心肌細(xì)胞膜修飾的新型陽離子脂質(zhì)納米顆粒介導(dǎo)心肌肥厚的高效治療研究

矯莉萍 李瑋 孫枝紅 劉杰 孫成銘*,

1（青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部，青島266071）2（青島大學(xué)附屬煙臺毓璜頂醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，煙臺 264000）

心肌肥厚是在血壓升高或后負(fù)荷增加時為了維持心臟正常的收縮功能而發(fā)生的生理適應(yīng)性反應(yīng)[1]。病理性心肌肥厚常與收縮功能障礙、間質(zhì)纖維化、心臟結(jié)構(gòu)重塑和胎兒心臟基因的重新表達(dá)相關(guān)聯(lián)，是誘發(fā)心力衰竭和猝死的重要原因之一[2-3]。目前，心肌肥厚的主要治療策略是藥物治療，即通過使用降低血壓或者能夠阻斷腎上腺素能受體的藥物[4]，但患者的臨床響應(yīng)率低，治療效果并不理想。因此，亟需尋找一種能有效預(yù)防或者逆轉(zhuǎn)心肌肥厚的新型治療方式[5]。

MicroRNAs（miRNAs）是一類非編碼的小RNA，以堿基互補配對的形式與靶基因3′非編碼區(qū)（3′UTR）識別和結(jié)合，通過對靶基因的切割或翻譯抑制而調(diào)控靶基因的表達(dá)[6]。miR-133a 是心肌組織中含量最豐富的miRNA 之一，在心血管疾病進(jìn)程中具有重要作用[7]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-133a 與心肌肥厚呈負(fù)相關(guān)[8]，主要通過抑制GDP-GTP 交換蛋白（RhoA）的表達(dá)來調(diào)控心肌肥厚的病理過程[8-10]。因此，miR-133a 具有治療心肌肥厚的應(yīng)用潛力。

基于RNA 技術(shù)的基因治療（如mRNA、siRNA 和miRNA 等）通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)實現(xiàn)治療包括心血管病、腫瘤、遺傳病和免疫性疾病等多種疾病的目的[11]。為了實現(xiàn)有效治療，RNA 療法需將治療性的RNA 輸送至靶細(xì)胞中[12-13]。然而，RNA 在遞送的過程中面臨著多重阻礙，如RNA 表面負(fù)電荷和親水性阻礙了RNA 在跨質(zhì)膜之間的被動擴散，并且易與血清蛋白結(jié)合而被吞噬細(xì)胞吞噬，體內(nèi)血液循環(huán)中極易被RNA 酶降解等，均導(dǎo)致其難進(jìn)入細(xì)胞中發(fā)揮功能[14]。為了克服上述阻礙，多種病毒類和非病毒遞送系統(tǒng)被開發(fā)用于RNA 的遞送。相較于病毒遞送系統(tǒng)，非病毒遞送系統(tǒng)可繞過病毒載體的限制，在不引起免疫反應(yīng)的前提下將目標(biāo)RNA 運送至靶細(xì)胞中發(fā)揮作用。

陽離子脂質(zhì)納米顆粒（Lipid nanoparticles，LNPs）是目前應(yīng)用最廣的非病毒類RNA 藥物遞送載體，通常由陽離子脂質(zhì)、磷脂、膽固醇和聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）構(gòu)成[15]。其中，陽離子脂質(zhì)是通過與帶負(fù)電荷的核酸相互作用促進(jìn)核酸包裹和介導(dǎo)內(nèi)體破裂使核酸釋放到細(xì)胞質(zhì)中，主要起到保護核酸免受核酸酶降解的作用。PEG 通常在LNPs 中占比最小，影響LNPs 的粒徑和電荷，在增強顆粒穩(wěn)定性的同時阻止LNPs 聚集，在循環(huán)和生物分布過程中具有關(guān)鍵作用。此外，輔助性脂質(zhì)（如磷脂和膽固醇）主要作用是支持顆粒結(jié)構(gòu)，并在儲存和循環(huán)過程中增強穩(wěn)定性[16-17]。

