5的α-螺旋結(jié)構(gòu)占比高于MAF-1A，表明本研究采用的分子改造方法能夠有效地優(yōu)化影響AMPs抗菌活性的主要理化和結(jié)構(gòu)參數(shù)，提示本研究中對(duì)模板肽的改造方法可行。

抗菌活性檢測(cè)結(jié)果顯示，4條衍生肽對(duì)C.albicans的MIC以及MFC值均小于模板肽MAF-1A，表明衍生肽對(duì)C.albicans的抑殺活性均有不同程度的提高，其中MAF-1A22S3和MAF-1A18S5的抗C.albicans活性最佳；而體外溶血實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，4條衍生肽中MAF-1A22S3的溶血活性最小，相同濃度下，其溶血率顯著低于MAF-1A，結(jié)果表明MAF-1A22S3是一條具有高抗菌活性，低毒性的衍生肽。時(shí)間-殺菌曲線也顯示，MAF-1A22S3在作用于C.albicans后立即發(fā)揮殺菌作用，且隨濃度的增加，殺菌效率逐漸增強(qiáng)，相同作用濃度下，MAF-1A22S3對(duì)C.albicans的殺菌效率強(qiáng)于模板肽MAF-1A和氟康唑?qū)φ战M；以上結(jié)果進(jìn)一步表明，MAF-1A22S3的對(duì)C.albicans的生長(zhǎng)繁殖具有良好的抑殺活性，其抗菌活性、安全性?xún)?yōu)于模板肽，提示衍生肽MAF-1A22S3具備進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為抗真菌藥物的潛力。

目前研究認(rèn)為，AMPs主要通過(guò)破壞細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)(細(xì)胞壁、細(xì)胞膜)或作用于細(xì)胞內(nèi)DNA/RNA、蛋白質(zhì)等靶分子來(lái)發(fā)揮其抗菌作用[32-34]。掃描電鏡結(jié)果顯示，經(jīng)MAF-1A22S3作用后C.albicans的細(xì)胞表面出現(xiàn)凹陷、裂痕等細(xì)胞病變，隨作用濃度的增加細(xì)胞病變更為明顯，最終細(xì)胞皺縮、裂解死亡，表明MAF-1A22S3可以通過(guò)破壞C.albicans細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)發(fā)揮抗菌作用，菌細(xì)胞的損傷程度與濃度呈正相關(guān)，但具體分子機(jī)理需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，通過(guò)分子改造所獲得的衍生肽MAF-1A22S3的抗真菌活性及安全性明顯提高，其可以通過(guò)破壞菌細(xì)胞的完整性發(fā)揮抗菌作用，研究結(jié)果提示，新型 AMPsMAF-1A22S3可以作為抗真菌藥物候選分子，具有深入研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景。