基于LNPs 的遞送載體在RNA 治療領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景，但其在體內(nèi)的有效靶向輸送問題值得重視[18]。本研究基于“模仿自然”的觀念，利用天然細(xì)胞膜偽裝納米載體制備了HR-133a@F1-5LNPs 仿生納米運載系統(tǒng)，此系統(tǒng)具有類天然細(xì)胞的生物性能，因此兼具良好的生物相容性、同源靶向性、更低的毒副作用以及更長的體內(nèi)循環(huán)時間[19]。Hu 等[20]將納米級的紅細(xì)胞膜包裹聚乳酸-羥基乙酸共聚物（Poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA），開發(fā)了一種新藥物遞送平臺。此平臺將紅細(xì)胞膜和聚合物載體的特點相融合，利用紅細(xì)胞膜表面的CD47 將藥物納米載體偽裝成“自我”而躲過了巨噬細(xì)胞的攝取和免疫系統(tǒng)的清除，有效延長了體內(nèi)循環(huán)的循環(huán)時間，并靶向至病變部分。Wang 等[21]通過從血液中分離出血小板膜并將其修飾于聚合物表面，構(gòu)建了一種全新的仿生載體。此載體表面修飾的血小板膜所保留的膜蛋白成分，可以有效地結(jié)合人類的膠原蛋白，并靶向孤立血管的損傷區(qū)域。Chen 等[22]報道了一種將癌細(xì)胞膜包覆于吲哚菁綠（ICG）聚合物核表面而組成的核-殼納米結(jié)構(gòu)（ICNPs）。此ICNPs 具有源癌細(xì)胞相似的細(xì)胞粘附分子，有利于源癌細(xì)胞攝取膜結(jié)合的腫瘤抗原進(jìn)行有效的呈遞和下游免疫的激活，而且可以通過同型結(jié)合機制，將ICNPs 精準(zhǔn)地靶向至源癌細(xì)胞，進(jìn)而實現(xiàn)更有效的治療效果。這種集天然細(xì)胞膜功能和納米載體功能于一體的納米載體在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中具有巨大的應(yīng)用潛力和發(fā)展前景[23-24]。

在前期仿生研究的基礎(chǔ)上，本研究將心肌細(xì)胞膜（采用H 表示）修飾在搭載miR-133a 的脂質(zhì)體（F1-5）納米顆粒R-133aF1-5LNPs（即F1陽離子載體在氮磷比（N/P）為5∶1 時吸附miR-133a 形成的納米顆粒）表面，構(gòu)建了兼具高遞送效率和低細(xì)胞毒性的仿生基因載體HR-133a@F1-5LNPs。通過仿生基因載體HR-133a@F1-5LNPs 將miR-133a 遞送至肥厚性心肌細(xì)胞中，靶向結(jié)合RhoA 3′UTR 抑制RhoA/ROCK 信號通路，抑制了細(xì)胞周期重啟和細(xì)胞骨架的重新排列，調(diào)控了心肌肥厚的病理過程，達(dá)到抑制心肌肥厚和發(fā)揮基因治療的目的[9-10,14]，為心肌肥厚治療提供了一種新思路。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

ZS90 型納米粒度電位儀（英國Malvern 公司）；Tecnai G2 F20 S-TWIN 型透射電子顯微鏡（工作電壓200 kV，美國FEI 公司）；UH-100B 型超聲波細(xì)胞破碎儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；Axio Observer 7全自動倒置熒光顯微鏡（德國ZEISS 公司）；Beckman Moflo-XDP 流式細(xì)胞儀（上海貝克曼庫爾特商貿(mào)有限公司）；TC-XP-D 博日基因擴增儀（杭州博日科技有限公司）；ABI 7500 實時熒光定量PCR 儀、NanoDroplite 分光光度計和EVOS M7000 型智能成像分析系統(tǒng)（美國Thermo Fisher 公司）；Multiskan FC型酶標(biāo)儀、蛋白電泳轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)和GeldocXR+凝膠成像系統(tǒng)（美國BioRad 公司）；Chemi Scope6200Touch化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）。

MiR-133a（安徽通用生物系統(tǒng)有限公司）；GAPDH、BNP 和RhoA 引物（生工生物工程（上海）有限公司）；1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿（1,2-Dioctadecanoyl-sn-glycero-3-phophocholine，DSPC）和膽固醇（Cholesterol，CHO）（艾偉拓（上海）醫(yī)藥科技有限公司）；1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000（1,2-Dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000，DMG-PEG（2000））和鬼筆環(huán)肽（美國Avanit 公司）；血管緊張素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ，AngⅡ，美國MCE 公司）；聚乙酰亞胺（Polyethyleneimine，PEI，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；磷酸鹽緩沖溶液（PBS，美國Corning 公司）；DAPI 溶液（即用型，北京索萊寶科技有限公司）。細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞漿蛋白提取試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；M5 Hiper Universal RNA Mini Kit 組織/細(xì)胞RNA 快速提取試劑盒和M5 Super plus qPCR RT kit with gDNA remover、2×M5 HiPer Realtime PCR Super mix with High Rox、M5 Hiper Cell Counting Kit（CCK）CCK-8 細(xì)胞增殖與活性檢測試劑盒（北京聚合美生物科技有限公司）；One-Step PAGE Gel Fast Preparation Kit（12%）試劑盒（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 脂質(zhì)納米粒(R-133a@FLNPs)的合成和篩選

分別稱取2 mg 陽離子脂質(zhì)分子F1、F2和F3（結(jié)構(gòu)見圖1）溶于1 mL 無水乙醇中（2 mg/mL），并按照推薦摩爾比[25]（陽離子脂質(zhì)∶DSPC∶膽固醇∶DMG-PEG（2000）=50∶10∶38.5∶1.5）加入DSPC、膽固醇和DMG-PEG，分別制備F1-LNPs、F2-LNPs 和F3-LNPs；隨后，用200 μL PBS 溶液溶解1 OD（1 OD=40 μg）miR-133a（200 ng/μL）。F-LNPs 與miR-133a 的合成比例用氮磷比（N/P）表示，按照N/P 比為2.5∶1、5∶1 和10∶1，將乙醇相中F1-LNPs、F2-LNPs 和F3-LNPs 分別快速注入miR-133a PBS 相中，反復(fù)吹打混勻后，室溫孵育30 min，制備成3 種不同N/P 比的基因載體R-133a@F1LNPs、R-133a@F2LNPs 和R-133a@F3LNPs，再采用PBS 溶液分別稀釋至終體積為1 mL，通過納米粒度電位儀檢測納米復(fù)合物的粒徑大小和表面電荷。

圖1 陽離子脂質(zhì)F1、F2 和F3 的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Structure diagram of cationic lipids F1,F2 and F3

為了評估R-133a@FLNPs 對核酸的濃縮能力，以陽離子載體的“金標(biāo)準(zhǔn)”PEI 作為對照。將按照不同N/P 比制備的一系列基因載體R-133a@FLNPs 稀釋至終體積為10 μL，室溫孵育30 min 后進(jìn)行瓊脂糖凝膠阻滯實驗。在電壓為100 V 條件下電泳30 min 后，在凝膠成像儀下觀察，比較不同N/P 比載體與miR-133a 的結(jié)合能力，篩選出3 種納米顆粒結(jié)合miR-133a 的最佳比例。

將對數(shù)生長期的HL1 心肌細(xì)胞以8×103/孔的密度接種于8 孔共聚焦小室中，置于37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞生長至60%～80%時，分別加入R-133a@F1LNPs、R-133a@F2LNPs 和R-133a@F3LNPs，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育12 h 后，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷PBS 洗滌2 次，去除多余載體，再向其中加入DAPI 染液，避光處理10 min，預(yù)冷PBS 洗滌3 次（每次5 min）。通過激光共聚焦顯微鏡觀察心肌細(xì)胞對不同組基因載體的攝取情況。Cy5 標(biāo)記的miR-133a 的吸收波長為650 nm，發(fā)射波長為670 nm。DAPI 的吸收波長為358 nm，發(fā)射波長為461 nm。

王樹林出了電梯，手機已然開啟。并沒有再次出現(xiàn)短信。他快步地朝小區(qū)大門而去，雨未停，空氣清涼。一路上思磨著那兩個問號的意義，猶豫著是否要回?fù)芤粋€電話。他和伍亦苒有過設(shè)定，他們的交往過程追尋的就是快樂。花堪折時直須折，莫待花落空折枝。任何一方?jīng)]有任何消息的時候一定有諸多不便，換句話說，另一方無須抱怨和勉強，他們都以不破壞現(xiàn)實狀態(tài)為最高出發(fā)點。

將HL1 心肌細(xì)胞接種于12 孔板中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞生長至60%～80%時，分別向其中加入R-133a@F1LNPs、R-133a@F2LNPs 和R-133a@F3LNPs，培養(yǎng)箱中孵育12 h 后，棄去培養(yǎng)基，經(jīng)胰酶消化處理并收集細(xì)胞懸液（2000 r/min，5 min）；用預(yù)冷PBS 洗滌2 次（1000 r/min，5 min）后，將其轉(zhuǎn)移至流式管中，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析；以未處理細(xì)胞為陰性對照，檢測Cy5 陽性細(xì)胞比例和熒光強度。

1.2.2 仿生基因載體(HR-133a@F1-5LNPs)的制備和表征

將處于對數(shù)生長期的HL1 心肌細(xì)胞接種于10 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中，過夜培養(yǎng)后收集細(xì)胞，并按照細(xì)胞膜提取試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）說明書的要求提取HL1 心肌細(xì)胞膜。首先用預(yù)冷PBS 洗滌3 次，將細(xì)胞用細(xì)胞刮分離后收集于15 mL 離心管中，2000 r/min 離心5 min，留取細(xì)胞沉淀。向細(xì)胞沉淀中加入PMSF 終濃度為1 mmol/L 的膜蛋白抽提試劑A，并輕輕混勻，置于冰上裂解15 min。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的玻璃研磨器，研磨30～50 次，收集裂解液；在4 ℃以2000 r/min 離心10 min，去除細(xì)胞核和未破碎的細(xì)胞。收集上清液，在4 ℃以14000 r/min 離心30 min，獲得的沉淀即為HL1 心肌細(xì)胞膜，于–80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將HL1 心肌細(xì)胞膜重懸于去離子水中，超聲破碎混勻。將上述懸液在0.22 μm 過濾器上重復(fù)過濾10 次，使細(xì)胞膜均勻覆蓋于濾器的濾網(wǎng)上；將篩選出的最佳基因載體R-133a@F1-5LNPs 在同一濾器上過膜擠壓10 次，使細(xì)胞膜均勻覆蓋在基因載體表面，獲得仿生納米載體HR-133a@F1-5LNPs。采用透射電子顯微鏡（TEM）和粒徑分析儀對HR-133a@F1-5LNPs 的粒徑和基本形貌進(jìn)行表征，并通過考馬斯亮藍(lán)染色評估HR-133a@F1-5LNPs 的膜包裹情況。

1.2.3 HR-133a@F1-5LNPs的生物安全性測定

將HL1 心肌細(xì)胞以5×103/孔的密度接種于96 孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。更換培養(yǎng)基后，加入不同濃度（0～100 μg/mL）的R-133a@F1-5LNPs、HR-133a@F1-5LNPs 和PEI，繼續(xù)恒溫培養(yǎng)24 h。更換新鮮培養(yǎng)基后，加入CCK-8 試劑，于37 ℃避光孵育30 min，采用酶標(biāo)儀讀取450 nm 處的吸光度，通過公式（1）計算細(xì)胞存活率（Cell viability，CV）。其中，As為加入陽離子基因載體的實驗組吸光度，Ac為未加入陽離子基因載體的對照組吸光度，Ab為不含細(xì)胞的培養(yǎng)基空白對照組的吸光度。

體外溶血實驗也是評估基因載體的生物相容性的重要指標(biāo)之一。取2 mL C57BL/6J 小鼠外周血于EDTA 抗凝管中，分離血細(xì)胞重懸于PBS 中，加入濃度為25 μg/mL、N/P 比為5∶1 的R-133a@F1-5LNPs、HR-133a@F1-5LNPs 和PEI 重懸血紅細(xì)胞，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別孵育12 和24 h。以PBS 處理為陰性對照，去離子水處理為陽性對照，采用分光光度計測定不同實驗組樣品在545 nm 處的吸光度，通過公式（2）計算紅細(xì)胞的溶血率（Hemolysis ratio,%）。將處理后的紅細(xì)胞分散在載玻片上，在顯微鏡下直接觀察紅細(xì)胞的形態(tài)，評估紅細(xì)胞的結(jié)構(gòu)完整性。

1.2.4 體外心肌肥厚模型的建立及HR-133a@F1-5LNPs體外靶向性分析

通過AngⅡ刺激HL1 心肌細(xì)胞，模擬長期高血壓引起的心臟超負(fù)荷導(dǎo)致的心臟代償性肥厚，建立心肌肥厚的細(xì)胞模型[26]。采用體外評估心肌細(xì)胞相關(guān)肥厚基因（B-Type natriuretic peptide，BNP）和HL1心肌細(xì)胞體積變化情況驗證建模是否成功。將處于對數(shù)期的HL1 心肌細(xì)胞以2×105/孔的密度接種于6 孔板中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。更換無血清的MEM 培養(yǎng)基后，分別向其中加入不同濃度（1×10–5mol/L、1×10–6mol/L、1×10–7mol/L 和1×10–8mol/L）的AngⅡ培養(yǎng)液刺激處理48 h，測定誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的最佳藥物處理濃度。

采用M5 Universal RNA Mini Kit 試劑盒提取不同濃度組HL1 心肌細(xì)胞的總RNA，采用NanoDroplite紫外分光光度計測定RNA 的濃度。參照HiScriptIII RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，逆轉(zhuǎn)錄后將cDNA 置于–20 ℃保存?zhèn)溆?。qPCR 反應(yīng)擴增體系根據(jù)ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 說明書在冰上進(jìn)行配制。qPCR 數(shù)據(jù)分析時，選擇GAPDH 作為內(nèi)參基因，采用2–ΔΔCt法計算不同濃度AngⅡ刺激的HL1 心肌細(xì)胞的BNP 相對表達(dá)量。引物序列：GAPDH Forward primer（5′-3′）∶GGTTGTCTCCTGCGACTTCA;GAPDH Reverse primer（3′-5′）∶TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC;BNP Forward primer（5′-3′）∶AAGAGAAAAGTCGGAGGAAATGG;BNP Reverse primer（3′-5′）∶TACAACAACTTCAGTGCGTTACAGC。

將處于對數(shù)生長期的HL1 心肌細(xì)胞接種于共聚焦小皿中，AngⅡ（1×10–7mol/L）刺激處理48 h，建立心肌肥厚的細(xì)胞模型。待心肌肥厚模型建立后，向每孔加入500 μL 4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞10 min，PBS 洗滌3 次，棄去溶液。向每孔加入200 μL 37 ℃預(yù)熱的鬼筆環(huán)肽染液，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)30 min。棄去染液后，以PBS 溶液洗滌3 次，加入DAPI 溶液（即用型）染色5 min，再經(jīng)PBS溶液洗滌后，以激光共聚焦顯微鏡觀察心肌細(xì)胞HL1 細(xì)胞形態(tài)，隨機選取5 個視野進(jìn)行拍照，每個視野隨機選取10 個細(xì)胞，采用Image J 軟件計算心肌細(xì)胞表面積，取平均值，每組重復(fù)測量3 次。

將HL1 心肌細(xì)胞接種于共聚焦小皿中，AngⅡ（1×10–7mol/L）刺激處理48 h，建立心肌肥厚的細(xì)胞模型。分別加入R-133a@F1-5LNPs、HR-133a@F1-5LNPs 和PEI/miR-133a 溶液處理12 h，棄去培養(yǎng)基，PBS 溶液清洗2 次，加入DAPI 染色5 min，PBS 洗滌3 次，每次5 min，在共聚焦顯微鏡下觀察肥厚性心肌細(xì)胞對HR-133a@F1-5LNPs 的攝取情況。

1.2.5 HR-133a@F1-5LNPs體外對心肌肥厚治療效果評價

為了驗證HR-133a@F1-5LNPs 是否將miR-133a 遞送至細(xì)胞中，將HL1 心肌細(xì)胞接種于6 孔板中，AngⅡ（1×10–7mol/L）刺激處理48 h，建立心肌肥厚的細(xì)胞模型。更換培養(yǎng)基，以PBS 處理組為對照，分別加入R-133a@F1-5LNPs 和HR-133a@F1-5LNPs，繼續(xù)培養(yǎng)12 和24 h。采用qPCR 測定HL1 心肌細(xì)胞中RhoA 基因的表達(dá)水平。引物序列：RhoA Forward primer（5′-3′）∶GTTGGTGATGGAGCTTGTGG;RhoA Reverse primer（3′-5′）∶CAGCTGTGTCCCATAAAGCC

將處于對數(shù)生長期的HL1 心肌細(xì)胞接種于6 孔板內(nèi)，AngⅡ刺激HL1 心肌細(xì)胞，建立心肌的細(xì)胞肥厚模型。向其中分別加入PBS、R-133a@F1-5LNPs、HR-133a@F1-5LNPs 和PEI 繼續(xù)培養(yǎng)48 h。提取各處理組細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，并通過BCA 蛋白定量試劑盒測定各樣本的蛋白濃度。采用One-Step PAGE Gel Fast Preparation Kit（12%）試劑盒制備12%蛋白電泳膠，電泳槽中加入Running buffer 電泳緩沖液，每孔按相同蛋白量上樣，80 V 恒壓電泳25 min，隨后調(diào)整電壓為150 V 電泳1 h。隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗、洗滌、孵育二抗和洗滌，加入發(fā)光液后，置于化學(xué)發(fā)光成像分析儀進(jìn)行成像，檢測HL1 心肌細(xì)胞中的RhoA 的蛋白水平表達(dá)。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Graphpad Prism 軟件對其分析，組間兩兩比較采用Student′s t檢驗，當(dāng)p＜0.05 時，認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 脂質(zhì)納米粒(R-133a@FLNPs)的合成和篩選

如圖2A 所示，N/P 比分別為2.5∶1、5∶1 和10∶1 的R-133a@F1LNPs、R-133a@F2LNPs 和R-133a@F3LNPs 納米復(fù)合物的粒徑隨著N/P 比增大而逐漸減小，主要分布于70～300 nm 范圍內(nèi)。相較于其它組別，N/P 比為10∶1 時各組的粒徑最小。表面Zeta 電位大約在25～40 mV 之間，隨著N/P 比值增加，電荷增大（圖2B）。這是由于陽離子表面帶正電荷，可以通過靜電作用將核酸縮合成尺寸更小的納米顆粒[27]。通過瓊脂糖凝膠阻滯實驗檢測陽離子載體F-LNPs 結(jié)合miR-133a 的能力（圖2C)，合成的R-133a@F1LNPs、R-133a@F2LNPs 和R-133a@F3LNPs 由于分子量變大而被阻滯在泳道口，而未被結(jié)合的miR-133a 會隨著電泳向正極移動，當(dāng)miR-133a 完全結(jié)合時，相應(yīng)的下端條帶消失。R-133a@F1LNPs 在N/P 比為5∶1 時可完全結(jié)合miR-133a，而PEI、R-133a@F2LNPs 和R-133a@F3LNPs 在N/P 比為10∶1 時才可完全結(jié)合miR-133a。

圖2 （A）不同氮磷（N/P）比的R-133a@F1LNPs、R-133a@F2LNPs、R-133a@F3LNPs 和PEI/miR-133a 的粒徑變化圖；（B）不同N/P 比的R-133a@F1LNPs、R-133a@F2LNPs、R-133a@F3LNPs 和PEI/miR-133a的電荷變化圖；（C）凝膠阻滯分析不同N/P 比的F1-LNPS、F2-LNPS、F3-LNPS 以及PEI 對miR-133a 的結(jié)合能力Fig.2 (A) Particle size variation of R-133a@F1LNPs,R-133a@F2LNPs,R-133a@F3LNPs,and PEI/miR-133a at different ratios of nitrogen to phosphorus (N/P);(B) Variations in charges of R-133a@F1LNPs,R-133a@F2 LNPs,R-133a@F3LNPs,and PEI/miR-133a at different N/P ratios;(C) Gel retardation analysis of the binding ability of F1-LNPS,F2-LNPS,F3-LNPS and PEI with miR-133a at different N/P ratios

為了篩選出遞送miR-133a 進(jìn)入HL1 心肌細(xì)胞的最佳陽離子載體，以流式細(xì)胞術(shù)和共聚焦顯微鏡進(jìn)行體外測定。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果（圖3A）顯示，采用R-133a@F1LNPs、R-133a@F2LNPs、R-133a@F3LNPs 和PEI/miR-133a 分別處理HL1 心肌細(xì)胞后，隨著N/P 比增加，Cy5（Cy5 標(biāo)記miR-133a）陽性細(xì)胞比例呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，這可能是因為在N/P 比為2.5∶1 條件下制備的3 種聚陽離子載體對核酸的結(jié)合能力較差，形成的納米顆粒尺寸較大，不利于細(xì)胞的內(nèi)吞；當(dāng)N/P 比為10∶1 時，雖然納米顆粒對核酸的濃縮能力變強，但在較高N/P 比下，基因載體的表面電荷增高，導(dǎo)致細(xì)胞毒性增加。如圖3B 和3C 所示，在N/P 比為5∶1 時，R-133a@F1-5LNPs 處理組的熒光強度和Cy5 陽性細(xì)胞比例（92.3%）遠(yuǎn)高于其它處理組，而對照PEI 處理組的熒光強度和Cy5 陽性細(xì)胞比例最低，僅為20.9%。共聚焦熒光顯微鏡的檢測結(jié)果（圖3D）顯示，相較于其它處理組，R-133a@F1-5LNPS處理組的Cy5 紅色熒光信號最強，PEI 處理組的熒光信號最弱。

圖3 （A）不同N/P 比的R-133a@F1LNPs、R-133a@F2LNPs、R-133a@F3LNPs 和PEI/miR-133a 在HL1心肌細(xì)胞中的內(nèi)化情況；（B）N/P 比為5∶1 時，HL1 心肌細(xì)胞對R-133a@F1-5LNPs、R-133a@F2-5LNPs、R-133a@F3-5LNPs 和PEI/miR-133a 攝取的平均熒光強度；（C）N/P 比為5∶1 時，R-133a@F1-5LNPs、R-133a@F2-5LNPs、R-133a@F3-5LNPs、PEI/miR-133a 在HL1 心肌細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率；（D）在熒光顯微鏡下觀察HL1 細(xì)胞對R-133a@F1-5LNPs、R-133a@F2-5LNPs、R-133a@F3-5LNPs 和PEI/miR-133a 的攝入情況Fig.3 (A) Internalization of different N/P ratios of R-133a@F1LNPs,R-133a@F2LNPs,R-133a@F3LNPs and PEI/miR-133a in HL1 cardiomyocytes;(B) Average fluorescence intensity of R-133a@F1-5LNPs,R-133a@F2-5 LNPs,R-133a@F3-5LNPS and PEI/miR-133a uptake by HL1 cardiomyocytes at N/P ratio of 5∶1;(C)Transfection efficiency of R-133a@F1-5LNPs,R-133a@F2-5LNPs,R-133a@F3-5LNPs and PEI/miR-133a in HL1 cardiomyocytes at N/P ratio of 5∶1;(D)Observation of uptake of R-133a@F1-5LNPs,R-133a@F2-5LNPs,R-133a@F3-5LNPs and PEI/miR-133a by HL1 cells under fluorescent microscopy

綜上，在N/P 比為5∶1 時，R-133a@F1-5LNPs 納米復(fù)合物細(xì)胞遞送性能最佳，可作為心肌肥厚基因治療的最佳基因遞送載體。

2.2 仿生基因載體(HR-133a@F1-5LNPs)的制備和表征

采用心肌細(xì)胞膜包裹篩選出的最佳聚陽離子載體R-133a@F1-5LNPs 并制備成仿生納米載體HR-133a@F1-5LNPs。透射電子顯微鏡結(jié)果表明，R-133a@F1-5LNPs 呈球形，粒徑約為70 nm，水合粒徑結(jié)果顯示其分布較集中，平均粒徑為（71±1）nm；外層修飾HL1 心肌細(xì)胞膜的HR-133a@F1-5LNPs 納米顆粒也呈球形，并可觀測到一層膜結(jié)構(gòu)包覆于表面，其粒徑約為90 nm；水合粒徑結(jié)果表明，HR-133a@F1-5LNPs 粒徑分布較集中，平均粒徑為（90±1）nm（圖4A）。為了進(jìn)一步驗證HL1 心肌細(xì)胞膜已包覆于基因載體表面，通過考馬斯亮藍(lán)實驗測定HR-133a@F1-5LNPs 表面細(xì)胞膜蛋白水平。由圖4B 可見，HR-133a@F1-5LNPs 與HL1 心肌細(xì)胞膜的膜蛋白表達(dá)基本一致，而R-133a@F1-5LNPs 組未檢出蛋白。上述結(jié)果表明，HL1 心肌細(xì)胞膜已修飾在R-133a@F1-5LNPs 載體表面，即制備得到了仿生納米載體HR-133a@F1-5LNPs。

圖4 （A）R-133a@F1-5LNPs 和HR-133a@F1-5LNPs 的粒徑分布和透射電鏡形貌圖；（B）R-133a@F1-5 LNPs、HR-133a@F1-5LNPs 和HL1 心肌細(xì)胞膜考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果Fig.4 (A) Particle size distribution and transmission electron microscopy (TEM) morphology images of R-133a@F1-5LNPs and HR-133a@F1-5LNPs;(B) Results of Coomassie Brilliant Blue staining of R-133a@F1-5 LNPs,HR-133a@F1-5LNPs and HL1 cardiomyocytes membrane

2.3 HR-133a@F1-5LNPs的生物安全性測定

采用CCK-8 實驗評估不同濃度（0～100 μg/mL）HR-133a@F1-5LNPs 體外細(xì)胞水平的生物安全性。如圖5A 所示，隨著濃度增高，R-133a@F1-5LNPs 和HR-133a@F1-5LNPs 處理組的HL1 心肌細(xì)胞的存活率略有下降，但仍大于90%。修飾HL1 心肌細(xì)胞膜的仿生載體HR-133a@F1-5LNPs 處理組細(xì)胞的存活率略高于R-133a@F1-5LNPs，并且兩組均顯著高于PEI/miR-133a 處理組的HL1 心肌細(xì)胞的存活率。采用25 μg/mL 的R-133a@F1-5LNPs、R-133a@HF1-5LNPs 和PEI/miR-133a 評估溶血率（圖5B），PEI/miR-133a處理紅細(xì)胞12 h 后，溶血率為25.4%；處理24 h 后，溶血現(xiàn)象更明顯，溶血率可達(dá)52.3%，遠(yuǎn)高于生物材料允許的最大溶血率（5%）[28]。R-133a@F1-5LNPs 和HR-133a@F1-5LNPs 對紅細(xì)胞產(chǎn)生的影響很小，處理24 h 后溶血率仍較低。同時，紅細(xì)胞的形態(tài)也可被用于評估納米顆粒溶血的發(fā)生情況。與PBS 處理組相比，PEI/miR-133a 處理組紅細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了明顯改變，而R-133a@F1-5LNPs 和HR-133a@F1-5LNPs 處理組紅細(xì)胞的形態(tài)與PBS 處理組幾乎沒有差異（圖5C），因此，相比于PEI 組，R-133a@F1-5LNPs 組細(xì)胞毒性低，尤其是細(xì)胞膜修飾后，基因載體的生物安全性明顯提高。

圖5 （A）不同濃度的R-133a@F1-5LNPs、HR-133a@F1-5LNPs 和PEI/miR-133a 對HL1 心肌細(xì)胞的毒性作用；（B）25 μg/mL R-133a@F1-5LNPs、HR-133a@F1-5LNPs 和PEI/miR-133a 分別處理紅細(xì)胞12 和24 h后，紅細(xì)胞的溶血率變化；（C）25 μg/mL R-133a@F1-5LNPs、HR-133a@F1-5LNPs 和PEI/miR-133a 處理紅細(xì)胞24 h 后紅細(xì)胞形態(tài)Fig.5 (A)Cytotoxic effects of different concentrations of R-133a@F1-5LNPs,HR-133a@F1-5LNPs and PEI/miR-133a on HL1 cardiomyocytes;(B) Changes in hemolysis rate of red blood cells after treatment with 25 μg/mL R-133a@F1-5LNPs,HR-133a@F1-5LNPs and PEI/miR-133a for 12 h and 24 h,respectively;(C) Morphology of red blood cells after treatment with 25 μg/mL R-133a@F1-5LNPs,HR-133a@F1-5LNPs,PEI/miR-133a for 24 h,respectively

2.4 HR-133a@F1-5LNPs體外靶向性分析

采用不同濃度（1×10–5mol/L、1×10–6mol/L、1×10–7mol/L、1×10–8mol/L）的AngⅡ刺激HL1 心肌細(xì)胞48 h，探索誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的最佳藥物濃度。qPCR 結(jié)果（圖6A）顯示，與對照組相比，不同濃度的AngⅡ刺激HL1 心肌細(xì)胞內(nèi)的BNP 相對表達(dá)量均上調(diào)，其中，1×10–7mol/L AngⅡ組BNP 表達(dá)水平最高，差距具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.01），表明1×10–7mol/L 可能是誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大模型的AngⅡ最佳濃度。通過鬼筆環(huán)肽染色HL1 心肌細(xì)胞骨架觀察其形態(tài)改變（圖6B），與對照組相比，AngⅡ誘導(dǎo)HL1 心肌細(xì)胞的細(xì)胞面積顯著增大，進(jìn)一步通過軟件Image J 測量細(xì)胞面積（圖6C），也顯示兩者之間有顯著差異（p＜0.05）。

圖6 （A）使用不同濃度AngⅡ刺激HL1 48 h 肥厚基因B 型利鈉肽（BNP）的表達(dá)情況；（B）鬼筆環(huán)肽染色觀察細(xì)胞形態(tài)改變；（C）使用Image J 軟件對細(xì)胞面積進(jìn)行統(tǒng)計分析結(jié)果，n=3，**p＜0.01 vs Control；（D）肥厚性HL1 心肌細(xì)胞對R-133a@F1-5LNPs 和HR-133a@F1-5LNPs 的攝取情況Fig.6 (A)Expression of hypertrophy gene(B-Type natriuretic peptide,BNP)in HL1 cardiomyocytes after 48-h stimulation with different concentrations of AngⅡ;(B) Observation of cell morphology changes by Griffonia simplicifolia lectin staining;(C)Statistical analysis of cell area using Image J software,n=3,**p＜0.01 vs Control;(D) Uptake of R-133a@F1-5LNPs and HR-133a@F1-5LNPs by hypertrophic HL1 cardiomyocytes

通過觀察肥厚性HL1 心肌細(xì)胞中的熒光信號，評估細(xì)胞對R-133a@F1-5LNPs 和HR-133a@F1-5LNPs的攝取。miR-133a 攜帶Cy5 熒光，在646 nm 左右的激發(fā)光下可以發(fā)出紅色熒光，包裹了心肌細(xì)胞膜的納米顆粒HR-133a@F1-5LNPs 處理組中的紅色熒光顯著高于未包膜材料組（圖6D），說明包裹HL1 心肌細(xì)胞膜后提高了HR-133a@F1-5LNPs 的靶向能力，體外實驗驗證了HR-133a@F1-5LNPs 具有更好的轉(zhuǎn)染能力，可以更好地協(xié)助納米顆粒進(jìn)入細(xì)胞中。

2.5 HR-133a@F1-5LNPs的體外心肌肥厚治療效果評價

為了驗證HR-133a@F1-5LNPs 能否將miR-133a 遞送至心肌細(xì)胞中并發(fā)揮作用，采用qPCR 測定心肌肥厚相關(guān)基因的mRNA 的表達(dá)水平。結(jié)果如圖7A 所示，與PBS 對照組相比，HR-133a@F1-5LNPs 和R-133a@F1-5LNPs 處理組的RhoA mRNA 水平明顯降低，相較于R-133a@F1-5LNPs 處理組，HR-133a@F1-5LNPs處理組表達(dá)水平更低。這表明HR-1 33a@F1-5LNPs 可將miR-133a 遞送至心肌細(xì)胞中，并抑制了RhoA 的表達(dá)。

圖7 （A）qPCR 檢測HL1 心肌細(xì)胞經(jīng)R-133a@F1-5LNPs 和HR-133a@F1-5LNPs 處理12 h 和24 h 后RhoA mRNA 的表達(dá)水平；（B）Western blot 檢測HL1 心肌細(xì)胞經(jīng)R-133a@F1-5LNPs、HR-133a@F1-5LNPs 和PEI/miR-133a 處理24 h 后RhoA 和蛋白表達(dá)水平（1：PBS，2：AngⅡ，3:AngⅡ+R-133a@F1-5LNPs，4: AngⅡ+HR-133a@F1-5LNPs，5：AngⅡ+PEI/miR-133a）Fig.7 (A)Detection of RhoA mRNA expression in HL1 cardiomyocytes after treatment with R-133a@F1-5LNPs and HR-133a@F1-5LNPs for 12 h and 24 h by qPCR;(B) Detection of RhoA protein expression levels in HL1 cardiomyocytes after treatment with R-133a@F1-5LNPs and HR-133a@F1-5LNPs for 24 h by Western blot

采用Western blot 方法檢測了心肌肥厚細(xì)胞模型HL1 心肌細(xì)胞分別經(jīng)R-133a@F1-5LNPs、HR-133a@F1-5LNPs 和PEI/miR133a 處理后RhoA 的蛋白表達(dá)水平（圖7B）。與正常HL1 心肌細(xì)胞相比，在肥厚性的HL1 心肌細(xì)胞中RhoA 蛋白的表達(dá)明顯增高，而R-133a@F1-5LNPs 和HR-133a@F1-5LNPs 處理組的心肌細(xì)胞中RhoA 蛋白的表達(dá)顯著下降，基本恢復(fù)至正常水平；PEI/miR133a 處理組的RhoA 蛋白表達(dá)水平相較肥厚組細(xì)胞有所降低，但仍顯著高于對照組。此結(jié)果表明，HR-133a@F1-5LNPs 可將miR-133a遞送至HL1 心肌細(xì)胞內(nèi)，抑制RhoA 蛋白的表達(dá)，具有誘導(dǎo)細(xì)胞結(jié)構(gòu)重排的潛力，從而實現(xiàn)治療心肌肥厚的目的。

3 結(jié)論

基于“模仿自然”和陽離子載體遞送的優(yōu)勢，本研究采用心肌細(xì)胞膜修飾的方法制備了一種新型仿生陽離子基因遞送載體HR-133a@F1-5LNPs，既保留了心肌細(xì)胞膜的同源靶向特性，又具備陽離子載體充分包裹miR-133a 和促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)化的雙重效應(yīng)。在體外實驗中，此載體能夠特異性地將miR-133a 靶向遞送至心肌細(xì)胞，表現(xiàn)出優(yōu)異的遞送效率，通過靶向結(jié)合RhoA 3′UTR 抑制RhoA/ROCK 信號通路，從而抑制了心肌細(xì)胞的重排和纖維化。此新型仿生遞送系統(tǒng)改善了由壓力超負(fù)荷而引起的心肌肥厚，為心肌肥厚的治療提供了一種新的思路。